“三法三穴”推拿手法干預早期對MinoCCI模型大鼠脊髓背角IL-17A/RA、C/EBPβ信號通路影響的研究

陳金平 劉志鳳 于天源 王厚融 張英琦 楊震杰 薩出拉 官乾 徐亞靜 張潤龍 張漢鈺 劉家玥 孫佳偉

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是由于軀體感覺系統(tǒng)病變或者疾病導致的疼痛[1-2],其發(fā)病機制復雜,治療效果欠佳,根據(jù)損傷部位可分為周圍型神經(jīng)病理性疼痛(peripherally-induced neuropathic pain,pNP)與中樞型神經(jīng)病理性疼痛,其中pNP臨床發(fā)病率較高[3]。脊髓背角作為第二級神經(jīng)元,在pNP后對痛覺、溫度覺信息的傳導以及最終形成痛覺的過程中發(fā)揮著極其重要的作用[4]。

推拿在pNP臨床治療中效果確切。課題組前期通過RNA-seq技術(shù)探究推拿鎮(zhèn)痛相關(guān)機制,發(fā)現(xiàn)推拿長期及早期鎮(zhèn)痛可能與白介素-17(interleukin-17)信號通路關(guān)系密切[5-6],pNP可引起IL-17信號表達異常。因此,對該通路中的關(guān)鍵指標白介素-17A(interleukin 17A,IL-17A)、白介素-17A受體(interleukin-17A receptor, IL-17RA)與轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白β(transcription factor CCAAT/enhancer binding protein β, C/EBPβ)進行研究。本研究建立輕度坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(Minor chronic compression injury of sciatic nerve, Minor CCI)模型大鼠,通過機械縮足反射閾值(paw mechanical withdraw threshold,PMWT)與冷敏閾值(cold sensitivity threshold, CST)觀察干預1次后大鼠痛、溫覺的恢復情況,并通過蛋白免疫印跡法(western bolt, WB)檢測L4～6脊髓背角中IL-17A與C/BEPβ表達,通過熒光定量聚合酶鏈式反應(real time-polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測IL-17A/RA與C/BEPβmRNA表達,對推拿早期鎮(zhèn)痛啟動機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量(200±10)g,購買于斯貝福(北京)生物科技有限公司,許可證號SCXK(京)2019-0010,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2020-0033],3只/籠,環(huán)境溫度為(25±1)℃,相對濕度(50±5)%,晝夜節(jié)律,大鼠自由進食,每周更換墊料2次。實驗程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學動物使用和管理委員會批準(BUCM-4-2022082601-3039),符合動物福利與倫理原則。

適應性飼養(yǎng)1周后,通過電子測痛儀(BIO-EVF5)篩選痛閾值均一的大鼠,并通過隨機數(shù)字法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組和推拿組,每組8只。

1.2 主要儀器與試劑

儀器:按摩推拿手法模擬儀(專利號200710187403.1),VonFrey電子測痛儀(BIO-EVF5,生產(chǎn)廠家BIOSEB),小動物氣體麻醉機(美國SurgiVet公司),電泳儀(美國BIO-RAD公司),MultiSkan3酶標儀(美國Thermo公司),電動組織勻漿器(美國FLUKA公司),Spectra Max Quick Drop型超微量分光光度計(上海美谷分子儀器有限公司),AG 22331 Hamburg PCR擴增儀(德國Eppendorf公司),CFX96TM Optics Module實時熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

試劑:兔用IL-17A抗體(生產(chǎn)批號:BA11232558)、兔用C/EBPβ抗體(生產(chǎn)批號:AG06299152),彩虹預染蛋白marker(生產(chǎn)批號:BB10198356),以上試劑均訂購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司;高效組織裂解液(生產(chǎn)批號:20221020),BSA標準品(生產(chǎn)批號:20221009),5×蛋白上樣緩沖液(生產(chǎn)批號:20221110),以上試劑均訂購于北京索萊寶科技有限公司;RNA提取試劑盒(廣州美基生物科技有限公司,生產(chǎn)批號:RLB23-01),cDNA第一鏈合成試劑盒(美國Thermo公司,生產(chǎn)批號:01157375)。

1.3 造模及干預方法

1.3.1 造模 根據(jù)課題組前期研究成果進行造模[7],造模前12小時禁食、禁水,模型組與推拿組制備Minor CCI模型大鼠模擬臨床pNP。模型組、推拿組造模方法:使用異氟烷對大鼠進行氣體麻醉,待大鼠完全麻醉后,將大鼠取出并按俯臥位固定在鼠板上,將右側(cè)髖股交界區(qū)剃毛、消毒;沿坐骨神經(jīng)體表投影區(qū)切1 cm切口,鈍性分離,暴露坐骨神經(jīng);在坐骨神經(jīng)游離處7 mm用鉻制4-0可吸收性外科縫線結(jié)扎,結(jié)扎度不可過緊,避免影響神經(jīng)外膜血流,結(jié)扎完成后對組織逐層縫合,滴入適量消炎藥與生理鹽水,避免術(shù)后傷口感染。假手術(shù)組造模:只剝離暴露出坐骨神經(jīng),不進行結(jié)扎,其余步驟同模型組與推拿組。

1.3.2 干預方法 術(shù)后7天開始干預,干預前需適應環(huán)境30分鐘,待大鼠安靜后開始干預,干預期間保持安靜。假手術(shù)組與模型組:將大鼠仰臥位束縛于鼠板上束縛9分鐘。推拿組:使用按摩推拿手法模擬儀依次對患側(cè)殷門穴、承山穴、陽陵泉穴分別實行點、撥、揉法[8],每穴1分鐘/法,參數(shù)設置:力度10 N,頻率60次/分鐘。

1.3.3 行為學檢測 分別于造模前、干預前1天以及干預后即刻進行機械刺激及冷板實驗的行為學檢測。

1.3.4 PMWT 通過PWMT對大鼠痛覺敏化程度進行評價。提前20分鐘將大鼠放置于箱底部放置網(wǎng)格鐵絲網(wǎng)透明玻璃箱內(nèi),待其停止探索活動后,使用VonFrey電子機械測痛儀,將刺激探頭對準大鼠足底部進行刺激,逐步增加刺激量,每次刺激間隔時長不低于10分鐘,當大鼠出現(xiàn)縮足、舔足時記錄數(shù)值。

1.3.5 CST 通過CST對大鼠溫度覺敏化程度進行評價。將大鼠放置于表面溫度為(4±1)℃的冷板上適應5分鐘,上方罩一有機玻璃罩限制其活動范圍,待大鼠停止探尋活動后,記錄其5分鐘內(nèi)縮足、舔足的次數(shù)。大鼠活動及體位變化引起的抬足不記入。

1.4 取材及指標檢測

1.4.1 取材 干預完成,行為學測試完畢后,每組隨機選取6只大鼠,使用濃度為10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)對大鼠進行腹腔注射麻醉,取L4～L6節(jié)段脊髓背角。

1.4.2 WB檢測脊髓背角中IL-17A、C/EBPβ的蛋白表達 取適量脊髓背角組織放于EP管中,并加入組織裂解混合液(PMSF∶RIPA=1∶100;樣本重量:組織裂解液=1∶10),將EP管置于冰上,將脊髓組織研磨至肉眼不可見,每次震蕩10分鐘,共4次?；旌弦?℃、12 000 r/min離心20分鐘,吸取上清液,避免吸到沉淀。37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育25分鐘,酶標儀檢測吸光度并計算樣本上樣量,加5×蛋白上樣緩沖液并混勻,95℃變性5分鐘。

配12%的分離膠及5%的濃縮膠,上樣后穩(wěn)定電泳分離膠60V、20分鐘;分離膠80V、90分鐘?？燹D(zhuǎn)400 mA、25分鐘,快速封閉液封閉20分鐘。根據(jù)marker裁膜,一抗(IL-17A 1∶1 000,C/EBPβ 1∶1 000,β-actin 1∶5 000)室溫搖床1小時后,4攝氏度過夜。1×PBST洗膜3次,二抗(辣根酶山羊抗兔Ig G1∶10 000)搖床1小時,顯影液均勻滴在膜上后進行顯影。

1.4.3 RT-PCR檢測脊髓背角中IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA表達 在超凈臺環(huán)境中取適量脊髓背角組織,用組織細胞RNA提取盒對組織RNA進行提取后,使用cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行擴增。引物序列號:GAPDH上游引物:ATGACTCTACCCACGGCAAG,下游引物:TACTCAGCACCAGCATCACC;IL-17A上游引物:TGCCTGATGCTGTTGCTGCTAC,下游引物:GCGTTTGGACACACTGAACTTTGAG;C/EBPβ上游引物:GCTGAGCGACGAGTACAAGATGC,C/EBPβ下游引物:CTTGTGCTGCGTCTCCAGGTTG;IL-17RA上游引物:CCATAACAGCCGCAGACTATATTCC,下游引物:GCAGATAATCAGCAGGATGACAGAG。擴增完成后根據(jù)2-△△Ct法計算相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠PMWT結(jié)果

PMWT基線:假手術(shù)組、模型組與推拿組相比,無顯著性差異(P>0.05);干預前:模型組、推拿組低于假手術(shù)組(P<0.01),模型組與推拿組無顯著性差異(P>0.05);干預后:模型組與推拿組低于假手術(shù)組(P<0.01),推拿組高于模型組(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠PMWT結(jié)果

2.2 各組大鼠CST結(jié)果

CST基線:模型組、推拿組與假手術(shù)相比,無統(tǒng)計學差異(P>0.05);干預前:模型組高于假手術(shù)組(P<0.01),推拿組高于假手術(shù)組(P<0.05);干預后:模型組高于假手術(shù)組(P<0.01),推拿組與假手術(shù)組無顯著差異(P>0.05),模型組高于推拿組(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠冷板實驗抬足次數(shù)結(jié)果次)

2.3 各組大鼠IL-17A、C/EBPβ蛋白表達量比較

IL-17A:干預后,模型組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.05),推拿組與假手術(shù)組無顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

C/EBPβ:干預后,模型組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.05),推拿組與假手術(shù)組無顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。見表3、圖3。

注:J為假手術(shù)組,M為模型組,T為推拿組。

表3 各組大鼠IL-17A、C/EBPβ蛋白表達量

2.4 各組大鼠IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA表達比較

IL-17A mRNA:干預后,模型組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.01),推拿組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

IL-17RA mRNA:干預后,模型組高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.01),推拿組與假手術(shù)組無顯著性差異(P>0.05),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。

C/EBPβ mRNA:干預后,模型組、推拿組均高于假手術(shù)組,有顯著性差異(P<0.01),模型組高于推拿組,有顯著性差異(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ的mRNA結(jié)果

3 討論

前期實驗證明,“三法三穴”推拿手法干預后可有效恢復大鼠超微結(jié)構(gòu),改善自發(fā)性疼痛、提高痛閾及溫度覺的恢復等[9-12],但尚不清楚推拿如何啟動鎮(zhèn)痛。本實驗根據(jù)前期實驗結(jié)果[5-6],驗證IL-17A/IL-17RA/C/EBPβ信號通路在干預1次后即刻的鎮(zhèn)痛作用及其啟動鎮(zhèn)痛的相關(guān)機制。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn),推拿干預1次后可抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ mRNA在脊髓背角的表達(P<0.05);同時也可抑制IL-17A、C/EBPβ蛋白在脊髓背角的表達(P<0.05),發(fā)揮即刻鎮(zhèn)痛作用。

3.1 Minor CCI模型適合模擬pNP的早期研究

Minor CCI模型模擬臨床pNP,適合短期研究設計。前期研究證實,相較于經(jīng)典CCI模型,Minor CCI與經(jīng)典CCI模型在機械縮足痛閾趨勢保持一致,且模型更加穩(wěn)定,自殘現(xiàn)象更少[7]。而經(jīng)典CCI模型則會出現(xiàn)不同程度的自殘現(xiàn)象,同時還會產(chǎn)生異常的熱性痛覺亢進,但熱性痛覺過敏并不是臨床中NP的表現(xiàn)之一[13]。因此選擇Minor CCI模型作為本次實驗研究對象,能避免因模型損傷過重,在早期研究中出現(xiàn)效果不明顯的情況,同時本實驗根據(jù)臨床患者出現(xiàn)疼痛以及怕冷的臨床表現(xiàn)[14],對機械痛覺以及對冷敏化程度進行研究。

根據(jù)行為學結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),造模后,模型組與推拿組的痛閾值明顯低于假手術(shù)組(P<0.01),表現(xiàn)經(jīng)典,提示造模成功。而在“三法三穴”推拿手法干預1次后,推拿組較模型組在PMWT以及CST可出現(xiàn)較為明顯的改善(P<0.01)。比較有趣的一點是推拿組相較于假手術(shù)組的CST無顯著性差異(P>0.05),與PMWT相比,CST數(shù)據(jù)較不穩(wěn)定,樣本之間差異較大。針對該結(jié)果,主要考慮有以下幾點:首先是個體差異性,個體樣本之間的表現(xiàn)在機械痛閾上隨保持一致,但在對冷的感受上則不一致,該現(xiàn)象與臨床患者表現(xiàn)一致;另一點考慮則是超出推拿即刻鎮(zhèn)痛作用維持的時效,但該觀點還需進一步驗證。基于行為學結(jié)果,證實推拿1次既可發(fā)揮即刻鎮(zhèn)痛作用又可改善冷敏化狀況。

3.2 IL-17A與NP關(guān)系密切

IL-17A主要是由Th17細胞產(chǎn)生,介導炎癥及自身免疫性疾病[15]。IL-17可通過間接招募損傷神經(jīng)元區(qū)域中的免疫細胞,進而釋放炎性因子,參與NP的發(fā)生與發(fā)展[16-17]。受損區(qū)域神經(jīng)元中IL-17A表達上調(diào)的同時,可通過其受體IL-17RA將信號傳遞給感覺神經(jīng)元,從而促進神經(jīng)再生[18]。IL-17可直接或間接激活神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞,釋放多種炎癥介質(zhì)及趨化因子進而對神經(jīng)元產(chǎn)生損害[19-20]。CCI造模后第3天,背根神經(jīng)節(jié)中C/EBPβ表達升高,可引起自發(fā)性疼痛、機械性痛閾以及溫度覺的敏化,而當抑制C/EBPβ的表達時則可緩解其敏化癥狀[21]。C/EBPβ過多表達可促使脊髓小膠質(zhì)細胞活化,加劇神經(jīng)炎癥反應[22]。因此,抑制IL-17A/RA的結(jié)合及其下游的傳導,可能成為治療pNP新思路[23],但目前還未有相關(guān)研究在IL-17A介導的C/EBPβ通路在pNP早期進行研究,因此本實驗基于上述理論進行研究。研究結(jié)果顯示,相較于模型組,推拿干預后可抑制脊髓背角中IL-17A/RA表達(P<0.05),并且抑制了下游通路中C/EBPβ mRNA與蛋白的表達(P<0.05),從而發(fā)揮即刻止痛的作用,此結(jié)果與前人認為的IL-17A/RA為潛在性治療靶點的相關(guān)研究成果吻合[24]。因此可以認為推拿干預1次后可通過抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ信號通路實現(xiàn)早期鎮(zhèn)痛。

綜上所述,本實驗揭示了“三法三穴”推拿手法干預即刻便可有效緩解因pNP導致的疼痛,其啟動機制與抑制IL-17A、IL-17RA、C/EBPβ信號通路有關(guān)。但是本實驗還存在一定局限性,如未驗證干預1次后鎮(zhèn)痛效果的維持時長,尤其是對冷敏化情況的研究。此外,也未對早期鎮(zhèn)痛過程中脊髓背角IL-17A對膠質(zhì)細胞形態(tài)的影響進行研究,后期實驗可從這兩方面入手進一步驗證,為臨床推拿治療pNP提供更多證據(jù),為推拿學的發(fā)展提供科學支撐。