仙茅苷對大鼠骨髓基質細胞體外增殖及成骨分化的影響①

蘇佳雨,王錫明,趙 剛,石金明,李 超,柴傲然

(1.佳木斯大學研究生學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.大慶油田總醫院,黑龍江 大慶 163000;3.佳木斯大學附屬第二醫院,黑龍江 佳木斯 154002)

骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)是骨髓中特殊的干細胞,有很強的增殖能力和多向分化能力[1],在特定的誘導條件下能夠向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞、成纖維細胞、神經細胞等分化[2-4]。誘導物在BMSCs向成骨方向分化、成骨能力的提高中有著重要的作用[5]。而今已經有多項研究表明多種中藥可以促進骨髓基質細胞的增殖并且誘導其分化為成骨細胞。

中藥仙茅是多年生的草本植物,來源于石蒜科草本植物仙茅(curculigo orchioides gaertn)的干燥根莖,仙茅的藥用歷史悠久,有補腎壯陽、強筋壯骨、祛除寒濕的功效[6]。藥理學研究表明仙茅具有提高免疫、清除氧自由基、減緩生殖系統的老化、保護心血管等多種作用,并且在抗骨質疏松方面也有著一定的作用[7]。仙茅苷(curculigoside,CCG)是仙茅主要的活性成分[8]。

本實驗將不同濃度的仙茅苷作用于體外培養的大鼠骨髓基質細胞,觀察仙茅苷對細胞的增殖和向成骨方向分化的影響,探討仙茅苷在 BMSCs 成骨性分化中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料:4～6周齡SD大鼠,佳木斯大學動物實驗中心提供。仙茅苷(上海金穗生物科技HPLC≥98%),DMEM培養基(HyClone),胎牛血清(GIBCO),地塞米松、β一甘油磷酸鈉、維生素C(均為GIBCO公司),胰蛋白酶(HyClone), CCK-8試劑盒(BOSTER博士德生物),堿性磷酸酶試劑盒(購自南京建成)。

1.1.2 主要儀器設備:CO2恒溫細胞培養箱(美國ThermoForma),超凈工作臺(蘇州明泰空氣凈化技術有限公司),電子分析天平(Ohaus,美國),倒置相差顯微鏡(Olympus,日本),酶標儀(Takara,日本)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓基質細胞的分離與培養

無菌條件下分離出大鼠的股骨、脛骨,將表面附著的組織去凈,剪去兩側骺端,顯露髓腔,用注射器吸取培養液沖洗髓腔,直到髓腔發白。將細胞轉移到離心管中,1000r/min離心10min,棄掉上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM培養液,混勻后接種于培養瓶,置于37℃、體積分數5%的CO2培養箱內培養,48h后換液,去除懸浮未貼壁的細胞,以后每3d更換培養液。 細胞達到80%融合以上時,加入0.25%的胰蛋白酶進行消化,按1:2比例傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖

將生長良好穩定的第3代BMSCs以5×104/mL的密度接種于96孔板,每孔的液量為100μL,37℃、5%CO2培養箱中培養 24h后,棄培養液,加入含CCG的終濃度為25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL,200μg/mL的培養液,等量的DMEM培養液作為對照孔,置于培養箱中培養。在培養1、4、7d后,加入CCK-8試劑, 放于培養箱中繼續孵育4h后,用酶標儀測定波長在450nm下每孔的吸光度(OD值)。

1.2.3 堿性磷酸酶活性(ALP)測定

將第三代BMSCs以5×104/mL的密度接種于96孔板中,第二天換不同培養液, 共分6組,對照組:含10%FBS的DMEM培養液組;成骨誘導液組(含10%胎牛血清的DMEM培養液中加入0.1μmol/L地塞米松、50μg/mL維生素C、10mmol/Lβ一甘油磷酸鈉);分別含終濃度為25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的仙茅苷+成骨誘導液組。在培養3、6、9d后按照ALP試劑盒操作進行檢測。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 CCK-8 檢測細胞增殖

各組隨著時間的增加BMSCs不斷增殖,各濃度仙茅苷組(25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL,200μg/mL)均能夠促進細胞的增殖,與對照組相比較,差異有統計學意義(P<0.05),其中以濃度為100μg/mL的作用最顯著,見表1。

表1 仙茅苷對各組BMSCs增殖的影響

2.2 堿性磷酸酶活性測定

誘導后的第3、6、9d,成骨誘導液組和仙茅苷+成骨誘導液組的ALP活性均顯著升高(P<0.05),且在仙茅苷濃度為100μg/mL時效果最好。而仙茅苷+成骨誘導液組效果優于成骨誘導液組,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 仙茅苷對各組BMSCs 堿性磷酸酶活性的影響

3 討論

隨著正畸技術的發展和進步,以及人們對生活質量要求的提高,對牙齒的美觀也越來越在意,成年人在正畸患者中的比例日趨增多[9],而其中一部分患者存在慢性牙周病,正畸治療可能會導致牙槽骨的吸收變快。而牙周病患者必須在牙周病靜止期,牙槽骨的吸收不超過1/2,炎癥被有效的控制時才能采取正畸治療[10]。由牙周病所致的牙槽骨缺損以及腫瘤、外傷、先天等因素導致的頜骨骨組織缺損很常見,頜骨的修復始終是口腔臨床醫學上的難點,一般的修復手段不能起到很好的療效,骨組織工程的進展使得骨缺損的修復有了新的轉機。骨組織工程的重要環節之一是種子細胞的選擇,由于骨髓基質細胞有多向分化的潛能并且在體外能夠大量增殖,將成為前景最為理想的細胞[11]。中藥作為祖國傳統醫學的一部分,由于毒副作用小并且容易吸收,常用于對骨損傷的治療[12]。近些年,多項研究顯示通過中藥來促進BMSCs的增殖以及誘導其分化是很有效的途徑[13]。

不同濃度CCG干預BMSCs后,CCK-8實驗結果顯示,25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的仙茅苷均能促進骨髓基質細胞的增殖,而在濃度為100μg/mL時的促增值效果最顯著。堿性磷酸酶是成骨細胞表面的標志性酶,其表達隨著分化程度的增加而增強,它是BMSCs定向成骨分化的重要評價指標。堿性磷酸酶活性檢測結果顯示,在定向誘導成骨的條件下,仙茅苷顯著的提高了ALP的活性,且濃度為100μg/mL時作用最明顯,表明仙茅苷對大鼠骨髓基質細胞的成骨分化能力有著積極的作用。

本實驗將不同濃度的仙茅苷作用于體外培養的大鼠骨髓基質細胞,通過細胞增殖實驗和對成骨分化的標志性酶的檢測,發現仙茅苷可促進大鼠骨髓基質細胞的增殖,并且促進其成骨方向分化,但其更深層的機制還有待進一步的研究。