HPV感染病例與P16INK4a 表達的關聯研究①

牛愛琴,楊苗苗,朱 冰,王艷春,競柏松

(商丘市第一人民醫院婦科,河南 商丘 476100)

宮頸癌是世界范圍內最常見的婦科惡性腫瘤,其診斷、分期、治療、病理、預防等一直為近20多年來的研究熱點與難點[1]。人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持續感染是宮頸癌的主要危險因素,90%以上的宮頸癌伴有HPV感染[2]。盡管組織學被認為是宮頸病變診斷金標準,但如宮頸涂片之類的常規篩查容易受到病理醫師的主觀影響,因此需要更敏感、特異性更高并且可重復的生物標志物來檢測宮頸前體和腫瘤病變。

P16INK4a是一種細胞周期素依賴性激酶(cyclin-dependentkinases,CDK)抑制物,而CDK是與細胞周期進程相對應的一套Ser/Thr激酶系統,各種CDK沿細胞周期時相交替活化,磷酸化相應底物,使細胞周期事件有條不紊地進行下去。有研究指出[3-6],P16INK4a表達失調可能與陰道癌、前列腺癌等生殖細胞癌癥相關。在細胞周期中[7-9],磷酸化的pRb可與轉錄因子E2F結合,促使細胞保持G0期或G1早期。而當HPV病毒的E7蛋白和pRb結合后,蛋白活性降低,促使轉錄因子E2F大量釋放,細胞異常殖活躍。在宮頸細胞中,感染HPV病毒后,P16INK4a其作為細胞周期素激酶抑制物,其調控CDK其表達失調,逐步影響下游的生物學行為,可能最終導致P16INK4a喪失對細胞周期的調控功能,從而導致了宮頸細胞的異常增生等生物學行為,與宮頸癌的發生進展相關。

因此,本實驗通過大樣本病例分析及實驗研究P16INK4a與宮頸病變類型,以及P16INK4a與HPV感染的關聯性,探討P16INK4a在宮頸癌發生發展中的作用,為宮頸癌的早期診斷提供新的方法,為宮頸癌早期干預提供循證醫學支持,同時對于今后利用基因治療及研發新的藥物預防宮頸疾病的發生可能有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病人標本及分組

經醫院倫理委員會批準,選取商丘市第一人民醫院2020年4月至2023年4月年齡在21～70歲之間的HPV陽性患者404例(包括高危型及低危型),根據每一位患者的病理活檢結果分為:鱗狀細胞癌(SCC)組(98例),高級別宮頸上皮內瘤變組(HSIL)組104例,低級別宮頸上皮內瘤變(LSIL)組100例,宮頸炎組102例。患者身體狀況、腫瘤分期、治療方式及隨訪等數據均來自臨床病例(實施過程中要排除失訪或其他情況的病例)。所有研究對象均通過研究知情同意,均無其他內科合并癥,手術前月經周期規律28～35d,無其他婦科疾病及內分泌疾病、無生殖道炎癥且半年內均未行激素治療。

1.2 HPV分型檢測

應用QIAGENDNeasy血清組織試劑盒,然后用福爾馬林和石蠟進行組織包埋固定,下一步進行實時PCR擴增基因,設定PCR擴增后帶約150個堿基對的樣品對應于陽性對照擴增子的長度為陽性。應用多重HPV基因分型試劑盒GenotypingKit檢測HPV亞型6,11,16,18,26,31,33,35,39,V42,43,44,45,51,52,HPV53,56,V58,59,66,68,70,73和82。設定這些結果的熒光強度中值為10或更高為陽性。

1.3 P16INK4a免疫組化

使用CINtecP16INK4a免疫組化試劑盒依據說明書進行實驗。P16INK4a抗體檢測使用小鼠單抗人P16INK4a抗體。組織切片以P16INK4a染色,P16INK4a陽性信號定位于細胞核和/或細胞漿。P16INK4a陰性(-)是指宮頸鱗狀上皮中P16INK4a局灶著色或無著色。局灶著色指單個細胞、或小團細胞的著色,即不是連續的著色,尤其是基底細胞和副基底細胞之外的不連續著色。P16INK4a陽性是指宮頸鱗狀上皮自基底層、到副基底層的細胞呈彌漫、連續著色,而中間層或中間層至表層的細胞著色可有可無。P16INK4a的免疫染色根據分級(陽性細胞百分比)、分布、定位模式和染色強度來評估。采用四級分級法描述陽性染色細胞的比例:<5%細胞為0分(陰性)(圖1a);5%-25%細胞為1分;26%-50%細胞為2分,>50%細胞為3分。P16INK4a染色強度分為:弱(1分)、中等(2分)和強(3分)。通過乘以P16INK4a陽性細胞的百分比×染色強度來計算P16INK4aIHC評分。得分范圍為0～9分,分為0～3分(+)(圖1b)、4～6分(++)(圖1c)、7～9分(+++)(圖1d)。

圖1 P16INK4a免疫組化在宮頸病變中的示意圖(sp×100)

1.4 統計學方法

采用GraphPadPrism5.0(GraphPad軟件)進行分析。計數資料采用χ2檢驗(如不符合χ2檢驗條件,則采用Fisher精確概率法),采用秩和檢驗比較兩組間的P16INK4a免疫組化結果,采用斯皮爾曼(Spearman)秩相關檢驗對等級資料進行統計學相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較

在本研究中,404例患者中,鱗狀細胞癌(SCC)98例,HSIL104例,LSIL100例,宮頸炎102例。單個病例的尖銳濕疣被認為是LSIL類別。年齡21～70歲,年齡中位數49.0歲。71.2%的HSIL病例和79.6%的SCC病例屬于>50歲年齡組。孕次與產次在各組中無統計學差異(P>0.05),見表1。

表1 404例患者的臨床資料比較

2.2 P16INK4a在不同宮頸病變組織中的表達

免疫組化結果顯示:在慢性宮頸炎癥組102例中,P16INK4a陽性表達14例,陽性率為13.7%,其中+為14例(13.7%,14/102),無++與+++;在LSIL組中,P16INK4a陽性表達46例,陽性率為46%,其中+為32例(32%,32/100),++12例(12%,12/100),+++2例(2%,2/100);在HSIL組中,P16INK4a陽性表達90例,陽性率為86.5%,其中+為18例(17.3%,18/104),++24例(23.1%,24/104),+++48例(46.2%,48/104);而在宮頸癌組中,P16INK4a陽性表達98例,陽性率為100%,其中+為4例(4.1%,4/98),++24例(24.5%,24/98),+++70例(71.4%,70/98)。趨勢χ2檢驗顯示:4種病變中的陽性率的差異有統計學意義(χ2=197.84)。Spearman相關分析表明,P16INK4a陽性表達的γ=0.802(P<0.01),這些數據表明:P16INK4a的陽性率與表達強度隨宮頸病變程度的加深而增加,見表2。

表2 P16INK4a的陽性率與表達強度與宮頸病變的關系

2.3 P16INK4a表達與HPV分型的關系

通過Spearman相關分析法比較,宮頸組織中P16INK4a的表達在低危型與高危型HPV間有顯著差異,P16INK4a的表達強度與高危型HPV有相關性(γ=0.745,P<0.001),見表3。

表3 P16INK4a的表達強度與HPV分型的關系

3 討論

P16INK4a蛋白是一種調節細胞生長和增殖的腫瘤抑制因子,它通常在宮頸癌及其前體中過度表達。P16INK4a在宮頸組織病變中的地位可以提供重要的診斷和預后信息,特別是在人乳頭瘤病毒(HPV)感染的背景下[5,6]。在宮頸組織中,P16INK4a的表達通常局限于上皮上層的細胞核。在正常宮頸組織中,只有少數細胞會表達P16INK4a,而在宮頸上皮內瘤變(CIN)和宮頸癌中,P16INK4a通常呈彌漫性強染色。這是因為HPV感染是CIN及宮頸癌的主要原因,導致P16INK4a的表達增加。因此,P16INK4a染色常被用作CIN及宮頸癌診斷的標志物,其強烈的彌漫性染色表明CIN的可能性很高[10]。P16INK4a狀態對宮頸病變組織學特征的影響是顯著的。在低級別CIN(CIN1)中,P16INK4a的表達通常局限于上皮的下1/3,可能是局灶性或斑片狀的。相比之下,高級別CIN(CIN2/3)通常在整個上皮中表現為彌漫性和強P16INK4a染色。宮頸鱗狀細胞癌(SCC)也表現出典型的強且彌漫性P16INK4a染色。然而,子宮頸腺癌可能有不同的P16INK4a表達模式,可能不顯示彌漫性染色。相比之下,P16INK4a在良性宮頸病變(如宮頸息肉)中的表達通常較低或不表達[11]。然而,也有一些例外,因為P16INK4a在某些良性疾病中也可以表達,例如反應性鱗狀皮化生[12]。本研究中P16INK4a蛋白在慢性宮頸炎組織中絕大多數呈陰性表達,而在CIN、宮頸鱗癌組織中主要呈陽性或強陽性表達,隨著宮頸病變程度的增加,P16INK4a蛋白的表達強度及染色范圍也逐漸升高,與文獻的報道一致。經過Spearman相關分析,得出γ=0.784,雙側檢驗(P<0.05),顯示P16INK4a蛋白的表達強度和染色范圍表達與宮頸病變的發生發展的機制存在密切關系。

P16INK4a陽性與人乳頭瘤病毒(HPV)感染在宮頸組織病變中密切相關,不同宮頸組織病變中P16INK4a陽性與HPV分型的關系是宮頸癌診斷和治療中尤為重要[13]。HPV分型涉及確定宮頸組織中存在的特定HPV基因型。不同的HPV基因型具有不同的致癌潛力,高危型如HPV-16和HPV-18與宮頸癌的發展密切相關。研究表明,P16INK4a陽性與宮頸組織病變中存在高危型HPV有很強的相關性[14]。具體來說,在正常宮頸組織和其他不太嚴重的宮頸組織異常可能與低風險HPV類型有關,也可能根本與HPV無關。在這些病例中,P16INK4a的表達水平可能較低或不存在。然而,在宮頸上皮內瘤變(CIN)病變中,高危型HPV感染和P16INK4a過表達是常見的。隨著CIN病變中異性增生程度的增加,P16INK4a陽性細胞的發生率也隨之增加[15]。事實上,P16INK4a現在被廣泛用作CIN病變的診斷標志物,并經常被包括在病理報告中。在浸潤性宮頸癌中,HPV感染也與P16INK4a過表達密切相關,P16INK4a在宮頸癌中的過度表達是對高危型HPV存在的反應,特別是HPV16和HPV18,這是與宮頸癌發展相關的最常見類型。當高危HPV感染宮頸細胞時,會產生兩種癌蛋白E6和E7,干擾細胞周期的正常調節,促進細胞增殖。E7癌蛋白特異性靶向并降解視網膜母細胞瘤蛋白(pRb),而pRb通常抑制轉錄因子E2F1的活性。這導致E2F1活性增加,從而促進參與細胞周期進程的基因的轉錄,包括P16INK4a[16]。在本研究中,宮頸組織中P16INK4a的表達在低危型與高危型HPV間具有顯著差異,P16INK4a的表達強度與高危型HPV有相關性,證實P16INK4a陽性和HPV分型的聯合評估為宮頸病變的診斷、風險分層和治療提供了有價值的信息。P16INK4a的高表達與高危HPV基因型的檢測同時發生表明宮頸非典型增生或宮頸癌的可能性更高。

綜上所述,P16INK4a狀態是鑒別高級別CIN和宮頸癌,以及區分這些病變與低級別CIN和正常宮頸組織的有效生物標志物,特別是在HPV感染的背景下。雖然P16INK4a過表達通常與癌前病變和癌性病變相關,但也有一些例外,它與其他診斷工具(如細胞學檢測和人乳頭瘤病毒檢測)結合使用,有助于提高宮頸癌篩查和診斷的準確性。值得注意的是,P16INK4a狀態不應單獨用于制定治療決策或預測生存結果。在做出治療決定和預測預后時,還應考慮其他因素,如病變的分期和分級、其他危險因素的存在以及患者的年齡、病史和其他分子標記物。