18β-甘草次酸通過PGK1糖酵解途徑抑制oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡研究

韓維維,王 博,鐘 晴,張 蓉,徐 馳*

1黑龍江中醫藥大學臨床醫學院;2黑龍江中醫藥大學基礎醫學院,哈爾濱 150040

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的主要危險因素之一。人主動脈內皮細胞(human aortic endothelial cells,HAECs)與AS病變的產生有關[1]。此外,既往研究表明,HAECs的異常遷移、增殖和凋亡與AS的進展密切相關[2]。氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)會損害人主動脈內皮細胞功能并且是促進AS進展的關鍵危險因素[3]。研究發現糖酵解是參與動脈粥樣硬化形成最重要的代謝途徑之一[4]。Sarrazy等[5]研究發現動脈粥樣硬化小鼠敲低葡萄糖轉運蛋白1的表達水平,可提高小鼠對葡萄糖的攝取從而發揮抗動脈粥樣硬化的作用。Matsui等[6]研究發現通過抑制葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性減少糖酵解可降低血管中超氧化物的水平,進而減輕動脈粥樣硬化小鼠的損傷,另一研究發現糖酵解途徑關鍵基因PGK1參與ox-LDL誘導的人主動脈內皮細胞凋亡[7]。以上研究結果說明糖酵解途徑在動脈粥樣硬化病理進程中扮演重要角色。

18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid,GA)是甘草中關鍵的生物活性成分,具有抗炎癥,抗氧化,抗病毒及抗癌等多種藥理作用,其中抗氧化的作用尤其顯著,與此同時還可以通過生物轉化等過程更大限度地發揮積極作用[8]。Wang等[9]研究發現GA可以抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的臍靜脈內皮細胞的白介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎性細胞因子的分泌及凋亡的發生,提示GA可以抑制內皮細胞的炎癥和凋亡。那么GA能否通過糖酵解途徑抑制內皮細胞的凋亡進而防治動脈粥樣硬化,目前尚未報道。因此本研究基于PGK1介導的糖酵解途徑來探討GA抑制內皮細胞凋亡的分子機制,為AS的防治提供新的思路和科學依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

原代人主動脈內皮細胞(武漢普諾賽生物技術公司);GA(貨號DG0172,質量分數≥98%,成都德思特生物技術有限公司);oxLDL(貨號CB82737214,廣州奕元生物有限公司);乳酸檢測試劑盒(貨號A019-2-1,南京建成公司);葡萄糖檢測試劑盒(貨號S0201S)、CCK8試劑盒(貨號C0038)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(貨號C1090)購于碧云天公司;PGK1(貨號E9R7O)、GLUT1(貨號E4S6I)、HK2(貨號C64G5)、PKM2(貨號D78A4)Rabbit mAb抗體購于美國Cell-Signaling公司;Bax(貨號14-6999-82)Mouse mAb、Bcl2(貨號13-8800)Mouse mAb、Caspase-3(貨號700182)Rabbit mAb及Caspase-9(貨號MA1-12562)Mouse mAb抗體購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 主要儀器

CO2恒溫孵育箱(MCO-15AC,SANYO公司,日本);多功能酶標儀(FlexStation 3,Molecular Devices,美國)。

1.3 原代人主動脈內皮細胞培養

使用原代人主動脈內皮細胞專用培養基常規培養,包含1%青鏈霉素、1%原代內皮細胞添加劑及2%胎牛血清作為完全培養基,不含胎牛血清添加的培養基作為同步化培養基,同步化6 h后進行給藥處理。

1.4 實驗細胞分組

實驗分為空白對照組(control,Con)、oxLDL模型組(model,Mod,100 mg/L)、GA治療組(oxLDL+10 μmol/L,GA-10;oxLDL+20 μmol/L,GA-20;oxLDL+40 μmol/L,GA-40),其中oxLDL處理細胞24 h后,不同濃度的GA再處理24 h。給予PKG1激動劑后分組為空白對照組(control,Con),oxLDL模型組(model,Mod,100 mg/L),GA治療組(oxLDL+40 μmol/L,GA-40),PKG1激動劑(特拉唑嗪)+GA+oxLDL組(GA+TZ),其中特拉唑嗪和GA共同作用于細胞24 h。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

用預冷的PBS清洗用藥處理后的主動脈內皮細胞3次,每孔加入60 μL RIPA強裂解液,置于冰上裂解30 min,12 000 r/min收集細胞上清,加入細胞上樣緩沖液,100℃煮沸5 min。SDS-PAGE分離蛋白,將蛋白轉移至NC膜上,脫脂奶粉封閉1 h,TPBS洗膜3次,分別加入一抗PGK1(1∶500)、GLUT1(1∶1 000)、HK2(1∶1 000)、PKM2(1∶500)、Bax(1∶500)、Bcl2(1∶300)、Caspase-3(1∶500)、Caspase-9(1∶200)及β-actin(1∶2 000),4℃孵育過夜,洗膜后室溫孵育二抗(1∶5 000)1 h,洗膜后用成像儀發光拍照。

1.6 TUNEL法檢測主動脈內皮細胞凋亡

棄掉細胞上清后,用PBS輕輕沖洗細胞,4%多聚甲醛固定15 min。然后,用TUNEL試劑在37 ℃避光條件下孵育1 h,使其滲透30 min。最后,用DAPI染料標記細胞核。熒光圖像采用共聚焦激光掃描顯微鏡(奧林巴斯,日本)拍攝。紅色熒光代表TUNEL標記的標記凋亡細胞的信號。TUNEL標記核的數量(紅色)占總DAPI標記核的數量(藍色)的百分比為凋亡指數。

1.7 CCK-8法檢測人主動脈內皮細胞活性

將原代人主動脈內皮細胞接種在96孔板,每孔200 μL培養基并根據不同的GA濃度進行給藥,每組設置6個平行復孔,作用24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,在培養箱中培養1 h,待明顯顯色后用多功能酶標儀檢測在450 nm波長的各組OD值。

1.8 比色法檢測內皮細胞葡萄糖和乳酸濃度

去除人主動脈內皮細胞培養液,用PBS清洗三次。加入裂解液充分裂解后,離心取上清作為待測樣品,按照試劑盒說明書進行操作,96孔板每孔加200 μL上清液,于630 nm和530 nm波長處分別檢測葡萄糖和乳酸吸光度值。

1.9 統計方法

2 結果

2.1 GA對人主動脈內皮細胞活性的影響

CCK-8結果顯示GA濃度0、10、20、40、80、160 μmol/L處理內皮細胞時,細胞活性(OD值)分別為0.89±0.07、0.87±0.03、0.83±0.05、0.85±0.04、0.61±0.04、0.52±0.12,其中大于GA濃度大于80 μmol/L時細胞的活性降低(P<0.01),而濃度在10～40 μmol/L時對細胞的活性無影響(P>0.05),因此選用10、20、40 μmol/L分別為低劑量組,中劑量組和高劑量組進行實驗。

2.2 GA對oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡的影響

與Con相比,Mod人主動脈內皮細胞Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達水平及TUNEL凋亡指數明顯增加,Bcl2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05);與Mod相比,GA治療組(GA-10、GA-20、GA-40)內皮細胞Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白表達水平及TUNEL凋亡指數明顯降低,Bcl2蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)(見圖1、2)。以上結果說明GA可以抑制oxLDL誘導的人主動脈內皮細胞凋亡。

圖1 GA對各組細胞凋亡的影響Fig.1 Effect of GA on cell apoptosis in each group

圖2 TUNEL法檢測凋亡水平Fig.2 Apoptosis level was measured by TUNEL method

2.3 GA對oxLDL誘導的人主動脈內皮細胞糖酵解關鍵基因PGK1、GLUT1、HK2、PKM蛋白水平的影響

與Con相比,Mod人主動脈內皮細胞PGK1蛋白表達水平明顯增加(P<0.01);與Mod相比,GA治療組(GA-10、GA-20、GA-40)內皮細胞PKG1蛋白表達水平明顯下降(P<0.01),并且呈劑量依賴性(見圖3)。

圖3 GA對oxLDL誘導的人主動脈內皮細胞糖酵解關鍵基因PGK1、GLUT1、HK2、PKM蛋白水平的影響Fig.3 Effect of GA on the protein levels of PGK1,GLUT 1,HK2,and PKM,the key glycolysis genes induced by oxLDL in human aortic endothelial cells

2.4 GA對oxLDL誘導的人主動脈內皮細胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響

比色法結果顯示,與Con相比,Mod人主動脈內皮細胞葡萄糖消耗量明顯降低,乳酸分泌量明顯增加(P<0.01);與Mod相比,GA治療組(GA-10、GA-20、GA-40)內皮細胞葡萄糖消耗量明顯上升,乳酸分泌量顯著減少(P<0.01),并且呈劑量依賴性(P<0.01)(見圖4)。

圖4 GA對oxLDL誘導的人主動脈內皮細胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響Fig.4 Effect of GA on glucose consumption and lactate production in human aortic endothelial cells induced by oxLDL

2.5 PGK1蛋白激動劑特拉唑嗪對GA抑制oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡作用的影響

與Con相比,Mod人主動脈內皮細胞Bax、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-9蛋白表達水平明顯增加,Bcl2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05);與Mod相比,GA治療組(GA-40)內皮細胞Bax、cleaved Caspase-3及Cleaved Caspase-9蛋白表達水平明顯降低,Bcl2蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)(見圖5),然而加入PGK1蛋白激動劑特拉唑嗪后可以逆轉GA的上述作用,提示GA通過抑制PGK1介導的糖酵解通路進而抑制oxLDL誘導的血管內皮細胞凋亡。

圖5 特拉唑嗪對每組凋亡蛋白表達的影響Fig.5 Effect of terrazosin on apoptotic protein expression in each group

3 討論與結論

近年來研究發現,作為甘草的關鍵生物活性成分GA對多種心血管疾病具有一定的防治作用。GA通過調控RhoA/Rho激酶通路抑制肺動脈平滑肌細胞增殖進而防治肺動脈高壓[10]。Yang等[11]通過代謝組學分析發現GA可通過抗氧化和抗炎作用緩解肺動脈高壓大鼠代謝紊亂,提高機體抗缺氧能力,恢復各種代謝途徑(能量代謝、氨基酸代謝、脂質代謝)。另外GA還可以通過抑制IP3介導的內皮細胞鈣離子信號通路進而調控多種心血管的功能。比如其可以通過減弱細胞內鈣過載改善心臟舒張功能,并可以通過調控鈣內流介導的p38 MAPK通路進而抑制缺血性心肌細胞凋亡[12,13]。然而GA對AS的防治機制目前尚不清楚。

本研究利用oxLDL處理人主動脈內皮細胞模擬AS體外細胞模型。發現在oxLDL誘導的內皮細胞損傷模型中,促進凋亡指標cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax及TUNEL水平顯著增加,抑制凋亡因子Bcl2的水平顯著下調,加入低中高劑量的GA均可以有效抑制促凋亡指標Caspase-3、Caspase-9、Bax及TUNEL的水平,并促進抑制凋亡因子Bcl2的表達,提示GA可以抑制oxLDL誘導的內皮細胞凋亡。進一步研究發現另外,在oxLDL誘導的內皮細胞凋亡模型中,糖酵解關鍵基因PGK1、GLUT1、HK2及PKM表達水平顯著增加,提示在oxLDL誘導內皮細胞凋亡過程中激活了細胞的糖酵解代謝。而加入低中高劑量的GA均可以有效抑制上述糖酵解關鍵基因的表達水平,說明GA可以抑制oxLDL誘導的內皮細胞的糖酵解途徑。多項研究已證實糖酵解是參與動脈粥樣硬化形成最重要的代謝途徑之一[14-16],而本研究結果也證實了糖酵解參與了oxLDL誘導內皮細胞凋亡過程,并且GA可以抑制oxLDL誘導的內皮細胞的糖酵解途徑。本研究進一步還發現加入PGK1激動劑特拉唑嗪后,可以顯著逆轉GA對oxLDL誘導內皮細胞凋亡的抑制作用,上述研究說明GA通過PGK1介導的糖酵解途徑抑制內皮細胞的凋亡。而PGK1是催化糖酵解途徑中第一個產生ATP的酶,是介導糖酵解途徑的關鍵基因。Zhang等[7]研究發現oxLDL處理的人主動脈內皮細胞模型中PGK1蛋白表達顯著增加,而本研究結果與上述一致,說明PGK1介導的糖酵解途徑是動脈粥樣硬化發生發展的重要病理機制。

綜上所述,本研究發現GA通過抑制PGK1介導的糖酵解通路進而抑制oxLDL誘導的內皮細胞凋亡,為動脈粥樣硬化的治療提供新的思路和靶點。