基于譜效關系的茴香根皮抗肝纖維化有效成分篩選及其機制探討

王百才,趙 耀,耿若愚,馬 沖,劉天華,胡君萍*,楊建華,2*

1新疆醫科大學藥學院,烏魯木齊 830017;2新疆醫科大學第一附屬醫院,烏魯木齊 830011

肝纖維化是誘發肝硬化甚至肝癌的主要原因,約90%的肝癌是在肝纖維化或肝硬化的基礎上發展而來,因此肝纖維化的治療尤為重要[1]。肝纖維化在臨床發病率逐年增加,嚴重危害了人們的生命安全。肝纖維化的主要原因包括慢性肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝炎[2]。肝纖維化的特征是細胞外基質的過度積聚,這是由細胞外基質的合成和沉積增加以及細胞外基質降解減少或不平衡引起的[3]。肝星狀細胞激活被認為是肝纖維化的關鍵環節,它是肝臟中細胞外基質蛋白過量累積的主要原因[4,5]。

茴香根皮是傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥根皮,收錄在部頒標準維吾爾藥分冊中,用于治療濕寒性或黏液質性疾病,如濕寒性各種炎腫,兩脅寒痛,腰背酸痛,閉經、閉尿、陳舊性腸梗阻等[6]。護肝布祖熱顆粒是民族醫藥保肝經典方,由芹菜子、芹菜根、菊苣子、菟絲子、菊苣根、茴香根皮、小茴香組成,具有補肝利膽等功效。課題組前期研究發現護肝布祖熱顆粒可以保護CCl4誘導的大鼠肝纖維化[7]。麥迪乃·賽福丁等發現民族藥茴香根皮具有一定程度的促進肝組織修復并保護肝細胞膜的作用[8]。因此,茴香根皮可能具有抗肝纖維化作用。

藥物譜效關系研究是將化學成分與藥效研究相結合對有效化學成分進行分析的方法,是在圖譜研究的基礎上,最大限度地獲取有用的化學信息,將譜圖與藥效結果聯系起來,通過線性或非線性數學處理,建立“譜-效”數學模型,從而確定出與藥效相關的化合物群[9]。通過對已知成分和未知成分的分析,能最大程度地反映中藥復雜混合體系中所含化學成分的種類和含量,進而對中藥質量進行整體描述和評價[10]。故本研究采用超高效液相色譜-質譜聯用對維藥茴香根皮化學成分進行了研究,結合茴香根皮乙醇提取部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水萃余部位對HSC-T6細胞增殖的影響聯合UPLC-Orbitrap-MS/MS借助偏最小二乘法及灰色關聯分析對茴香根皮化學成分進行篩選,并經體外實驗驗證茴香根皮有效成分抗肝纖維化的作用及其機制,為民族醫藥的研究和開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

茴香根皮藥材(批號:HXGP-YP-210115)購自安薩爾維吾爾藥業有限公司,經新疆醫科大學胡君萍教授鑒定為傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥根皮。

DMEM高糖培養基(批號2116111,以色列BI公司);PBS緩沖鹽溶液(批號2141302,以色列BI公司);胎牛血清(批號2120140,以色列BI公司);FITC偶聯Annexin-Ⅴ凋亡檢測盒(批號1026022,美國BD公司);0.25%胰酶細胞消化液(批號21089531,北京Labgic Technology公司);MTT試劑(批號EZ7890B104,德國Biofroxx公司);DMSO(批號EZ6789C150,德國Biofroxx公司);Hochest33258染色液(批號20210709,武漢Proteintech公司);大鼠Ⅳ型膠原(Ⅳ-C,批號:202305)、大鼠透明質酸(HA,批號:202305)、大鼠層粘連蛋白(LN,批號:202305)、大鼠Ⅲ型前膠原(PCⅢ,批號:202305)ELISA試劑盒(上海優選生物科技有限公司)。對照品去氫駱駝蓬堿(純度≥98%,批號H2303001)、二氫辣椒堿(純度≥98%,批號D2211001)、乙酰香蘭素(純度≥98%,批號V2211001)、芹菜素(純度≥98%,批號Z30142203)、7-羥基香豆素(純度≥98%,批號H2211001)、對香豆酸(純度≥98%,批號H2107001)、異莨菪亭(純度≥98%,批號E2209001)(四川普西標物科技有限公司);香草醛(純度≥98%,批號20170520,天津市北聯精細化學品開發有限公司)。

1.2 儀器

BDLSRⅡ流式細胞儀(美國BD公司);TS2倒置顯微鏡(日本Nikon公司);MultiskanGO全波長酶標儀(美國Thermo公司)。

1.3 實驗細胞

大鼠肝星狀細胞HSC-T6,細胞株(批號CLL-0116)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.4 茴香根皮浸膏的制備

稱取茴香根皮1 kg,分別用95%乙醇回流提取3次(3、3、2 h),料液比為1∶10,過濾合并濾液,濃縮乙醇提取物(ET),乙醇提取物浸膏得率為11.43%。乙醇提取物用水混懸,依次使用石油醚,乙酸乙酯,正丁醇萃取,合并萃取液蒸干溶劑,分別得到石油醚部位(PP)、乙酸乙酯部位(PE)、正丁醇部位(PB)、水萃余部位(PW),各部位浸膏得率分別為12.02%、3.37%、4.33%、80.28%。

1.5 茴香根皮UPLC-Orbitrap-MS/MS圖譜的檢測

1.5.1 對照品溶液的制備

精密稱取去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿、乙酰香蘭素、芹菜素、7-羥基香豆素、對香豆酸、異莨菪亭、香草醛對照品適量,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容得到質量濃度為500 ng/mL的對照品溶液。

1.5.2 UPLC-Orbitrap-MS/MS供試品溶液制備

分別取茴香根皮醇提物和萃取物浸膏100 mg加入500 μL甲醇,渦旋30 s,45 Hz勻漿4 min,冰水浴超聲1 h,后將樣本在4 ℃,12 000 r/min(離心力13 800×g,半徑8.6 cm)條件下離心15 min,小心地取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾,即得。

1.5.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm),流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫0～11 min,15%A→75%A;11～12 min,75%A→98%A;12～14 min,98%A;14～14.1 min,98%A→15%A;14.1～16 min,15%A。柱溫30 ℃,流速為0.5 mL/min,進樣量:5 μL。

1.5.4 質譜條件

采用電噴霧離子源(ESI),正離子和負離子掃描模式。正離子模式下電噴霧電壓為4 000 V,負離子模式下電噴霧電壓為-3 800 V,采用Orbitrap Exploris 120 質譜儀與Xcalibur軟件結合,基于IDA采集模式獲取MS和MS/MS數據。掃描范圍為m/z100～1 500,篩選每個采集周期的前四個,進一步獲得相應的MS/MS數據,護套氣體流速35 arb,輔助氣體流速15 arb,離子傳輸管溫度350 ℃,全MS分辨率為60 000,MS/MS分辨率為15 000,NCE模式碰撞能量:16/32/48。

1.6 體外抗肝纖維化活性的測定

1.6.1 細胞培養

將凍存的HSC-T6細胞株復蘇,用含10%胎牛血清的完全培養基重懸細胞,接種于培養瓶中,培養條件為37 ℃,細胞培養箱內CO2濃度為5%;觀察細胞形態、生長狀態,視情況進行換液或傳代。

1.6.2 MTT法測定茴香根皮各部位抗肝纖維化活性

將濃度為2×104個/mL的細胞接種至96孔板中,過夜貼壁成長后,加入1 μg/mL的脂多糖100 μL干預24 h,之后加入含茴香根皮醇提物或不同萃取物的完全培養基,使其終濃度為200、400、600、800、1000 mg/mL,每孔200 μL。干預48 h后,每孔加入100 μL MTT溶液,放入培養箱孵育4 h,孵育完畢加入150 μL DMSO溶液,490 nm下檢測OD值,并計算細胞存活率。

1.7 茴香根皮抗肝纖維化譜效關系研究

1.7.1 偏最小二乘法篩選活性成分

利用偏最小二乘法分別分析正負離子模式成分峰面積與HSC-T6細胞抑制率之間的關系,細胞抑制率越高,表明體外抗肝纖維化活性越好。將MTT法抑制率數據和正負離子模式檢測到的成分峰面積數據輸入到軟件SIMCA 14.1中進行偏最小二乘法分析得到VIP值和相關系數。VIP值越大,說明該成分對藥效的貢獻越大,相關系數大于零,表明化學成分與抑制率正相關,反之負相關[11,12]。

1.7.2 灰色關聯分析篩選活性成分

分別將正負離子模式茴香根皮化學成分峰面積和MTT抑制率數據導入在線網站SPSSPRO(https://www.spsspro.com/)進行灰色關聯分析得到成分關聯度和排名,將成分關聯度大于0.7的成分納入篩選范圍,關聯度越大評價結果越好[13]。

1.8 茴香根皮成分體外抗肝纖維化驗證

1.8.1 MTT法測定單體化合物的抗肝纖維化活性

實驗分組為正常組(control,Con)、模型組(model,Mod)、陽性藥水飛薊賓組(silybin,Sil)、去氫駱駝蓬堿組(harmine,Har)、二氫辣椒堿組(dihydrocapsaicin,Dih)、異莨菪亭組(isoscopoletin,Iso)等。給藥組分別加入濃度為25、50、100、200、400、800 μmol/L的化合物干預48 h,MTT法檢測OD值。

1.8.2 劃痕實驗

先用馬克筆在6孔板背面均勻的劃出橫線。待細胞生長至70%～80%時,使用200 μL的滅菌槍頭,按照橫線垂直劃痕。使用PBS清洗3次,洗去劃下的細胞,倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。之后分別加入濃度為200 μmol/L的去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿、異莨菪亭,24 h后在倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄,實驗重復3次。

1.8.3 免疫熒光法檢測α-SMA的表達

取HSC-T6細胞6×103個/mL接種于24孔板中,培養過夜,加入1 μg/mL脂多糖500 μL干預24 h。之后分別加入濃度為200 μmol/L的去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿、異莨菪亭,干預48 h后,無菌PBS清洗,固定液固定,使用TritonX-100室溫通透,使用5%羊血清室溫封閉,最后加入一抗工作液(1∶100),4 ℃孵育,次日用無菌PBS清洗,滴加二抗工作液,避光孵育,清洗,封片,拍照。

1.8.4 Hochest33258染色檢測細胞凋亡形態

給藥方法同“1.8.3”,棄去孔板內含藥培養基后,無菌PBS清洗,固定液固定15 min,無菌PBS清洗,Hochest33258染色液染色,避光孵育20 min,無菌PBS清洗,拍照。

1.8.5 JC-1檢測線粒體膜電位

給藥方法同“1.8.3”,干預48 h后,棄去舊培養基,無菌PBS清洗,接著用JC-1染色工作液避光孵育20 min,JC-1染色緩沖液清洗,棄去洗液加入完全培養基,拍照。

1.8.6 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡

將濃度為7×104個/mL的肝星狀細胞接種于6孔板中,培養過夜,加入1 μg/mL脂多糖1 000 μL干預24 h,分別加入濃度為200 μmol/L的去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿、異莨菪亭干預48 h后,收集孔內培養基,無菌PBS清洗,收集PBS洗滌液,胰酶消化,無菌PBS清洗,100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。空白組和各給藥組分別加入Annexin V-FITC和PI染料,最后加400 μL 1×Binding Buffer,尼龍網過濾,上機檢測。

1.8.7 ELISA法檢測上清Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的含量

給藥方法同“1.8.3”,收集給藥干預過后的細胞上清液3 000 r/min離心10 min,用細胞上清按照試劑盒說明書進行后續步驟。

1.8.8 Western blot檢測Bax、Bcl-2、Caspase3蛋白的表達

采用Western blot法研究Bax、Bcl-2、Caspase3的蛋白表達水平。按試劑盒說明書提取細胞蛋白,BCA蛋白定量,金屬浴15 min使蛋白變性。取變性蛋白適量,選用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉至PVDF膜,加入奶粉孵育2 h洗滌后,加入一抗,4 ℃孵育過夜;TBST洗滌后,加入對應二抗,室溫孵育1 h,顯影。用ImageJ圖像分析軟件進行灰度值分析。

1.8.9 統計學方法

使用SPSS 25.0軟件對實驗數據進行統計,繪圖使用Graphpad prism 8軟件。組間比較采用One-way ANOVA。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法測定各樣品的抗肝纖維化活性

不同濃度(200、400、600、800、1000 mg/L)ET、PP、PE、PB、PW作用于HSC-T6細胞48 h的MTT結果顯示:細胞存活率隨藥物濃度的升高顯著降低(見圖1)。選用給藥濃度為0.8 mg/L時的抑制率進行譜效關系研究,0.8 mg/L時ET、PP、PE、PB、PW抑制率分別為48.47%、11.38%、89.80%、51.13%和7.61%。

圖1 茴香根皮不同部位對HSC-T6增殖的影響Fig.1 Effects of different parts of F.vulgare cortex on the proliferation of

2.2 UPLC-Orbitrap-MS/MS圖譜的建立

通過UPLC-Orbitrap-MS/MS獲得的茴香根皮不同部位總離子色譜圖(total ion chromatogram,TIC)(見圖2)。根據總離子流圖中保留時間、一級質譜提供的準分子離子峰及二級質譜提供的碎片離子信息與對照品比對,并與文獻數據進行比較,共識別58個共有峰化合物[14,15],結果見表1。

表1 茴香根皮化合物不同部位峰面積

圖2 茴香根皮不同部位總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of different parts of F.vulgare cortex

2.3 偏最小二乘法和灰色關聯分析結果

根據偏最小二乘回歸分析原理,自變量投影重要性值(VIP)越大表示其對抑制率的解釋能力越強。由分析結果(見圖3)可知,共有11個成分VIP值大于1,且回歸系數均大于0(見表2),說明11個成分與細胞抑制率呈正相關關系。這11個成分在灰色關聯度分析中關聯度系數均>0.7,分別為二氫辣椒堿、去氫駱駝蓬堿、異莨菪亭、乙酰香蘭素、3,4-二甲氧鄰苯二甲酸、對甲氧基肉桂酸乙酯、7-羥基香豆素、1′-乙酰氧丁香酚醋酸酯、4-羥基苯甲酸酯、2-羥基苯乙酮、1,3-二咖啡酰奎寧酸。

表2 茴香根皮化合物VIP值、回歸系數和關聯度

圖3 標準化回歸系數圖、VIP值圖Fig.3 Standardized regression coefficient diagram and VIP value diagram.

2.4 MTT法篩選單體化合物體外抗肝纖維化活性驗證結果

基于譜效關系及文獻報道,本研究對具有潛在活性的化合物包括二氫辣椒堿、乙酰香蘭素、異莨菪亭、7-羥基香豆素、1,3-二咖啡酰奎寧酸、去氫駱駝蓬堿等進行了體外抗肝纖維化活性驗證,與對照組比較,這些化合物對活化的HSC-T6細胞增殖均具有不同程度的抑制作用(P<0.05、P<0.01、P<0.001),其中二氫辣椒堿、去氫駱駝蓬堿、異莨菪抗肝纖維化活性最強(見圖4),故選用這三個化合物進行后續驗證實驗。

圖4 化合物對HSC-T6增殖抑制的影響Fig.4 Effect of compounds on the inhibition of HSC-T6

2.5 單體化合物對HSC-T6細胞遷移的影響

與模型相比,二氫辣椒堿組細胞愈合率沒有明顯差異,異莨菪亭組和去氫駱駝蓬堿組的細胞劃痕愈合率顯著降低(P<0.001)(見圖5),說明異莨菪亭和去氫駱駝蓬堿顯著抑制HSC-T6細胞運動能力。

圖5 化合物對HSC-T6細胞運動能力的影響Fig.5 Effects of compounds on the motility of HSC-T6

2.6 單體化合物對HSC-T6細胞α-SMA的影響

免疫熒光染色顯示,與正常組比較,模型組α-SMA熒光強度明顯升高(P<0.001);與模型組比較,二氫辣椒堿組、去氫駱駝蓬堿組、異莨菪亭組α-SMA熒光強度明顯降低(P<0.01、P<0.001),差異有統計學意義(見圖6)。

2.7 單體化合物對HSC-T6凋亡的影響

細胞凋亡發生時細胞核會發生一系列形態變化,例如核皺縮,染色質凝聚,產生凋亡小體等。利用染料對細胞核染色,如果細胞是存活狀態,經過染色后是均勻的藍色熒光,如果細胞處于凋亡狀態,染色后是致密濃染的亮藍色熒光。本研究采用Hochest33258染色觀察HSC-T6細胞核的形態變化(見圖7A)。結果發現,與正常組相比,給藥組均出現核破裂、皺縮、致密濃染細胞等。

圖7 各化合物對HSC-T6細胞凋亡的影響Fig.7 Effects of compounds on the apoptosis of HSC-T6

當細胞處于凋亡狀態,細胞內的線粒體膜電位會下降,而且這種改變是比細胞核形態學變化要早,之后會不可逆地進入凋亡過程,因此線粒體膜電位的降低用于判斷細胞是否進入凋亡早期階段。正常線粒體內,JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物,聚合物發出強烈的紅色熒光;在化合物誘導線粒體膜電位崩潰時,由于膜電位的下降或喪失,JC-1只能以單體的形式存在于胞漿中,發出綠色熒光。本研究結果發現(見圖7B),正常組細胞的紅色熒光強度高,綠色熒光幾乎不可見,表明正常組細胞線粒體膜電位較高。說明異莨菪亭、二氫辣椒堿和去氫駱駝蓬堿可以導致HSC-T6的線粒體膜電位下降,發生凋亡。

流式細胞術檢測結果顯示二氫辣椒堿組、去氫駱駝蓬堿組、異莨菪亭組的凋亡率分別為(59.00±3.90)%、(86.87±8.80)%、(37.17±4.71)%。異莨菪亭組與正常組相比,細胞凋亡率升高(P<0.05),二氫辣椒堿組、去氫駱駝蓬堿組與正常組相比細胞凋亡率顯著升高(P<0.05、P<0.001),表明二氫辣椒堿、去氫駱駝蓬堿、異莨菪亭可以促進肝星狀細胞的凋亡(見圖7C)。

2.8 單體化合物對Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的影響

與正常組相比,模型組HSC-T6細胞上清Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的含量顯著增加(P<0.05);與模型組相比,去氫駱駝蓬堿組Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的含量均顯著降低(P<0.05),二氫辣椒堿組的HA和PCⅢ含量顯著降低(P<0.05),異莨菪亭組和水飛薊賓組HA的含量顯著降低(P<0.05)(見圖8)。

圖8 化合物對HSC-T6細胞上清Ⅳ-C、HA、LN和PCⅢ的影響Fig.8 Effects of compounds on IV-C,HA,LN and PCIII in the supernatant of HSC-T6

2.9 Western blot結果

二氫辣椒堿組和去氫駱駝蓬堿組Bax/Bcl-2相對表達量與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)。模型組HSC-T6中Caspase3相對表達量高于正常組。二氫辣椒堿組和去氫駱駝蓬堿組Caspase3相對表達量顯著高于模型組(P<0.01、P<0.001),異莨菪亭組和水飛薊賓組Caspase3相對表達水平與模型組相比沒有顯著性(見圖9)。

圖9 化合物對HSC-T6細胞Bax、Bcl-2、Caspase3的影響Fig.9 Effects of compounds on Bax,Bcl-2 and Caspase3 in HSC-T6

3 討論與結論

中藥多靶點多成分的協同作用已成為中藥研究的熱點。藥效成分研究是藥物研究的基礎,其活性成分及作用方式均存在復雜性的特點。2002年,李戎提出譜效關系理論,為中藥藥效研究指明新的研究方向[16]。本研究在茴香根皮醇提取物和不同萃取物UPLC-Orbitrap-MS/MS圖譜共有峰與其抗肝纖維化作用數據量化的基礎上,采用偏最小二乘法和灰色關聯分析對茴香根皮總離子流圖譜共有峰與抗肝纖維化作用的大小進行相關性研究,可較大程度反映成分對藥效的貢獻作用。

本研究以茴香根皮醇提物、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水部位為研究對象,開展高效液相色譜聯用質譜分析,構建茴香根皮液質圖譜,正負離子模式共標定了58個共有峰,分析圖譜,可見各樣品的共有峰面積有差別,可用于譜效關系研究。譜效關系分析有11種成分對抗肝纖維化作用的貢獻較大(VIP>1和回歸系數>0)。其中,已有文獻報道具有抗肝纖維化作用的化合物有沒食子酸、芹菜素、山柰酚、秦皮乙素、東莨菪內酯和大黃酸等[17-22],體現了茴香根皮多成分多靶點發揮抗肝纖維化作用的特點。去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿和異莨菪亭是首次在茴香根皮中發現含量相對較高且具有較好抗肝纖維化活性的化合物,可能為潛在質量標志物。其中去氫駱駝蓬堿可能通過降低肺組織中TGF-β1、Smad3和NF-кB p65的表達改善細粒棘球蚴繼發感染引起的小鼠肺組織纖維化[23]。二氫辣椒堿和異莨菪亭抗肝纖維化的研究尚未見報道。

Bcl-2屬于抗凋亡基因,是協調細胞生命和死亡的關鍵因子[24],Bax屬于促凋亡基因,是Bcl-2家族的促凋亡蛋白[25]。caspase3作為細胞凋亡的重要效應因子,是細胞凋亡蛋白酶級聯反應的必由之路,其被激活預示著凋亡步入不可逆階段[26]。在凋亡中,Bax/Bcl-2的比值是衡量細胞經線粒體途徑凋亡的重要指標,Bax/Bcl-2比值升高時,凋亡增加;反之,凋亡減少。當細胞感受到凋亡信號后,可以通過調控Bcl-2、Bax等凋亡因子的表達而活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase9),進而激活Caspase3,引發Caspase家族級聯反應,從而誘導細胞凋亡。本研究通過實驗證實,去氫駱駝蓬堿、二氫辣椒堿可以降低活化肝星狀細胞內線粒體功能并打破線粒體膜電位平衡,使促凋亡因子(Bax)被大量釋放,最終導致細胞凋亡,減少肝星狀細胞的增殖,抑制細胞外基質和α-平滑肌激動蛋白的表達,從而減輕肝纖維化[27,28]。在后續的實驗中,需要對篩選出的單體化合物進行體內實驗驗證,在mRNA和蛋白水平上進一步研究茴香根皮單體化合物抗肝纖維化的作用機制。

綜上所述,本研究通過采用UPLC-Orbitrap-MS/MS技術聯合偏最小二乘法和灰色關聯分析闡明了茴香根皮的抗肝纖維化的可能成分,體現了茴香根皮多成分多靶點抗肝纖維化的作用特點,對于明確中藥藥效物質基礎研究和中藥質量標準的提升具有重要意義,為進一步了解其作用機制和臨床應用提供參考依據。