HMGN5基因與子宮內膜癌臨床病理特征及生物學行為的關系

鄭雪群 李文怡 蘭麗芳

(柳州市人民醫院婦科,廣西 柳州 545000)

子宮內膜癌是常見的女性惡性腫瘤疾病,具有較高的發病率,預后較差〔1,2〕。子宮內膜癌患者復發率高和預后差主要是由于腫瘤細胞的侵襲和轉移〔3〕。近期,高遷移率族核小體結合域(HMGN)5成為研究熱點,研究發現HMGN5蛋白在前列腺癌、膀胱癌及乳腺癌中均有較高的表達,而且與神經膠質瘤及胃腸道腫瘤大發生發展相關,但是針對HMGN5與子宮內膜癌患者的相關性及與癌細胞侵襲轉移相關性研究較少〔4,5〕。本研究分析HMGN5基因在不同臨床特征下表達差異及其對腫瘤細胞生物學行為的影響。

1 資料與方法

1.1基本資料 選擇柳州市人民醫院2020年1月到2021年6月收治的子宮內膜癌患者79例,均進行根治性切除術,患者年齡平均(54.8±9.2)歲,其中存在淋巴轉移患者14例,高、中、低分化患者分別有40、25、14例,國際婦產科學聯合會(FIGO)分期Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別有45、16、12、6例。

患者納入標準:(1)均經過組織病理診斷;(2)術前均沒有接受過放化療治療。排除標準:(1)重要器官嚴重障礙;(2)精神障礙;(3)同時患有其他類型腫瘤;(4)臨床資料不全。本研究已獲得倫理審批;患者或其家屬均已自愿簽訂知情同意書。

1.2試劑和儀器 胎牛血清(批號:1907128)、胰蛋白酶(批號:1978483)、DMEM培養基(批號:8119335)由美國Sigma公司提供,人子宮內膜癌HEC-1A細胞由科院上海生物細胞庫提供,Trizol試劑盒(批號,20191108)購自美國Invitrogen公司,聚合酶鏈式反應(PCR)試劑盒(批號:20181106)和反轉錄(RT)試劑盒(批號:18021803)購自日本TaKaRa公司,β-actin(批號:18120736)和HMGN5(批號:19208371)由上海生工生物工程股份有限公司提供,HMGN5對照序列(批號:19-W-190932)和干擾序列(19-W-191023)由上海瑞賽生物技術公司提供,CCK-8試劑盒(批號:19111863)由美國Promega公司提供,基質膠(批號:19091284)和Transwell小室(批號:12319042)由美國BD公司提供。

1.3HMGN5 mRNA表達量檢測 取子宮內膜癌組織及癌旁組織,勻漿、裂解、離心處理后,提取總RNA,而后按照試劑盒說明反轉錄cDNA,應用RT-PCR法測定HMGN5 mRNA的表達情況(相對量)。反應體系配制:10 mmol/L的上下游引物0.5 μl(HMGN5上游引物:5′-TACAACAATGCC-CAAAAGAAAGGCT-3′,下游5′-TGTAACTGGCACAAGCATAGCAGA-3′;β-actin上游引物:5′-CCACACCTTCTACAATGAGC-3′,下游5′-TGAGGTAGTC-AGTCAGGTCC-3′)。加入含SYBR Green Ⅰ (12.5 μl),cDNA(0.5 μl),RoxⅡ(0.5 μl)及滅菌水(11.0 μl)的混合溶液中。擴增循環參數設置:3 min 95 ℃,15 s 95 ℃,30 s 58 ℃,30 s 73 ℃,共進行38個循環,10 min 72 ℃。應用2-△△Ct法計算HMGN5 mRNA相對表達量。

1.4細胞培養 HEC-1A細胞復蘇后在10%胎牛血清DMEM培養集中進行培養。培養環境為37 ℃,5%CO2飽和濕度培養箱,待細胞長至80%～90%時用胰酶消化進行傳代。取對數期細胞隨機將其分為HMGN5促進組〔轉染NMGN5干擾序列(正義鏈:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGACAATT-3′)〕、HMGN5正常組〔轉染HMGN5干擾對照序列(正義鏈5′-CACAGCCTTTCTTTAGCATTT-3′,反義鏈5′-GTGTCGGAAAGAAATCGTATT-3′)〕和空白對照組(不做處理),轉染48 h。

1.5HEC-1A細胞中HMGN5 mRNA表達 將細胞裂解液分別加入3組細胞中,總RNA提取、cDNA反轉錄、RT-PCR及HMGN5 mRNA相對表達量檢測方法同1.4。

1.6細胞增殖檢測 將3組細胞(100 μl)接種于96孔板中,細胞培養箱中培養后轉染48和96 h,然后加入CCK-8液進行阻斷,應用酶標儀檢測450 nm波長處OD值。

1.7細胞遷移檢測 將HEC-1A細胞進行胰蛋白酶消化后接種于6孔板,垂直板底畫一條直線,沖洗掉滑落細胞,然后加入無血清培養基培養0、12和24 h后,用倒置顯微鏡拍照并用ImageJ軟件計算劃痕愈合率(基線劃痕寬度與檢測時間點劃痕寬度差值/基線劃痕寬度)。

1.8細胞侵襲檢測 應用無血清培養液對基質膠進行稀釋,鋪于Transwell小室,備用。將轉染48 h細胞轉移到Transwell小室上室,下室中加入20%胎牛血清的培養液,培養48 h,沖洗后進行固定,加入結晶紫孵育30 min進行染色,高倍顯微鏡下隨機選5個視野,計算細胞數。

1.9統計學分析 應用SPSS20.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、方差分析和LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1不同組織HMGN5 mRNA相對表達比較 子宮內膜癌組織HMGN5 mRNA相對表達量(4.56±0.32)顯著高于癌旁組織(1.34±0.26,n=79;t=37.21,P<0.01)。

2.2HMGN5在不同臨床特征下表達情況比較 不同年齡、FIGO分期、分化程度、淋巴結轉移與否及基層浸潤程度組間的HMGN5的相對表達量均具有統計學差異(P<0.05)。見表1。

表1 HMGN5表達與子宮內膜癌臨床病理特征關系

2.3HEC-1A細胞HMGN5 mRNA相對表達量及增殖活力比較 轉染后,與空白對照組和HMGN5正常表達組相比,HMGN5 促進組具有較高的HMGN5 mRNA的表達量及增殖活力OD值,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 HEC-1A細胞不同HMGN5 mRNA相對表達量及細胞增殖活力

2.4HEC-1A細胞遷移及侵襲能力對比 與空白對照組和HMGN5正常表達組相比,HMGN5促進組轉染培養12和24 h劃痕愈合率和侵襲細胞數量均顯著較高(P<0.05)。見表3,圖1。

表3 HEC-1A細胞遷移及侵襲能力

圖1 各組HEC-1A細胞遷移、侵襲

3 討 論

子宮內膜癌在絕經后女性中發病率較高,伴隨著診療技術的不斷提高,子宮內膜癌患者的5 年生存率也逐漸升高,但是也有部分低分化及轉移患者會出現預后不佳的情況〔6,7〕。前期研究表明,患者絕經時間、月經初潮時間及雌激素水平等均是子宮內膜癌的危險因素〔8〕。臨床上子宮內膜癌的主要治療方式是手術治療,化療和放療等治療方式常作為輔助治療,但是治療效果一般〔9〕。

前期研究顯示,HMGN5基因在多種人類腫瘤中均呈現異常高表達;另有文獻顯示抑制HMGN5基因的表達可以明顯抑制前列腺癌細胞的增殖〔10,11〕;激活HMGN5基因后,會顯著促進膀胱癌細胞的增殖及侵襲〔12,13〕;抑制HMGN5基因的表達后,腎癌細胞及肺癌細胞的增長和侵襲顯著降低〔14,15〕;另有研究顯示,HMGN5基因在乳腺癌患者的癌癥組織中呈現高表達,且可以促進乳腺癌細胞的侵襲和增殖〔16,17〕;骨肉瘤研究發現,抑制HMGN5基因的表達后對細胞周期具有阻滯作用,且對阿霉素誘導細胞凋亡的敏感性具有一定的抑制作用〔18,19〕。但是HMGN5基因在子宮內膜癌中的表達和作用還未有明確研究〔20〕。本研究提示,HMGN5表達上調與子宮內膜癌的病情進展相關,前期研究也表明,HMGN5所誘導的轉錄變化和細胞核小體的相互作用相關,該蛋白的異常表達和致瘤性增加相關,是一種強有力的原癌基因〔21〕。

本研究結果表明,提高HMGN5基因表達會促進人子宮內膜癌HEC-1A細胞增殖;HMGN5基因能夠促進人子宮內膜癌的侵襲和遷移能力;HMGN5基因在人子宮內膜癌發生發展過程中具有關鍵作用,HMGN5與細胞內染色質纖維完整性有相關性,其表達異常會損害細胞,參與腫瘤發生與發展。前期研究〔22〕與本研究結果相吻合,在正常肺組織中HMGN5低表達,而在肺癌細胞中相對高表達。對細胞中HMGN5基因進行抑制后,對肺癌LRNAI(-)aP細胞系生長有著明顯抑制作用,其能夠降低G2/M+S期細胞數量。

綜上,人子宮內膜癌腫瘤組織中HMGN5呈現較高表達,對HMGN5基因進行促進對人子宮內膜癌HEC-1A細胞的增殖、遷移和侵襲有明顯促進作用。HMGN5能夠作為促癌基因在人子宮內膜癌的發生和發展過程中起著舉足輕重的作用,其可能成為治療子宮內膜癌靶向的靶點,但是仍需要深入研究HMGN5對人子宮內膜癌的具體作用機制。