靈芝提取物通過miR-143-3p對Aβ25～35誘導的神經細胞損傷的影響

馬玲 鐘利國 崔裕如 劉彬

(荊州市第一人民醫院 1中醫科,湖北 荊州 434000;2科研科)

阿爾茨海默病(AD)是一種中樞神經系統退行性疾病,其發病機制較為隱匿,神經細胞凋亡、大腦皮層等形成神經纖維纏結是AD的主要病理特征〔1〕。β淀粉樣蛋白 (Aβ)25～35聚集與沉積可促進神經細胞凋亡從而促進AD的發生〔2〕。研究表明,部分中藥的活性成分或提取物具有抗炎、抗氧化等作用,并可用于治療AD〔3,4〕。靈芝可減緩AD患者神經退行性疾病,并可改善患者的非運動癥狀,研究表明,靈芝提取物可減輕1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)誘導的神經細胞損傷〔5〕。但靈芝提取物與Aβ25～35誘導的神經細胞損傷的相關研究尚未見報道。miR-143-3p在AD細胞模型中表達水平升高,抑制其表達可促進神經細胞存活〔6〕。本研究通過Aβ25～35誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞PC12建立AD細胞模型,探討靈芝提取物通過調控miR-143-3p表達對Aβ25～35誘導的PC12細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 西安瑞仁生物技術有限公司提供靈芝提取物;上海弘順生物科技有限公司提供大鼠腎上腺嗜鉻細胞PC12;美國Invitrogen提供LipofectamineTM3000轉染試劑;北京天根生化科技有限公司提供miRNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒及SYBR Green試劑盒;北京索萊寶提供噻唑藍(MTT)試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒;南京建成生物工程研究所提供丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒;武漢艾美捷提供兔抗鼠酶切的胱天蛋白酶(Cleaved-caspase)3、Cleaved-caspase9抗體購自;美國Santa Cruz提供內參GAPDH抗體與二抗。

1.2實驗分組 PC12細胞接種于96孔板,用20 μmol/L的Aβ25～35處理PC12細胞24 h〔7〕建立AD細胞模型(Aβ25～35組),control組為未經Aβ25～35處理細胞;分別加入含有不同濃度(0.1、1.0、10.0 mg/L)靈芝提取物〔8〕與20 μmol/L Aβ25～35的DMEM培養基培養24 h,分別記為Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組。另設置Aβ25～35+anti-miR-NC 組(轉染anti-miR-NC后,用20 μmol/L的Aβ25～35處理PC12細胞24 h)、Aβ25～35+anti-miR-143-3p 組(轉染anti-miR-143-3p后,用20 μmol/L的Aβ25～35處理PC12細胞24 h);參照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書將miR-NC、miR-143-3p mimics分別轉染至PC12細胞,轉染成功后加入含有濃度為10 mg/L靈芝提取物與20 μmol/L Aβ25～35的DMEM培養基培養24 h,分別記為Aβ25～35+GLE+miR-NC組、Aβ25～35+GLE+miR-143-3p組。

1.3MTT檢測 PC12細胞接種在96孔板中,按1.2法處理細胞,培養2 d后,每孔中加入20 μl MTT試劑,繼續反應4 h倒掉培養液,每孔中加150 μl 二甲基亞砜(DMSO)試劑,于酶標儀490 nm處檢測吸光度(OD)值。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞,加入1×結合緩沖液將細胞重懸,加膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和碘化丙啶(PI)試劑5 μl,避光反應15 min,上流式細胞儀檢測。

1.5MDA含量和SOD、CAT活性檢測 取各組PC12細胞,裂解后取上清液,檢測MDA含量、SOD和CAT活性。

1.6實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測miR-143-3p表達水平 采用miRNA提取試劑盒分別提取PC12細胞總RNA,反轉錄合成cDNA,以cDNA為模板進行RT-qPCR擴增,應用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測miR-143-3p相對表達量。

1.7Western印跡檢測Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達 提取各組PC12細胞總蛋白,取30 μg蛋白經Cleaved-caspase3(1∶1 000)、Cleaved-caspase9(1∶1 000)電泳分離、轉膜、封閉后,與GAPDH抗體(1∶2 000)4 ℃孵育24 h,再與二抗稀釋液(1∶3 000)37 ℃孵育2 h,分析條帶灰度值。

1.8統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1靈芝提取物對Aβ25～35誘導的PC12細胞增殖、凋亡的影響 與control組比較,Aβ25～35組細胞活力明顯降低,細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達明顯升高(P<0.05);與Aβ25～35組比較,Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組細胞活力明顯升高,細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達明顯降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見圖1、圖2、表1。

1～9:control組、Aβ25～35組、Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組、Aβ25～35+anti-miR-NC組、Aβ25～35+anti-miR-143-3p組、Aβ25～35+GLE+miR-NC組、Aβ25～35+GLE+miR-143-3p組

圖2 靈芝提取物對PC12細胞凋亡的影響

2.2靈各組PC12細胞中MDA水平及SOD、CAT活性比較 與control組比較,Aβ25～35組MDA水平明顯升高,SOD、CAT活性明顯降低(P<0.05);與Aβ25～35組比較,Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組MDA水平明顯降低,SOD、CAT活性明顯升高,且呈劑量依賴性(P<0.05),見表1。

2.3各組PC12細胞中miR-143-3p表達比較 與control組比較,Aβ25～35組miR-143-3p表達量明顯升高(P<0.05);與Aβ25～35組比較,Aβ25～35+GLE-L組、Aβ25～35+GLE-M組、Aβ25～35+GLE-H組miR-143-3p的表達量明顯降低,且呈劑量依賴性(P<0.05),見表1。

表1 靈芝提取物對PC12細胞增殖、凋亡和細胞中MDA含量、SOD、CAT活性及miR-143-3p表達的影響

2.4過表達或抑制miR-143-3p轉染效率 與miR-NC組(1.00±0.04)比較,miR-143-3p組miR-143-3p表達量(2.29±0.17)顯著升高(t=22.160,P<0.05);與anti-miR-NC組(0.98±0.08)比較,anti-miR-143-3p組miR-143-3p表達量(0.39±0.06)明顯降低(t=17.700,P<0.05)。

2.5抑制miR-143-3p對Aβ25～35誘導的PC12細胞增殖、凋亡、MDA含量及SOD、CAT活性的影響 與Aβ25～35+anti-miR-NC組比較,Aβ25～35+anti-miR-143-3p組細胞活力明顯升高,細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達、MDA水平明顯降低,SOD、CAT活性明顯升高(P<0.05),見圖1、圖3、表2。

圖3 抑制miR-143-3p對PC12細胞凋亡的影響

表2 抑制miR-143-3p對PC12細胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影響

2.6miR-143-3p對靈芝提取物處理的Aβ25～35誘導的PC12細胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影響 與Aβ25～35+GLE+miR-NC組比較,Aβ25～35+GLE+miR-143-3p組細胞活力明顯降低,細胞凋亡率和Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9蛋白表達MDA水平明顯升高,SOD、CAT活性明顯降低(P<0.05),見圖1、表3、圖4。

表3 miR-143-3p對靈芝提取物處理的PC12細胞增殖、凋亡、MDA含量、SOD、CAT活性的影響

圖4 miR-143-3p對靈芝提取物處理的PC12細胞凋亡的影響

3 討 論

miRNA在AD細胞模型中表達異常,為AD的潛在治療靶點〔9,10〕。靈芝提取物可通過抗氧化作用,減輕角質形成細胞和MPP+誘導的神經元損傷〔11,12〕。靈芝提取物可減輕缺氧誘導的神經細胞損傷〔13〕。本研究結果與既往研究報道結果相似〔14,15〕,提示靈芝提取物可抑制Aβ25～35誘導的PC12細胞氧化應激。

缺糖缺氧誘導的腦微血管內皮細胞中miR-143-3p表達水平升高〔16〕。miR-143-3p表達下調可減輕缺血性腦卒中損傷并保護星形膠質細胞〔17〕。抑制miR-143-3p表達可減輕腦缺血/再灌注損傷〔18〕。本研究結果顯示,靈芝提取物可能通過抑制miR-143-3p表達而減輕Aβ25～35誘導的PC12細胞損傷,抑制miR-143-3p表達可促進Aβ25～35誘導的PC12細胞增殖及抑制細胞凋亡、氧化應激,而miR-143-3p過表達可減弱靈芝提取物對Aβ25～35誘導的PC12細胞損傷的作用。

綜上,靈芝提取物可通過抑制miR-143-3p表達而促進Aβ25～35誘導的PC12細胞增殖及抑制細胞凋亡、氧化應激從而減輕細胞損傷,miR-143-3p可能作為靈芝提取物治療AD的潛在靶點。