蒙藥協(xié)日嘎-4湯對糖尿病腎病大鼠腎保護作用及腎組織單核細胞趨化蛋白-1表達

劉薩仁 佟玉清 玉曉 張春花

(內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙醫(yī)內(nèi)分泌科,內(nèi)蒙古 通遼 028000)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥,導致終末期腎衰竭和糖尿病病死率增加的重要因素,該病治療費用高且難度大。因此采取有效措施治療DN,具有重要的臨床意義。DN發(fā)病機制復雜多樣,炎癥因子在DN發(fā)病機制中起至關重要作用〔1〕。協(xié)日嘎-4湯是具有抗炎作用的傳統(tǒng)蒙藥制劑,本研究旨在觀察蒙藥協(xié)日嘎-4湯對DN大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、C反應蛋白(CRP)含量及腎組織單核細胞趨化因子(MCP)-1表達的影響,探討蒙藥協(xié)日嘎-4湯對DN腎保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 Wistar大鼠雄性,體質(zhì)量(200±10)g,8周齡,購自遼寧長生生物技術有限公司,許可證號:SCXX(遼)2015-0001。

1.2實驗儀器 BS-200邁瑞全自動生化分析儀(深圳市永利鑫科技有限公司),羅氏卓越型血糖儀(上海三葳醫(yī)療設備有限公司),DW-GL218低溫冰箱,電子天平(AUY120日本島津),PCRYD-202AIII型冷凍切片機(河南鄭州南北儀器有限公司),DW-GL218低溫冰箱(上海能共實業(yè)有限公司),CKX-RFA熒光顯微鏡(上海普赫光電科技有限公司)。

1.3實驗藥物 鏈脲佐菌素(S17049-5 g,上海源葉生物技術有限公司)。蒙藥協(xié)日嘎-4湯(準字號:20180704,由內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室)。依那普利片(準字號:H20083534,上海新亞藥業(yè)閔行有限公司)。0.05 ml/L pH4.4枸櫞酸鹽緩沖液(批準字號:R22479-500 ml,上海源葉生物技術有限公司)。尿蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海仁捷生物科技有限公司)。大鼠腎功能ELISA試劑盒(南京搏爾塞生物科技有限公司)。炎癥因子ELISA試劑盒(上海滬震實業(yè)有限公司)。

1.4動物模型制備 60只大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后,隨機選10只大鼠作為正常對照組用普通飼料喂養(yǎng),其余50只高脂飼料喂養(yǎng)4 w,在空腹10 h狀態(tài)下腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg,72 h后尾靜脈取血,連續(xù)2次檢查血糖均>16.7 mmol/L為糖尿病模型復制成功,繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)2 w后連續(xù)2次檢查尿微量白蛋白30 mg/24 h以上時即為DN模型成功。

1.5分組及給藥方法 將造模成功的50只鼠隨機分為5組:模型組、陽性對照組、協(xié)日嘎-4湯低、中和高劑量組。陽性對照組給予依那普利1.5 mg/(kg·d)灌胃,蒙藥協(xié)日嘎-4湯低、中、高劑量組分別給予協(xié)日嘎-4湯0.45、0.90、1.80 g/(kg·d)灌胃,正常對照組和模型組分別給予同等體積生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)灌胃給藥8 w。實驗期間大鼠自由進食和飲水。每日測量1次大鼠尾靜脈血糖,如果血糖大于24 mmol/L時給予皮下注射長效胰島素1～2 U,避免發(fā)生糖尿病急性并發(fā)癥而死亡。

1.6檢測指標 治療8 w末次給藥后用代謝籠收集24 h尿液,記錄總尿量、監(jiān)測尿蛋白,各組均用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉,取腹主動脈血,全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr),ELISA測定血清TNF-α、IL-6、CRP含量。蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察腎組織病理學變化。免疫組化(SP)法檢測MCP-1蛋白表達。

1.7統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0軟件進行方差分析、t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1各組24 h尿蛋白、血清BUN、Scr比較 與正常對照組比較,模型組24 h尿蛋白定量及血清BUN、Scr水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,各治療組24 h尿蛋白及血清BUN、Scr均明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.2各組血糖比較 與正常對照組比較,模型組空腹血糖(FBS)明顯升高(P<0.01)。見表1。

表1 各組24 h尿蛋白定量及血清BUN、Scr的比較

2.3各組血清炎癥因子TNF-α、IL-6 、CRP比較 與正常對照組比較,模型組血清炎癥因子TNF-α、IL-6、CRP含量均明顯升高(P<0.01);與模型組比較,各治療組血清炎癥因子TNF-α、IL-6、CRP含量明顯下降(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組血清TNF-α、IL-6、CRP含量比較

2.4各組腎組織病理變化比較 正常對照組腎小球結構清晰,形態(tài)正常,腎小管結構清晰無管型;模型組腎小管可見上皮細胞較多空泡變性,腎小管管腔可見蛋白管型和細胞管型,腎小球基底膜增厚、系膜增生改變。陽性對照組部分腎小管可見上皮細胞空泡變性及腎小球基底膜增厚、系膜增生改變。協(xié)日嘎-4湯低劑量組較多腎小管可見上皮細胞空泡變性及腎小球基底膜增厚,系膜增生改變。協(xié)日嘎-4湯中劑量組部分腎小管可見上皮細胞空化空泡變性及腎小球基底膜增厚、系膜增生改變。協(xié)日嘎-4湯高劑量組偶見腎小管上皮細胞空泡變性及腎小球基底膜增厚、系膜增生改變。腎臟損傷程度由重到輕依次為模型>低劑量組>中劑量組>陽性對照組>高劑量組。見圖1。

圖1 各組腎組織病理(HE染色,×400)

2.5各組腎組織MCP-1表達比較 5組腎組織MCP-1表達差異有統(tǒng)計學意義(n=5,F=7.632,P<0.01);正常對照組腎組織MCP-1表達(0.16±0.01)極少,與模型組(0.46±0.06)比較,陽性對照組、協(xié)日嘎-4湯低、中、高劑量組腎組織MCP-1表達顯著降低(0.26±0.05、0.28±0.05、0.25±0.05、0.22±0.02,P<0.05,P<0.01)。見圖2。

圖2 各組腎組織MCP-1表達(SP,×400)

3 討 論

DN的發(fā)生涉及多種因素,如遺傳因子、腎小球超濾、氧化應激、晚期糖基化終末產(chǎn)物蓄積、蛋白激酶C活化、多元醇通路激活、細胞因子及炎癥反應等〔2〕。近年來,許多實驗和臨床研究〔3～5〕均證實,炎癥在DN發(fā)病機制中的關鍵作用,高血糖、非酶糖化與晚期糖基化終末產(chǎn)物的生成、血管緊張素-Ⅱ、氧化應激反應等激活腎臟局部的炎癥細胞,活化的炎癥細胞及其釋放的各種炎癥因子如TNF-α、IL-6、CRP、MCP-1等引起細胞膜脂質(zhì)過氧化,導致腎血管收縮和腎組織損傷。MCP-1通過刺激炎癥介質(zhì)IL-1,IL-6、TNF-α釋放,產(chǎn)生氧自由基,發(fā)生炎癥反應,促進腎小管上皮細胞變性壞死、腎小球系膜細胞增生增殖,加速腎小球硬化,從而促進DN的發(fā)生發(fā)展〔6〕。

蒙藥協(xié)日嘎-4湯是古籍文獻所記載的傳統(tǒng)蒙藥方劑,廣泛應用于防治腎臟、膀胱和尿路疾病等。具有抑菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、利尿、鎮(zhèn)痛作用〔7〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)協(xié)日嘎-4湯具有降低DN患者24 h尿微量白蛋白及改善腎功能作用〔8〕。協(xié)日嘎-4湯由姜黃、黃柏、蒺藜、梔子四味藥組成。現(xiàn)代藥理學研究證實黃柏具有降血糖、抗炎、解熱、抗氧化作用〔9〕。姜黃主要成分姜黃素具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎抗菌、降血糖等藥理作用。其抗炎作用可能是與抑制NF-κB信號通路,減少TNF-α的分泌有關〔10～12〕。劉毅等〔13〕通過姜黃素對慢性不可預知性刺激誘發(fā)小鼠腎損傷的保護作用及機制研究,證實姜黃素具有降低炎性浸潤,保護腎功能作用。梔子苷也具有抗炎、抗氧化、降血脂和降血糖等多種藥理活性,尤其通過降低IL-1β、TNF-α水平,減少炎癥遞質(zhì)和炎癥因子的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)多種信號通路發(fā)揮抗感染和免疫調(diào)節(jié)作用〔14〕。

本研究結果提示,協(xié)日嘎-4味湯能延緩DN大鼠腎臟損傷進展,具有腎保護作用,其機制可能與協(xié)日嘎-4湯通過下調(diào)腎組織MCP-1的表達來減輕糖尿病腎病的炎癥狀態(tài)有關。協(xié)日嘎-4湯通過哪些途徑下調(diào)MCP-1表達的作用機制,還有待探索。