高壓氧治療對老年大鼠創傷性腦損傷后神經功能的改善作用及相關機制

於睿 汪東亮

(宿遷市第一人民醫院 1高壓氧科,江蘇 宿遷 223800;2急診科)

創傷性腦損傷已成為歐美國家的第三大致死原因,雖然在我國發病率低于歐美國家,但近年來也呈上升趨勢〔1〕。老年人已進入衰老階段,顱骨硬化導致對外力的緩沖能力下降,更易發生骨折且腦損傷較嚴重〔2〕。創傷性腦損傷具有很高的致殘率和致死率,腦損傷后神經功能變化情況直接影響患者的預后水平〔3〕。高壓氧治療雖已在臨床應用了較長時間,取得了一定治療效果,能夠降低患者致殘率、減輕腦水腫程度、縮短意識障礙時間,提高患者生存率〔4〕;但關于高壓氧治療對老年創傷性腦損傷后神經功能的改善作用及相關機制的研究仍十分少見。本研究通過建立老年大鼠創傷性腦損傷模型,探討高壓氧治療對創傷性腦損傷后神經功能的改善作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1動物與主要試劑 雄性SD大鼠90只,20～24月齡,平均體質量(350±20)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SYXK(京)2022-0019,每日12 h光照,自由進食、進水。放射免疫沉淀(RIPA)裂解液購于北京賽文創新生物科技有限公司;鼠抗人腦源性神經營養因子(BDNF)單克隆抗體、兔抗人缺氧誘導因子(HIF)-α單克隆抗體、兔抗人半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3單克隆抗體、鼠抗人B細胞淋巴瘤(Bcl)-2單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體及山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG均購于上海銘修生物科技有限公司。

1.2創傷性腦損傷模型制作與分組 腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠,劑量為50 mg/kg,在大鼠右側顱頂鉆開1個骨窗(直徑約5 mm),保持硬膜的完整性,使用自由落體打擊裝置(沖擊物30 g,自有落體高度15 cm)制作腦挫裂傷模型,骨蠟封閉骨窗,縫合頭皮,繼續常規喂養。將90只大鼠隨機分為假手術組(只開顱、不打擊,開顱后骨蠟封閉骨窗、縫合)、模型組、高壓氧治療組(造模后進行高壓氧治療),每組30只,各組內再根據研究時間窗分為12、24、48、72、120 h 5個亞組,每組6只。

1.3高壓氧治療方案 使用高壓氧動物試驗艙進行治療,實驗前先使用純氧洗艙約5 min,檢測高壓氧艙中氧濃度高于96.6%,二氧化碳濃度低于0.05%后將高壓氧治療組放入艙內,設置壓力0.2 MPa,給氧方式選擇直排式,氧流量設置為5 L/min,溫度控制在23～25 ℃,連續純氧通風30 min后勻速調節壓力至常壓后出艙,每次12 h,每日固定時間段進出艙。

1.4水迷宮實驗 待高壓氧治療組治療結束后,3組大鼠各取6只進行水迷宮定位巡航實驗和空間探索試驗。定位巡航實驗:實驗前1 d大鼠在水池中自由游泳90 s,實驗時間共5 d,每日訓練4次,記錄大鼠逃離潛伏期。第5天末次定位巡航實驗結束后2 h進行空間探索試驗,將水池中的站臺取出,記錄120 s內大鼠穿越原站臺位置的次數、首次到達原平臺時間。

1.5大鼠神經運動功能評分 參照Yakovlev等〔5〕方法并略加調整,評分系統包括4種動作:①大鼠在切坡站立5 s,根據完成時斜坡角度依次為正常(45 °)、輕度不能(30 °)、中度不能(15 °)、重度不能(<15 °);②大鼠可通過寬度1 cm(正常)、2 cm(輕度不能)、3 cm的平衡木(中度不能)、無法通過寬度3 cm的平衡木(重度不能);③提起大鼠尾巴的同時,測量大鼠外傷對側前肢的反屈程度,依次計正常(90 °)、輕度不能(60 °)、中度不能(30 °)、重度不能(<30 °);④觀察大鼠自發運動時的轉圈行為,依次計正常(180 °)、輕度不能(120 °)、中度不能(60 °)、重度不能(<60 °)。正常計4分、輕度不能計3分、中度不能2分、重度不能1分。

1.6取材與處理 分別于腦外傷后12、24、48、72、120 h處死對應亞組大鼠,取大腦組織,留取海馬組織后稱濕質量,之后放入烤箱中105 ℃烘干24 h后稱干質量,計算腦組織含水量(%)=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。海馬組織常規進行石蠟包埋,用于BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白檢測。

1.7Western印跡檢測大鼠海馬區BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達 放射免疫沉淀(RIPA)細胞裂解液提取3組海馬區BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白濃度,行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳,電轉法將目標蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜,使用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉1 h,滴加鼠抗人BDNF單克隆抗體(稀釋倍數1∶500)、兔抗人HIF-α單克隆抗體(稀釋倍數1∶1 000)、兔抗人Caspase-3單克隆抗體(稀釋倍數1∶300)、鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(稀釋倍數1∶500)、鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋倍數1∶2 000),4 ℃孵培育過夜,次日滴加山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG,稀釋倍數1∶4 000,室溫下1 h,電化學發光法(ECL)顯影,使用ImageJ軟件讀取各條帶灰度值。

1.8統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組水迷宮實驗結果 各組第5天逃避潛伏期、穿越原站臺位置次數、首次到達原平臺時間差異均有統計學意義(P<0.01);其中模型組第5天的逃避潛伏期、首次到達原平臺時間明顯長于假手術組,穿越原站臺位置次數明顯少于假手術組;高壓氧治療組第5天逃避潛伏期、首次到達原平臺時間明顯短于假手術組,穿越原站臺位置次數明顯多于假手術組(均P<0.01)。見表1。

表1 各組水迷宮實驗結果

2.2造模后不同時間點各組神經細胞凋亡情況比較 造模后24 h神經細胞凋亡比例達到峰值,之后逐漸下降;其中模型組神經細胞凋亡比例明顯高于假手術組,高壓氧治療組明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 造模后不同時間點各組神經細胞凋亡比較

2.3造模后不同時間點各組神經運動功能評分比較 隨著造模后時間的延長模型組、高壓氧治療組神經運動功能評分逐漸升高;其中模型組神經運動功能評分明顯低于假手術組(P<0.05);造模后24 h起高壓氧治療組明顯高于模型組(P<0.05)。見表3。

2.4各組腦組織含水量比較 造模后第5天各組腦組織含水量差異有統計學意義(P=0.028);其中模型組明顯高于假手術組,高壓氧治療組明顯低于模型組(均P<0.05)。見表3。

表3 造模后不同時間點各組神經運動功能評分及腦組織含水量比較

2.5各組海馬區BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平比較 各組海馬區BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平差異有統計學意義(P<0.05);模型組海馬區HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平明顯高于假手術組(P<0.01);高壓氧治療組大鼠海馬區BDNF、Bcl-2蛋白表達水平明顯高于模型組,HIF-α、Caspase-3蛋白表達水平明顯低于模型組(P<0.05)。見圖1、表4。

圖1 各組海馬區BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達

表4 各組海馬區BDNF、HIF-α、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平比較

3 討 論

高壓氧治療是臨床常用的治療手段,能夠促進腦外傷修復,減輕腦水腫、神經元變性,降低患者致殘率和死亡率〔6〕。但目前關于高壓氧治療對老年創傷性腦損傷后神經功能的改善作用及相關機制鮮有研究報道。學習和記憶能力是人體最復雜的神經活動之一,腦部神經功能直接影響學習和記憶能力。動物行為學實驗中常用的工具包括Morris水迷宮、Y迷宮等,其中Morris水迷宮在空間記憶能力評估中優勢明顯,屬于長期記憶,由海馬區決定〔7〕。本研究結果表明,經高壓氧治療后大鼠的學習記憶能力明顯改善。

神經細胞凋亡參與了顱腦損傷后繼發損害的病理過程,是學習和記憶能力下降的主要原因之一〔8〕。當創傷性腦損傷后腦組織水腫、血管床破壞等原因會引發局部腦缺血、缺氧,激活線粒體介導的細胞凋亡途徑,引發神經細胞凋亡,神經運動能力降低〔9〕。腦水腫程度隨著損傷時間的延長逐漸減輕,側支循環也逐漸建立,在一定程度上恢復了損傷區域腦組織供血、供養,神經細胞凋亡比例逐漸下降,神經運動功能在一定程度上得到恢復〔10〕。高壓氧治療能夠有效抑制創傷性腦損傷后神經細胞凋亡、促進神經運動功能恢復,可能與提高血氧濃度,促進血流速度,增加腦組織對氧的利用有關〔11〕。顱腦損傷會引發腦水腫,進而損傷腦組織,影響正常生理代謝和血氮水平〔12〕。本研究結果提示,老年大鼠創傷性腦損傷后腦水腫程度明顯提升,高壓氧治療有助于減輕腦水腫程度。

BDNF屬于神經營養素家族,具有促神經生長活性〔13〕。相關研究顯示,BDNF具有神經保護作用,可促進受損神經組織的修復,減弱缺氧、自由基、細胞毒素等所致的腦損傷,作用機制包括維持鈣平衡和自由基代謝等〔14〕。BDNF低表達會減弱神經元對損傷的抵抗作用,減弱神經元修復、增生活性〔15〕。HIF-α表達水平與人體組織中的氧體積分數呈負相關,正常氧體積分數下HIF-α低表達,很難被檢測,在缺氧狀態下其表達明顯升高,可用于反映腦損傷程度〔16〕。目前已發現,線粒體途徑、死亡受體途徑等細胞內凋亡信號通路,活化凋亡執行因子Caspase-3是上述通路的重要步驟〔17〕。Bcl-2位于細胞器上游,調控下游Caspase-3活化,線粒體途徑中Bcl-2是抗凋亡的關鍵因子〔18〕。本研究結果提示,老年大鼠創傷性腦損傷后海馬區HIF-α、Caspase-3、Bcl-2高表達參與神經功能損傷的發生與發展過程。高壓氧治療可通過上調海馬區BDNF、Bcl-2表達,下調HIF-α、Caspase-3表達,來發揮抑制創傷性腦損傷后海馬區神經細胞凋亡,提高神經元修復、增生活性,進而改善神經功能。