鰻魚骨酶解及美拉德反應制備優質風味物工藝研究

劉家光

（福建正味生物科技有限公司，福建 福州 350015）

0 引言

鰻魚的營養價值非常高，被稱作是水中軟黃金，有“水中人參”之美譽[1,2]，2020年全國養殖鰻魚高達25.07萬t[3]。鰻魚是福建重要的淡水養殖品種之一，其含肉率高，肉質細滑，多以烤鰻的形式出口，然而在烤鰻的工業化深加工過程中，會產生大量的邊角料，如鰻魚頭、鰻魚內臟、鰻魚骨等[4]。歐洲鰻魚的魚骨占鰻魚質量10%以上，是鰻魚加工主要副產物之一[5,6]，但是，這些低值邊角料蘊含著豐富的營養物質，特別鰻魚骨是一種高級的營養食品，除蛋白質、氨基酸[7]和碳水化合物外，鈣、磷、鐵等多種無機鹽的含量也很高，鋅和硒含量相對較高[8]。然而，鰻魚被取肉后剩下骨頭又硬又鋒利，很難被食用，只有部分被簡單加工為骨粉添加到附加價值不高的普通魚飼料中，多數鰻魚骨頭都被作為廢棄物，這樣既浪費資源又污染環境。

有效地對這些低值的鰻魚下腳料進行精深加工并實現其高值化，是我們必須重視和解決的問題。鰻魚骨可以加工成飼料魚粉，提取膠原蛋白，提取可溶性鈣，制成保健食品、調味品等。本研究利用生物復合酶解技術對鰻魚骨進行酶解，將低值的鰻魚骨下腳料處理加工成富含骨膠原、多肽及氨基酸等功能因子的提取物產品，將酶解產物進行美拉德反應，利用調配、真空濃縮等技術開發生產出口感風味俱佳的鰻魚風味調味品。

本研究成果可以在餐飲、調味品、冷凍調理食品、香精、海鮮制品等領域作為安全的食品配料廣泛應用，鰻魚風味調味品是一種具有發展潛力和應用前景的食品添加劑，可以為鰻魚下腳料的高值化利用提供參考，提高鰻魚產業的經濟效益。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮鰻魚骨[勝田（福清）食品有限公司]；酶制劑（風味蛋白酶、復合蛋白酶）——夏盛(北京)生物科技開發有限公司；鹽酸（濟南佰科化工有限公司）；氫氧化鈉（濱化集團股份有限公司）；木糖（河南萬邦實業有限公司）。以上均符合相關產品衛生標準。

1.2 主要儀器與設備

LC-WB-4 恒溫水浴鍋(上海皓莊儀器有限公司)；TB-430振篩器(佛山市順德區天博機械有限公司)；PH-100B酸度計上海力辰儀器科技有限公司；DT-200槽型混合機(上海力辰儀器科技有限公司)；JJ-2 FK-A型組織搗碎勻漿機(上海鑫翁科學儀器有限公司)；RE-201D旋轉蒸發儀(上海耀特儀器設備有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 鰻魚骨酶解提取物工藝流程

原料選擇→清洗（去血水）→切斷、搗碎→酶解→滅酶→過濾→真空濃縮→成品

1.3.2 鰻魚骨酶解濃縮液加工工藝操作要點

1.3.1.1 原料的選擇及預處理⑴ 原料的選擇：選擇新鮮的鰻魚骨（歐洲鰻），天氣熱需放冷庫低溫冷藏，防止變質。

⑵ 預處理：新鮮的鰻魚骨用流動水進行漂洗30 min去血水，切成2 cm的小段，放入搗碎機中攪碎備用。

1.3.3.2 鰻魚骨酶解濃縮液的制備流程

根據之前的確定的酶解工藝制備鰻魚骨酶解濃縮液。鰻魚骨酶解濃縮液的酶解工藝參數為：蛋白酶質量為0.1%（復合蛋白酶和風味蛋白酶的質量比為1∶1）、料液比1∶1（g/mL）、酶解溫度50 ℃、酶解時間5 h。酶解結束后將酶解液升溫至96 ℃保持10 min滅去酶活性，60目過濾篩將酶解液濾出，除去酶解液的上層油脂，剩余骨渣丟棄。采用真空濃縮法（真空度-95 kPa，濃縮溫度55 ℃），將得到的鰻魚骨酶解液進行真空預處理，使其濃縮為原來體積的20%，從而獲得鰻魚骨酶解濃縮液。

1.3.3 美拉德反應改良工藝參數優化

⑴ 單因素試驗

考察木糖添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、反應溫度（90、100、110、120、130 ℃）、反應時間（30、40、50、60、70 min）、pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物風味模糊綜合感官評分的影響。

⑵ 正交試驗

根據單因素試驗結果，以pH值（A）、反應時間（B）、反應溫度（C）、木糖添加量加量（D）為主要因素為考察因素，選取模糊綜合感官評分為指標，按L9(34)正交表進行試驗，因素水平表見表1。

表1 美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物風味優化正交試驗設計因素水平表

1.3.4 感官評價方法

由有食品相關專業教育背景專業人員10人（5男5女）組成評定小組，為提高感官評價的可信度，在評定之前不得使用有氣味的化妝品，1 h不得抽煙等。分別對美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物的外觀、滋味、氣味及色澤進行等級評定，等級分為差、中、良、優四個等級，按百分制評分，感官質量評定標準見表2。

1.3.5 建立模糊綜合感官評價模型

⑴ 因素集、評語集和加權重集的建立

因素集是影響被評價對象的指標集合，參照韓曉江等[9]的方法建立以外觀(U1)、滋味(U2)、氣味(U3)、色澤(U4)作為美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物的評價指標的模糊綜合感官評價模型，從而得到的因數集U={u1，u2，u3，u4}。

評語集是指參與美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物感官質量的評價者對其評價反饋信息的集合，確定評語論域需要評定的等級。經過評定全體成員討論，確定美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物的評價等級為優(n1)、良(n2)、好(n3)、差(n4)，得到美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物的評語集N=｛n1，n2，n3，n4｝。評價過程中差優、良、中和差4個等級分別賦予相應的分值90、80、70、60，則評價等級集K={K1，K2，K3，K4}={90，80，70，60}。

⑵ 確定權重集

根據譚沙等[10]的方法，權重是指評價因素對模糊數學評價的重要程度，表示為X=(x1，x2，x3，x4)，外觀、滋味、氣味及色澤是影響美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物感官品質的指標。該試驗采用強制規定法確定各因素的權重分別為外觀(0.20)、滋味(0.35)、氣味(0.30)、色澤(0.15)即權重集X=(0.20，0.35，0.30，0.15)。

⑶ 建立模糊綜合感官評判

模糊感官綜合評價結果為Yi=X×Ri（i為1-9），其中X為權重集，Ri為模糊矩陣；并引進綜合評分矩陣T處理模糊關系評價集Y，得到美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物樣品的模糊綜合評價總分T=Y×K，其中K={k1，k2，k3，k4}為評價等級集。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 木糖添加量對鰻魚骨酶解液美拉德反應的影響

美拉德反應是食品風味產生的主要來源之一，還原糖添加量影響美拉德反應產物的色澤和香味。木糖反應活性較好，價格便宜，能促進目標物的甜味和焦糖香產生。

實驗結果見圖1，由圖可知，添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%木糖進行美拉德反應，隨著木糖添加量的增加，在波長280 nm與420 nm處的吸光度也隨之增加。通過感官評分顯示，當木糖添加量為2.0%時，其感官評分最高，木糖添加量超過2.0%之后感官評分開始下降，而木糖添加量超過2.0%時，焦糖化反應加劇，褐變急速加劇和產生焦苦味使感官評分降低。當木糖加入量增加，其反應速度加快，當添加量過多時其反應不徹底，而在感官上有明顯的甜味和略帶焦苦的味道，顏色偏深，因此從各個方面來看，確定最佳的木糖的添加量為2.0%。

圖1 木糖添加量對美拉德反應產物感官評分的影響

2.1.2 反應溫度對鰻魚骨酶解液美拉德反應的影響

實驗結果見圖2，由圖可知：在90、100、110、120、130 ℃的反應溫度條件下進行美拉德反應，隨著反應溫度的升高，在波長280 nm與420 nm處吸光度隨之增加，感官評分也逐漸增加，在110 ℃達到最高值；當反應溫度達大于110 ℃時，低分子質量香味中間體含量較高，其感官評分逐步下降，280 nm處吸光度也隨之下降，這可能是美拉德反應速度大幅提高，類黑精物質產生加速，掩蓋了原有的海鮮風味[11,12]，并呈現出焦苦味，顏色呈褐色,對感官評分有不利影響,所以將110℃為最佳反應溫度。

圖2 反應溫度對美拉德反應產物感官評分的影響

2.1.3 反應時間對鰻魚骨酶解液美拉德反應的影響

實驗結果見圖3，由圖可知在30、40、50、60、70 min的反應時間條件下進行美拉德反應，在波長280 nm和420 nm處的吸光度都與反應時間成正比，酶解液顏色也隨之加深，這說明美拉德反應的程度也隨著反應時間的延長而增強，這與董志儉等[13]和李學鵬[14]的研究結果相同。然而，感官評分逐步升高，當反應時間達到60 min時，美拉德反應產物的感官評分達到最高，反應產物的風味和質量最佳，但隨著反應的持續進行，反應產物的褐變進一步增加，顏色也進一步變深，出現焦苦味較明顯，風味不佳，分數下降。因此確定最佳的反應時間為50 min。

圖3 反應時間對美拉德反應產物感官評分的影響

2.1.4 反應體系初始pH值對鰻魚骨酶解液美拉德反應的影響

反應初始pH值對美拉德反應體系有著很大的影響，如氨基酸、肽類、蛋白質等含有的氨基和還原糖中的羰基，在不同的pH值下，形成離子化程度不一樣，使其風味差異較大；在反應pH值過高的情況下，美拉德反應產物顏色變深，在感官上有一種焦糊味。

實驗結果見圖4，由圖可知在反應pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的條件下進行美拉德反應，隨著pH值的增加，酶解液的褐變顏色加深，美拉德反應的感官評分呈現先上升后下降的趨勢。當反應pH值為7.0時，感官評分達到最大。在反應pH值為6.0～7.5的條件下，低分子質量的香味中間體增加；當反應pH＞7.5時，香味中間體含量下降。隨著pH值的升高，鰻魚骨酶解液會產生焦糊味，并使其顏色變深，使感官評分降低，結果顯示pH值對美拉德反應產物的褐變程度有著很大的影響。因此確定最佳的反應體系初始pH值為7.0。

圖4 初始pH值對美拉德反應產物感官評分的影響

2.2 模糊數學綜合感官評價結果

通過評定小組感官評價員對9個美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物樣品的外觀、滋味、氣味及色澤4項指標進行評價，將評價結果收集匯總并進行統計分析，得出美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物的感官評價結果見表3。

表3 不同配料下美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物感官評價結果

2.3 模糊矩陣模型建立的結果

模糊矩陣是根據感官評價中各評語得票數比評價總人數，那么根據感官評價結果得到9個模糊矩陣Ri，其中i代表第i個樣本。例如以1號樣本為例，得到表4所示的感官評價結果，則樣品1的矩陣為：

表4 美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物優化正交試驗結果與分析

同理可得R2-R9。采用先相乘再加和的方法計算綜合評分，根據確定權重集X=(0.2，0.3，0.3，0.2)。對模糊感官的綜合評定結果Yi=X×Ri（i為1-9）。例如以樣品1為例，其模糊感官評價結果：

同理可得Y2-Y9樣品的模糊數學感官綜合評價結果。

模糊綜合評價總分T=Y×K，Y1={0.42 0.27 0.15 0.17}，評價等級K={90，80，70，60}，因此第1個美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物樣品的模糊綜合評分為：

同理可得2#—9#美拉德反應改良鰻魚骨酶解提取物樣品的模糊綜合感官評價總分。

2.4 正交試驗結果分析

在單因素試驗以感官評分為評價指標的基礎上，以反應體系初始pH值、反應時間、反應溫度和木糖添加量4個因子，設計4因數3水平正交試驗，試驗結果如表4所示。

由表4正交試驗極差分析可知，影響美拉德反應產物的感官評價各因素的主次關系：B反應時間＞C反應溫度＞D木糖添加量＞A反應體系初始pH值，所以得到美拉德反應提取物的最優組合為A3B1C2D1，由于此組合不出現在正交試驗結果表4中，所以需要進行驗證試驗。

2.5 驗證試驗

為了驗證鰻魚骨酶解液美拉德反應提取物工藝條件的穩定性，按最佳美拉德反應工藝條件A3B1C2D1，分別對這該組合進行3次試驗，發現該組合的感官評分（89.25分）明顯優于組合A3B1C3D2（85.75分）。所以得到的鰻魚骨酶解液美拉德反應提取物最佳組合為A3B1C2D1，即反應初始pH值為7.5、反應時間50 min、反應溫度120 ℃、木糖添加量1.5%。

2.6 鰻魚酶解液水解度測定結果

對鰻魚骨酶解液水解度進行分析測定，得出試樣中蛋白質含量為9.22 g/100g，由此可得鰻魚骨酶解液水解度為7.63%，氨基酸態氮含量為0.70 g/100mL。

3 結論

本研究以鰻魚骨為主要原料進行蛋白酶水解，在酶解液中加入木糖并通過美拉德反應制備出具有鰻魚風味的提取物產物，鰻魚骨酶解液美拉德反應的工藝經單因素試驗與正交試驗相結合進行了優化，結果表明，優化后工藝條件為初始pH值7.5、時間50 min、溫度120 ℃、木糖添加量1.5%，在此優化工藝制得的美拉德反應產物風味得到了較大改善，色澤呈棕褐色或棕黃色，烤鰻魚滋味和焦香味濃郁，香氣突出，沒有其他不良異味。