基于HPLC 指紋圖譜不同產地板藍根主要活性成分與其根際土壤理化性質的相關性研究

秦 露，李 健，耿燕楠，楊 敏，劉廣緒，馮 帥,2*，李 峰,2*

1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355

2.李峰名老中醫工作室，山東 濟南 250355

3.山東省中醫醫院 藥學部，山東 濟南 250355

板藍根為十字花科植物菘藍IsatisindigoticaFort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽等功效[1]，臨床上常用于預防和治療流行性感冒、肺炎、腮腺炎等疾病[2-3]。現代研究表明，板藍根具有抗炎、抗腫瘤、抗內毒素和免疫調節作用[4-7]。板藍根的主要成分為生物堿類、有機酸類、蒽醌類、黃酮類、木脂素類、氨基酸類、多糖類、核苷等[8]，其中，腺苷、鳥苷、尿苷等核苷類成分是其抗病毒的主要活性成分，能干擾病毒核酸的合成[9-10]。《中國藥典》2020年版僅規定了板藍根中水溶性成分(R,S)-告依春作為其含量測定項，藥材質量難以全面把握[1]。

隨著市場需求的不斷上升，目前菘藍在全國各地廣泛種植，主產于河北、山東、安徽、河南、黑龍江等地，但由于生態環境（氣候因子、土壤因子、地形因子等）、栽培模式、采收加工等的影響，不同產地板藍根藥材的質量和產量差異較大，在一定程度上影響了臨床療效[11-14]。土壤作為植物生長的載體，是藥用植物的生長、繁育與品質形成所需物質基礎的主要來源[15]。尤其是根際土壤，直接接觸植物根系，與藥用植物品質的形成密切相關[16]。長期以來，國內外專家學者主要側重板藍根化學成分和藥理作用的研究，而對其生態環境中土壤因子研究頗少[17]，因此，為獲得高品質的板藍根藥材，亟需對板藍根質量與土壤因子的相關性進行研究。

本實驗選取9 個不同產地的板藍根藥材，采用HPLC 建立指紋圖譜，結合化學模式識別方法對其質量進行分析，同時測定板藍根中胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷和(R,S)-告依春5 個指標成分的含量，并應用Origin 軟件對板藍根主要指標成分與其根際土壤理化性質進行相關性分析，旨在為合理規范化種植藥材提供參考，也為菘藍規范化栽培以及板藍根藥材質量和產量的提升提供參考。

1 材料與儀器

1.1 儀器

1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）、FA2004B 型萬分之一電子天平（上海天美天平儀器有限公司）、KQ-500DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、TDL-5-A 型離心機（上海安亭科學儀器廠）、FW-80 型高速萬能粉碎機（北京市永光明醫療儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

對照品尿苷（批號N10M11W109430）、鳥苷（批號 J09GB154303）、(R,S)-告依春（批號Z27N11X132307）、腺苷（批號N24D11W135689）、胞苷（批號T16J7X9000）購自上海源葉生物科技有限公司，質量分數均≥98%；甲醇（色譜純，批號220655059）、乙腈（色譜純，批號22065062）購自帝蒽科國際貿易有限公司；甲醇（分析純，批號GB/T683-2006）、乙醇（分析純，批號GB/T678-2002）、甲酸（批號GB/T15896-1995）、磷酸（批號Q/12KM4168-2018）購自天津市科密歐化學試劑有限公司。共收集板藍根16 批，經山東中醫藥大學李峰教授鑒定為十字花科植物菘藍I.indigoticaFort.的干燥根，具體來源信息見表1。

表1 板藍根藥材樣品收集信息Table 1 Collecting information of Isatidis Radix samples

1.3 根際土壤樣品的采集

采用五點采樣法，隨機選取5 組長勢一致的健康菘藍植株，先將表面約3 cm 的表層土去除，用鐵锨將整個根挖出，采用抖根法[18]輕輕抖落大塊土壤，用軟刷收集整個根表的根際土，裝入采樣袋中，注明產地，運回實驗室，將每個產地的5 組板藍根根際土壤分別混勻為1 個樣品后自然風干，研細過篩，用于測定土壤理化性質。采樣點信息見表2。

表2 板藍根根際土壤采樣地點地理信息Table 2 Geographic information of sampling sites of Isatidis Radix rhizosphere soil

2 方法與結果

2.1 HPLC 指紋圖譜

2.1.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-Aq（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為甲醇-0.3%甲酸水；梯度洗脫：0～14 min，0.5%甲醇；14～24 min，0.5%～10%甲醇；24～35 min，10%～20%甲醇；35～50 min，20%～35%甲醇；50～55 min，35%～50%甲醇；55～60 min，50%～55%甲醇；體積流量0.8 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量12 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取板藍根粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加水10 mL，稱定質量并記錄，超聲提取60 min（100 W、60 kHz），放冷，用水補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，得供試品溶液。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春對照品1.03、1.51、1.26、1.02、4.52 mg，加水溶解并定容至25 mL，制成質量濃度分別為41.20、60.40、50.40、40.80、180.80 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取“2.1.3”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣6 次，記錄色譜圖。結果顯示，該方法的峰面積與相對保留時間RSD 均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 穩定性試驗 精密稱取板藍根（S4）樣品1份，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h 進樣，記錄色譜圖。結果顯示，峰面積與相對保留時間RSD 均小于2%，表明該方法在24 h 內穩定。

2.1.6 重復性試驗 稱取同一批次樣品6 份，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。結果顯示，峰面積與相對保留時間RSD 均小于2%，表明該方法重復性較好。

2.1.7 相似度評價 稱取16 批板藍根樣品的粉末，按“2.1.2”項下的方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件進樣，得到板藍根的指紋圖譜。將16 批板藍根的色譜圖以AIA 格式依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件》（2012 版）進行指紋圖譜相似度分析，得到吸收強、特征明顯且穩定性較好的14 個共有峰。以S4 為參照圖譜，選取“時間窗寬度”為0.5，采用平均數法計算，經多點校正和Mark 峰匹配后生成對照指紋圖譜（R）[19-20]，對照指紋圖譜和16 批樣品的HPLC 指紋圖譜見圖1、圖2。通過與混合對照品溶液的色譜圖比對，指認出5 個共有峰，分別為胞苷（2 號峰）、尿苷（7 號峰）、腺苷（9 號峰）、鳥苷（10 號峰）、(R,S)-告依春（11 號峰）。以生成的對照指紋圖譜為標準，計算得到16 批藥材樣品的HPLC 指紋圖譜與對照圖譜的相似度分別為0.967、0.984、0.991、0.978、0.992、0.998、0.996、0.932、0.985、0.973、0.987、0.971、0.987、0.971、0.858、0.859，均＞0.85，表明各產地間的板藍根有較高的一致性。

圖1 16 批板藍根HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 16 batches of Isatidis Radix

圖2 板藍根的對照指紋圖譜 (A) 和混合對照品指紋圖譜 (B)Fig.2 Control fingerprint (A) and mixed reference fingerprint (B) of Isatidis Radix

2.1.8 聚類分析 選取 (R,S)-告依春（峰11）為參考峰，對板藍根的共有峰的峰面積進行歸一化，然后將其導入Origin Pro 2022 軟件作圖。結果顯示，16 批樣品按照產地可分為3 類，第I 類包括萊蕪（S1）、陜西（S9、S14）、神秀谷（S10）、威海（S8）；第II類包括長清（S2、S11～S13）、泰安（S4）、章丘（S3）、黑龍江（S6）、馬山（S7）、亳州（S5）；第III 類包括甘肅（S15、S16），聚類分析熱圖如圖3 所示。

圖3 16 批板藍根聚類分析圖Fig.3 Cluster analysis of 16 batches of Isatidis Radix

2.1.9 主成分分析（principal component analysis，PCA） 為進一步探討不同產地板藍根化學成分的差異，在HPLC 指紋圖譜匹配結果中，選取峰11(R,S)-告依春為參考峰，對各色譜峰峰面積進行歸一化處理，計算不同保留時間下歸一化峰面積值。將生成的匹配數據導入Origin Pro 2022 軟件，建立主成分分析模型，見圖4；選擇特征值大于1 的前3 個主成分，計算貢獻率（表3），它們的貢獻率分別是64.21%、14.07%、8.40%，前3 位主成分累積貢獻率達到86.65%，證明模型擬合能力良好。主成分因子載荷結果（表4）表明，主成分1 的信息主要來源于峰1～7、9、10；主成分2 的信息主要來源于峰8、14；主成分3 的信息主要來源于峰12、13。由16 批板藍根PCA 分析圖（圖4）可以看出，不同產地的樣本分類效果較好，尤其是甘肅產地（S15、S16）與其他地區有明顯的區別，總體結果與聚類分析結果保持一致。

圖4 16 批板藍根主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis of 16 batches of Isatidis Radix

表3 主成分權重結果Table 3 Principal component weight results table

表4 因子載荷系數Table 4 Factor load coefficient table

2.2 5 個指標成分含量測定

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項。

2.2.2 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項。

2.2.3 對照品溶液的制備 同“2.1.3”項。

2.2.4 線性關系考察 分別精密量取胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春對照品溶液適量，逐級稀釋成一定濃度的混合對照品溶液，進樣分析，在波長254 nm 下測定并記錄峰面積。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），求得胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春的回歸方程、線性范圍及回歸方程見表5。

表5 回歸方程及相關系數Table 5 Regression equation and correlation coefficient

2.2.5 精密度試驗 取“2.1.3”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，連續進樣6 次，記錄峰面積。結果顯示，胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春峰面積的RSD 值分別為0.17%、0.09%、0.15%、0.05%、0.34%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 精密稱取板藍根S4 樣品0.5 g，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、16、24 h 進樣，記錄峰面積。結果顯示，胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春峰面積的RSD 值分別為0.40%、0.97%、1.58%、0.35%、0.19%，均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 精密稱取6 份S4 板藍根粉末0.5 g，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液。按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積。結果顯示，胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春峰質量分數的RSD 值分別為0.15%、2.11%、0.55%、0.22%、0.12%，均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 稱取已測定的板藍根粉末6 份，每份稱量0.25 g，分別精密加入混合對照品適量，按“2.1.2”項下方法制成供試品溶液，進樣分析，胞苷、尿苷、腺苷、尿苷和(R,S)-告依春的加樣回收率分別為103.35%、98.05%、98.11%、96.08%、95.21%，RSD 分別為0.89%、0.23%、0.18%、0.25%、0.17%，符合要求。

2.2.9 樣品含量測定 按照“2.1.2”項下方法分別制備16 批板藍根供試品的溶液，按“2.1.1”項下的色譜條件分別測定其中的胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷、(R,S)-告依春含量，每個樣品平行測定3 次，取平均值，見表6。16 批藥材樣品中胞苷、尿苷、腺苷、鳥苷，(R,S)-告依春的質量分數分別為0.152 0～0.299 4、0.290 2～0.666 1、0.316 5～0.855 2、0.167 4～0.525 8、0.615 0～2.844 8 mg/g，不同產地不同批次的板藍根藥材中的5 種成分含量差異明顯，均具有顯著性差異（P＜0.05），說明板藍根不同種植地區對其質量影響較大。

表6 16 批板藍根中5 種成分的含量Table 6 Composition content table

2.3 土壤理化性質測定及分析

收集9 個不同產地板藍根（山東萊蕪、山東長清、山東章丘、山東泰安、安徽亳州、黑龍江大慶、山東馬山、山東威海、陜西商洛）根際土壤，測定土壤理化性質，測定方法參考《土壤農化分析》[21]，其中土壤含水量（soil moisture content，SMC）的測定方法為烘干法；土壤pH 值的測定方法為水浸提（水土比2.5∶1）-電位法測定；有機質（organicmatter，OM）的測定方法為外加熱重鉻酸鉀氧化容量法；有效磷（available phosphorus，AP）的測定方法為碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀（available potassium，AK）的測定方法為醋酸銨浸提-火焰光度法；銨態氮（ammonium nitrogen，NH4+-N）的測定方法為靛藍比色法；硝態氮（nitrate nitrogen，NO3--N）的測定方法為2 mol/L KCl 浸提后用堿解擴散法，每個樣品平行測定3 次，取平均值。

測定結果如圖5 所示，9 個產地的板藍根根際土壤理化性質有較大差異。其中土壤pH 范圍在5.86～8.00，除陜西的土壤偏酸性以外，其余產地均偏堿性，亳州的土壤堿性最強，陜西的土壤pH 值顯著低于其他產地（P＜0.05）；含水量范圍為7.86%～21.15%，亳州）最高，威海最低，差異性顯著（P＜0.05）；有機質質量分數為6.50～31.51 g/kg，黑龍江最高，威海最低，具有顯著差異（P＜0.05）。銨態氮質量分數為25.32～67.59 mg/kg，亳州最高，長清最低；硝態氮質量分數為40.68～219.30 mg/kg，除萊蕪與黑龍江的含量無顯著性差異外，其余產地含量均有顯著性差異（P＜0.05）；有效磷質量分數在14.08～43.49 mg/kg，亳州（S5）最高，威海最低；速效鉀質量分數為146.40～636.00 mg/kg，亳州最高，威海最低，9 個產地均具有顯著性差異（P＜0.05）。在9 個產地中，亳州產地的pH 值、含水量、銨態氮、有效磷和速效鉀5 個理化性質的含量較其他產地顯著偏高，威海產地的含水量、有機質、硝態氮、有效磷和速效鉀5 個理化性質的含量較其他產地顯著偏低。

圖5 土壤理化性質匯總圖Fig.5 Summary map of soil physical and chemical properties

2.4 相關性分析

將板藍根藥材樣品（S1～S9）活性成分含量測定數據及與之對應的板藍根根際土壤樣品理化性質測定數據導入Origin Pro 2022 軟件進行相關性分析，結果如圖6。胞苷含量與pH、含水量、有機質、硝態氮、有效磷、速效鉀含量呈正相關，與銨態氮含量呈負相關；尿苷含量與含水量、有機質、硝態氮、速效鉀含量呈正相關，與pH、銨態氮、有效磷、含量呈負相關；腺苷含量與含水量、有機質、銨態氮、硝態氮、有效磷、速效鉀含量呈正相關，與pH 呈負相關；鳥苷含量與pH、含水量、有機質、銨態氮、有效磷、速效鉀含量呈正相關，與硝態氮含量呈負相關；(R,S)-告依春含量與pH、硝態氮、有效磷含量呈正相關，與含水量、有機質、銨態氮、速效鉀含量呈負相關。其中，胞苷含量與有效磷含量呈顯著正相關（P＜0.05）；尿苷含量與pH 呈顯著負相關（P＜0.05）；腺苷含量與含水量和速效鉀含量呈顯著正相關（P＜0.05）。尿苷含量與腺苷含量呈顯著正相關（P＜0.05）。pH 與硝態氮含量呈顯著負相關（P＜0.05）；速效鉀含量與含水量和有機質含量呈極顯著正相關（P＜0.01）。由此可見，土壤理化性質與板藍根藥材主要化學成分含量具有一定的相關性，其中土壤pH、含水量、有效磷、速效鉀是影響板藍根藥材質量的主控因子。

圖6 板藍根活性成分與土壤理化性質相關性圖Fig.6 Correlation diagram of active components of medicinal materials and soil physicochemical properties

3 討論

控制中藥的質量是保證其發揮藥效的前提，也是中藥產業實現現代化需面對的問題。目前，隨著中藥材種植區域范圍的逐漸擴大，中藥材的質量更加難以保障，不僅影響了中藥在臨床中發揮療效，也使中醫藥走向國際化的發展受阻。板藍根作為常用的大宗藥材，是很多制劑的主要原料，但存在不同產地或同一產地不同批次板藍根質量參差不齊的現象。本研究含量測定結果表明，板藍根藥材中的5 種成分含量在不同產地不同批次間差異較大，不同種植地區對板藍根的質量影響較大。HPLC 指紋圖譜結合化學模式識別法已廣泛應用于中藥材質量評價等方面。本研究運用HPLC 指紋圖譜對不同產地不同批次的板藍根進行相似度分析，并結合化學模式識別方法，對不同來源的樣品進行分類和鑒別，更為全面的表征板藍根的質量。為了確保HPLC 指紋圖譜和含量測定的準確可靠，本研究分別對提取方法（超聲、回流）、提取時間（30、45、60 min）、提取溶劑（水、甲醇、乙醇）、流動相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.3%甲酸）、檢測波長（248、254、260、270 nm）、體積流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）、柱溫（25、30、35 ℃）及洗脫程序進行考察，優選出最佳的實驗條件。結果顯示，超聲和回流2 種提取方法圖譜相似，但超聲提取方法簡單，操作簡便，效率更高；提取時間60 min 所得圖譜的整體峰面積更大；以水作提取溶劑所得峰面積更大，更安全；以甲醇-0.3%甲酸為流動相時色譜峰分布均勻，分離度最好；檢測波長254 nm 處整體峰面積更大，色譜峰較豐富且分布均勻、峰形好；0.8 mL/min 的體積流量分離度更佳；柱溫30 ℃時色譜峰分離度更好且峰形完整。

生態環境對藥用植物的生長、繁育和有效成分的積累具有至關重要的影響[22-23]。研究表明，除了地域和氣候之外，土壤理化性質、土壤污染程度等對藥用植物的生長及藥效都有很大影響[24]。土壤質地是決定藥用植物資源分布的主要影響因素[25]。陳貝貝等[26]采用不同土壤含水量梯度，分析沙棘的繁殖能力與種群特征關系，發現土壤含水量可以限制藥用植物的生態分布。Xu 等[27]研究連作下影響三七存活率的土壤因素，發現土壤磷酶、速效氮、pH等6 個土壤參數均與三七成活率相關，且三七生長的最佳pH 約為6.5。我國幅員遼闊，全國各地區的土壤理化性質差異巨大，本研究發現土壤理化性質與板藍根主要活性成分含量有一定的相關性，胞苷含量與有效磷含量呈顯著正相關（P＜0.05），尿苷含量與pH 呈顯著負相關（P＜0.05），腺苷含量與含水量和速效鉀含量呈顯著正相關（P＜0.05），土壤pH、含水量、有效磷、速效鉀含量是影響板藍根藥材質量的主控因子。適當施加磷肥、鉀肥，適當增加土壤水分，適當調節土壤pH 可能會增加板藍根藥材中有效成分的積累，后期將擴大樣本量，篩選出更加適宜菘藍生長的生態環境，尋找適合板藍根有效成分積累的土壤環境，從源頭上保障藥材質量，為中醫臨床用藥的有效性提供基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突