星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化pH 值依賴型巖黃連堿口服結(jié)腸靶向納米粒

曾勇珠，郭 魏，張?jiān)娙A帥，蘇曉丹，朱 煜，周 燕，黃秋潔，葉 勇,4*

1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021

2.廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530007

3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001

4.廣西生物活性分子研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021

肝纖維化是由肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度增生與沉積而導(dǎo)致的慢性病理過(guò)程，若干預(yù)不及時(shí)，可發(fā)展為肝硬化甚至肝癌[1]。研究表明，腸道微生物群失調(diào)是導(dǎo)致肝纖維化等肝臟疾病的一個(gè)關(guān)鍵因素，故靶向腸道微生物群，系統(tǒng)研究腸道微生物代謝物對(duì)肝臟的影響，對(duì)揭示肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制意義重大[2-3]。

巖黃連系罌粟科紫堇屬石生黃堇Corydalis SaxicolaBunting 的帶根全草[4]，是廣西的民間草藥。巖黃連性涼、味苦，具有清利濕熱、散瘀消腫功效，常用于治療瘡癤腫毒、肝炎、肝癌等[5]。巖黃連堿［脫氫卡維丁（dehydrocavidine，DC）］是從巖黃連中分離純化得到的主要活性生物堿之一[6]，具有抑菌、鎮(zhèn)痛、抗肝纖維化等作用[7-11]。本課題組前期預(yù)試驗(yàn)初步表明，巖黃連堿可以調(diào)控大鼠腸道微生物群，改善腸道炎癥以保護(hù)肝臟。而巖黃連堿存在水溶性差、體外抗氧化活性能力低[8,12]等缺點(diǎn)，限制了其相關(guān)制劑的研發(fā)及臨床應(yīng)用。

結(jié)腸定位給藥系統(tǒng)（colon specific drug delivery system，CSDDS）是利用適宜的聚合物材料包裹藥物，使其在胃和小腸中穩(wěn)定，在結(jié)腸中被降解的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)定位給藥。

殼聚糖和果膠可作為益生元調(diào)控腸道微生物改善高血脂及肥胖[13-14]。通過(guò)離子相互作用［殼聚糖的電離氨基（-NH3+）與果膠的電離羧基（-COO?）之間的離子相互作用］，可以形成殼聚糖和果膠的聚電解質(zhì)復(fù)合納米粒，該類復(fù)合納米粒載體因具有腸道微生物響應(yīng)性和pH 響應(yīng)性，而在結(jié)腸靶向藥物遞送中具有廣闊的應(yīng)用前景[15]。因此，本課題擬選用巖黃連堿為模型藥物，殼聚糖和果膠作為載體材料，設(shè)計(jì)一種對(duì)結(jié)腸特殊生理環(huán)境有特異性響應(yīng)的聚電解質(zhì)復(fù)合納米粒巖黃連堿口服結(jié)腸靶向納米粒（dehydrocavidine-chitosan/pectin- nanoparticles，DCCS/PT-NPs），通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法（central composite design-response surface methodology，CCDRSM）優(yōu)化DC-CS/PT-NPs 制備工藝，并對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量表征與體外釋放行為評(píng)價(jià)，以期為后續(xù)體內(nèi)抗肝纖維化藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)等研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為民族藥巖黃連堿新型口服保肝制劑的研發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀器，二級(jí)管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司；XS205DU 型分析天平，梅特勒-托利多集團(tuán)；HH-2 型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；Nano-ZS90 型粒度分析儀，英國(guó)馬爾文公司；TD5A-WS 型常臺(tái)式低速離心機(jī)，常州隆和儀器制造有限公司；THZ-92C 型臺(tái)式恒溫振蕩器，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；H-7650 型透射電子顯微鏡（TEM），日本Htachi 公司；Smart Lab-9k W 型轉(zhuǎn)靶X 射線粉末衍射儀（XRD），日本Rigaku公司；Nicolet IS20 型傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）儀，賽默飛世爾科技公司；JY92-IIDN 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 試藥

巖黃連堿原料藥，批號(hào)RP20201009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.0%，購(gòu)自成都麥德生科技有限公司；巖黃連堿對(duì)照品，批號(hào)111667-200401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP，批號(hào)C2117140）、殼聚糖（批號(hào)L2004257）、果膠（批號(hào)SLCG1374），上海阿拉丁生化科技有限公司；冰乙酸（批號(hào)2021110901）、無(wú)水乙醇（批號(hào) 2022121001）、甲醇（批號(hào)2022032802），購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司；鹽酸，批號(hào)2020092201，購(gòu)自廉江市愛(ài)廉化試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DC-CS/PT-NPs 的制備工藝

稱取適量巖黃連堿溶解于無(wú)水乙醇中，質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，殼聚糖溶解于2%的醋酸并用NaOH 調(diào)至一定pH 值，質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL；果膠和TPP 溶解于蒸餾水中，質(zhì)量濃度均為2.0 mg/mL。將巖黃連堿溶液用注射器逐滴滴加到殼聚糖溶液中，再依次將TPP 和果膠溶液用注射器均勻滴加至殼聚糖混合物中，滴加完畢后攪拌30 min，得到DC-CS/PT-NPs 供試液。

CS/PT-NPs 制備方法同DC-CS/PT-NPs 一致，但不加入巖黃連堿原料藥。

2.2 HPLC 法測(cè)定巖黃連堿含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent5 TC-C18分析柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.2%磷酸三乙胺水溶液（34∶66）；檢測(cè)波長(zhǎng)為346 nm；體積流量為1 mL/min；柱溫為25 ℃。巖黃連堿對(duì)照品及巖黃連堿色譜圖如圖1 所示，專屬性較高，理論塔板數(shù)以巖黃連堿計(jì)不低于3 000。

2.2.2 線性關(guān)系考察 精密稱定巖黃連堿對(duì)照品1.0 mg 至5 mL 量瓶中，加入甲醇定容至刻度，得到200 μg/mL 巖黃連堿母液，分別配制成質(zhì)量濃度1、5、10、25、50、100、200 μg/mL 系列對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝21.448X－12.609，r＝1.000 0，可見(jiàn)巖黃連堿在1～200 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度考察

（1）日內(nèi)精密度：取10、50、100 μg/mL 巖黃連堿對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，1 d 連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果表明，低、中、高質(zhì)量濃度巖黃連堿對(duì)照品溶液的RSD 分別為0.23%、0.09%、0.05%，表明日內(nèi)精密度良好。

（2）日間精密度：取10、50、100 μg/mL 巖黃連堿對(duì)照品溶液，按“2.2.1”色譜條件測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6 d，記錄峰面積，計(jì)算其RSD。結(jié)果表明，低、中、高質(zhì)量濃度巖黃連堿對(duì)照品溶液的RSD 分別為0.22%、0.19%、0.06%，表明日間精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性考察 將DC-CS/PT-NPs 供試液稀釋至10、50、100 μg/mL，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算其RSD，觀察12 h 內(nèi)穩(wěn)定情況。結(jié)果表明，RSD 分別為1.76%、2.12%、1.66%。

2.2.5 重復(fù)性考察 按“2.1”項(xiàng)方法平行制備6 份DC-CS/PT-NPs 供試液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD。結(jié)果表明，RSD 為1.27%。

2.2.6 準(zhǔn)確度考察

（1）方法回收率：配制10、50、100 μg/mL 巖黃連堿甲醇溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程換算得實(shí)際測(cè)定質(zhì)量濃度，計(jì)算方法回收率。結(jié)果表明，方法回收率分別為93.95%、96.79%、96.03%，RSD分別為0.07%、0.06%、0.03%，符合《中國(guó)藥典》要求。

（2）加樣回收率：按處方量的80%、100%、120%稱取適量巖黃連堿原料藥，分別加入處方量的各個(gè)輔料，加入甲醇溶解定容，搖勻，配成質(zhì)量濃度分別為10、50、100 μg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度平行3 次，共9 份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，加樣回收率分別為86.19%、100.22%、99.50%，RSD 分別為1.08%、0.05%、0.06%，符合《中國(guó)藥典》要求。

2.3 包封率、載藥量、粒徑及ζ 電位的測(cè)定

采用低速離心法測(cè)定DC-CS/PT-NPs 的包封率和載藥量。將“2.1”項(xiàng)下方法制備的樣品，在4 000 r/min 離心（離心半徑7.5 cm）20 min，取上清液，用HPLC 法進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離藥物含量。

包封率＝(投藥總質(zhì)量－游離藥物的質(zhì)量)/投藥總質(zhì)量

載藥量＝(投藥總質(zhì)量－游離藥物的質(zhì)量)/納米粒總質(zhì)量

將DC-CS/PT-NPs 混懸液經(jīng)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲8 min 后，取0.4 mL，蒸餾水稀釋3.5 倍，置于粒度分析儀中，分別測(cè)定粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）及ζ 電位。

2.4 單因素考察DC-CS/PT-NPs 處方及制備工藝

2.4.1 殼聚糖質(zhì)量濃度的考察 改變殼聚糖質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL，固定果膠質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，殼聚糖pH 值為4.5，投藥量為2.0 mg，攪拌時(shí)間為30 min，按“2.1”項(xiàng)下方法制備DC-CS/PT-NPs，以粒徑、PDI、ζ 電位、包封率和載藥量為考察指標(biāo)。隨著殼聚糖質(zhì)量濃度增加，粒徑總體呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，ζ 電位絕對(duì)值呈遞減趨勢(shì)，可能因?yàn)殡S著殼聚糖質(zhì)量濃度增大，過(guò)多的殼聚糖結(jié)合在納米顆粒表面，顆粒表面帶正電荷并產(chǎn)生靜電斥力，團(tuán)聚物逐漸分離形成分散的大顆粒；當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，包封率、載藥量較好，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 1 Investigation of chitosan concentration on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

表1 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 1 Investigation of chitosan concentration on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

殼聚糖/(mg?mL?1) 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 包封率/% 載藥量/%1.0 454.85±19.15 0.425±0.001 ?27.75±0.42 61.46±0.59 8.14±0.08 1.5 442.28±13.42 0.403±0.007 ?27.30±1.00 59.88±0.78 7.09±0.09 2.0 477.18±6.13 0.370±0.002 ?26.33±1.23 67.34±9.23 7.21±0.99 2.5 407.87±16.03 0.370±0.002 ?22.55±0.98 58.42±0.21 5.71±0.02 3.0 529.20±8.50 0.367±0.084 ?16.47±0.33 61.60±0.02 5.54±0.00

2.4.2 果膠質(zhì)量濃度的考察 改變果膠質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL，固定殼聚糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，殼聚糖溶液pH 值為4.5，投藥量為2.0 mg，攪拌時(shí)間為30 min，按“2.1”項(xiàng)下方法制備DC-CS/PT-NPs，以粒徑、PDI、ζ 電位、包封率和載藥量為考察指標(biāo)，隨著果膠質(zhì)量濃度增加，DC-CS/PT-NPs 的粒徑逐漸增大，當(dāng)果膠質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，粒徑、包封率、載藥量較為理想，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 果膠質(zhì)量濃度對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 2 Investigation of pectin concentration on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

表2 果膠質(zhì)量濃度對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 2 Investigation of pectin concentration on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

果膠/(mg?mL?1) 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 包封率/% 載藥量/%1.0 346.13±2.97 0.311±0.054 ?16.95±0.88 57.52±2.32 7.06±0.28 1.5 399.60±1.40 0.425±0.015 ?22.38±0.95 58.96±1.51 6.75±0.17 2.0 426.25±21.65 0.303±0.086 ?23.45±1.98 59.05±2.56 6.32±0.28 2.5 502.45±16.75 0.276±0.051 ?24.90±0.90 56.43±1.33 5.68±0.13 3.0 787.18±4.38 0.383±0.198 ?25.48±0.55 57.57±0.07 5.47±0.01

2.4.3 殼聚糖溶液pH 值的考察 改變殼聚糖溶液pH 值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，固定殼聚糖質(zhì)量濃度為 1.5 mg/mL，果膠質(zhì)量濃度為 1.5 mg/mL，投藥量為2.0 mg，攪拌時(shí)間為30 min，按“2.1”項(xiàng)下方法制備DC-CS/PT-NPs，以粒徑、PDI、ζ 電位、包封率和載藥量為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表3。殼聚糖的pKa為6.5，當(dāng)pH 值介于5.0～6.0 時(shí)，殼聚糖中-NH2質(zhì)子化后形成-NH3+，果膠中的羧基基團(tuán)離子化，分子帶負(fù)電荷，可與帶正電荷的殼聚糖結(jié)合[16]。當(dāng)殼聚糖pH 為5.0 時(shí)，粒徑、包封率、載藥量較好。

表3 殼聚糖pH 值對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 3 Investigation of chitosan pH values on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

表3 殼聚糖pH 值對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 3 Investigation of chitosan pH values on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

殼聚糖pH 值 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 包封率/% 載藥量/%3.5 478.67±15.27 0.287±0.081 ?13.67±2.03 56.35±1.15 6.04±0.12 4.0 546.83±15.33 0.368±0.066 ?20.67±0.83 57.03±0.62 6.11±0.07 4.5 569.40±2.90 0.479±0.047 ?22.25±0.68 60.56±0.78 6.47±0.08 5.0 420.35±34.55 0.308±0.067 ?22.83±1.50 60.66±2.49 6.50±0.27 5.5 656.87±27.73 0.116±0.039 ?24.03±0.30 58.53±0.81 6.27±0.09

2.4.4 投藥量的考察 改變投藥量分別為2.0、3.0、4.0、5.0 mg，固定殼聚糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，果膠質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，殼聚糖pH 值為4.5，攪拌時(shí)間為30 min，按“2.1”項(xiàng)下方法制備DC-CS/PT-NPs，以粒徑、PDI、ζ 電位、包封率和載藥量為考察指標(biāo)，隨著投藥量的增加，其包封率逐漸減小，而載藥量逐漸增大，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，包封率并不隨著投藥量增加而增加，這可能為當(dāng)殼聚糖、果膠質(zhì)量濃度一定，兩者結(jié)合形成納米粒載體的量基本不變，包載藥物能力有限，隨著投藥量增加，包封率逐漸下降。

表4 巖黃連堿投藥量對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 4 Investigation of dehydrocavidine dosage on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

表4 巖黃連堿投藥量對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 4 Investigation of dehydrocavidine dosage on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

投藥量/mg 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 包封率/% 載藥量/%2.0 446.73±9.53 0.358±0.125 ?25.47±0.03 67.35±1.50 2.98±0.06 3.0 460.17±13.60 0.230±0.114 ?22.13±0.17 64.01±1.54 4.23±0.09 4.0 464.52±1.75 0.280±0.082 ?16.46±4.01 59.97±0.00 5.25±0.01 5.0 491.23±4.70 0.402±0.014 ?8.83±1.39 58.19±1.80 6.29±0.10

2.4.5 攪拌時(shí)間的考察 改變攪拌時(shí)間分別為20、30、40、50 min，固定殼聚糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，果膠質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，殼聚糖溶液pH 值為4.5，投藥量為2.0 mg，按“2.1”項(xiàng)下方法制備DCCS/ PT-NPs，以粒徑、PDI、ζ 電位、包封率和載藥量為考察指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表5。攪拌時(shí)間對(duì)粒徑的影響較大，隨著攪拌時(shí)間的增加，其粒徑先減小后增加，當(dāng)攪拌時(shí)間為40 min 時(shí)粒徑最小，可能在40 min 時(shí)反應(yīng)較為充分。隨著攪拌時(shí)間增加，納米粒包封率略有降低，可能為吸附在殼聚糖表面的巖黃連堿重新游離到溶液中。

表5 攪拌時(shí)間對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 5 Investigation of stirring time on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

表5 攪拌時(shí)間對(duì)DC-CS/PT-NPs 影響指標(biāo)的考察 (±s, n = 3)Table 5 Investigation of stirring time on impact indicators of DC-CS/PT-NPs (±s , n = 3)

攪拌時(shí)間/min 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 包封率/% 載藥量/%20 475.86±44.69 0.287±0.017 ?19.06±0.58 64.57±0.75 7.61±0.08 30 384.30±11.29 0.258±0.062 ?20.48±0.78 66.73±2.52 7.87±0.30 40 344.84±31.31 0.291±0.026 ?20.45±0.37 66.01±1.07 7.82±0.13 50 359.54±8.62 0.335±0.063 ?21.92±0.57 61.11±0.44 6.79±0.09

2.5 CCD-RSM 優(yōu)化處方

2.5.1 優(yōu)化方案設(shè)計(jì) 包封率、載藥量、粒徑、ζ 電位是NPs 的重要指標(biāo)，故選擇4 指標(biāo)進(jìn)行CCDRSM 實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前期單因素考察結(jié)果，殼聚糖質(zhì)量濃度（X1）、果膠質(zhì)量濃度（X2）和殼聚糖pH 值（X3）對(duì)DC-CS/PT-NPs 粒徑（Y1）、ζ 電位（Y2）、包封率（Y3）和載藥量（Y4）的影響較大，各個(gè)因素的水平見(jiàn)表6。將粒徑、ζ 電位、包封率和載藥量歸一化為OD 值，作為CCD-RSM 的響應(yīng)指標(biāo)。

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Design and results of response surface experimental

2.5.2 模型及方差分析 采用Design-Expert V 11.1.0.1 軟件以綜合指標(biāo)OD 值對(duì)X1、X2、X3進(jìn)行擬合，綜合考慮模型的擬合度及簡(jiǎn)潔性，進(jìn)行多元2 項(xiàng)式方程擬合，得OD 的擬合方程為OD＝0.51－0.057X1－0.0153X2－0.127X3－0.114X1X2＋0.136X1X3＋0.146X2X3＋0.066X12－0.022X22－0.095X32，R2＝0.952 2，P＜0.000 1。擬合方程R2大于0.9，表明模型擬合程度較好；模型P＜0.000 1，具有顯著性差異，失擬項(xiàng)P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，方程預(yù)測(cè)結(jié)果可靠性高，可反映實(shí)際情況。OD 值方差分析結(jié)果見(jiàn)表7，其中X1、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X12、X32有顯著或極顯著差異；以O(shè)D 值為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)交互關(guān)系的響應(yīng)面2D 和3D 效果圖見(jiàn)圖2。

表7 方差分析結(jié)果 (OD 值)Table 7 Results of variance analysis (OD value)

圖2 因素間交互作用的響應(yīng)面2D 圖和3D 圖 (OD 值)Fig.2 Response surface 2D plot and 3D plot of interaction between factors (OD value)

2.5.3 最優(yōu)處方的驗(yàn)證 根據(jù)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果，最終優(yōu)化后處方為殼聚糖質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，果膠質(zhì)量濃度為1.5 mg/mL，TPP 質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，殼聚糖pH 值為5.0。測(cè)得包封率為（61.64±1.77）%，載藥量為（8.05±0.18）%，粒徑為（418.65±4.92）nm，ζ 電位為（?14.14±0.22）mV，分別與預(yù)測(cè)值較為接近。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 最優(yōu)處方的驗(yàn)證 (±s, n = 3)Table 8 Validation of optimal prescription (±s , n = 3)

表8 最優(yōu)處方的驗(yàn)證 (±s, n = 3)Table 8 Validation of optimal prescription (±s , n = 3)

參數(shù) 包封率/% 載藥量/% 粒徑/nm ζ 電位/mV OD 值實(shí)測(cè)值 61.64±1.77 8.05±0.18 418.65±4.92 ?14.14±0.22 0.75±0.06預(yù)測(cè)值 62.14 7.74 442.69 ?16.49 0.79相對(duì)偏差/% 1.76 4.08 5.43 14.54 4.68

相對(duì)偏差＝(預(yù)測(cè)值－實(shí)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值

2.6 DC-CS/PT-NPs 的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.6.1 粒徑和ζ 電位的測(cè)定 巖黃連堿是一種季銨鹽基上帶強(qiáng)正電荷的小檗堿類生物堿。果膠是從柑橘等植物中提取的一種多糖，含有帶負(fù)電的羧基。果膠與帶相反電荷的殼聚糖和巖黃連堿之間的靜電作用導(dǎo)致形成穩(wěn)定的NPs。取DC-CS/PT-NPs 凍干粉末，用10 mL 1%鹽酸復(fù)溶，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲8 min，功率為630 W，于粒度儀測(cè)定其粒徑為（422.20±7.87）nm，ζ 電位為（?15.91±0.62）mV，結(jié)果見(jiàn)圖3。巖黃連堿、DC-CS/PT-NPs、CS/PT-NPs的外觀圖以及DC-CS/PT-NPs、CS/PT-NPs 的凍干粉圖見(jiàn)圖4，納米粒凍干后為較為蓬松的粉末狀。

圖3 DC-CS/PT-NPs 的粒徑和ζ 電位Fig.3 Particle size and ζ potential of DC-CS/PT-NPs

圖4 巖黃連堿 (a)、DC-CS/PT-NPs (b)、CS/PT-NPs (c)的外觀圖Fig.4 Appearance of dehydrocavidine (a), DC-CS/PT-NPs(b), CS/PT-NPs (c)

2.6.2 TEM和SEM形態(tài)觀察 取復(fù)溶后的DC-CS/PT-NPs 用水適當(dāng)稀釋，取少許滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，用2%磷鎢酸染色，晾干后，TEM 下觀察其形態(tài)并拍照。取一定量DC-CS/PT-NPs 凍干粉于真空條件下噴金后置于SEM 下觀察。結(jié)果表明，制備得到的DC-CS/PT-NPs 呈類球形，粒徑在415 nm 左右，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 DC-CS/PT-NPs 的TEM 和SEM 圖Fig.5 TEM and SEM images of DC-CS/PT-NPs

2.6.3 FT-IR 分析 取巖黃連堿、DC-CS/PT-NPs、CS/PT-NPs 凍干粉、巖黃連堿與CS/PT-NPs 凍干粉的物理混合物適量分別與100.0 mg 溴化鉀基質(zhì)混合研磨，10 MPa 下壓成薄片，置于紅外光譜儀下掃描，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，巖黃連堿、巖黃連堿與DCCS/PT-NPs 的物理混合物、巖黃連堿與CS/PT-NPs的物理混合物在1 550 cm?1都有C-N 單鍵的特征吸收峰，而CS/PT-NPs、DC-CS/PT-NPs 在1 550 cm?1沒(méi)有IR 吸收。2 700～3 100 cm?1是甲基、亞甲基及次甲基的伸縮振動(dòng)，1 650～1 750 cm?1是碳基的特征吸收。這表明DC-CS/PT-NPs 制備成功。

圖6 巖黃連堿 (a)、巖黃連堿＋DC-CS/PT-NPs (b)、CS/PT-NPs (c)、巖黃連堿＋CS/PT-NPs (d)、DC-CS/PTNPs (e) 的FT-IR 圖Fig.6 FT-IR of dehydrocavidine (a), dehydrocavidine +DC-CS/PT-NPs (b), CS/PT-NPs (c), dehydrocavidine +CS/PT-NPs (d), DC-CS/PT-NPs (e)

2.6.4 差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）分析 取巖黃連堿、DC-CS/PT-NPs、CS/PTNPs 凍干粉、巖黃連堿與CS/PT-NPs 凍干粉的物理混合物，進(jìn)行DSC 測(cè)定置于鋁制樣品盤中壓制后，在DSC 的樣品室中，以空鋁缽為參比進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試條件：氣氛為氮?dú)猓瑨呙铚囟?0～300 ℃，加熱速率10 ℃/min，結(jié)果見(jiàn)圖7。巖黃連堿、巖黃連堿和CS/PT-NPs 物理混合物在265 ℃有明顯的放熱峰，DC-CS/PT-NPs 和CS/PT-NPs 則沒(méi)有，這表明巖黃連堿成功被包裹在NPs 里。

圖7 DC-CS/PT-NPs 的DSC 圖Fig.7 DSC of DC-CS/PT-NPs

2.6.5 X 射線衍射（X-ray diffraction，XRD）分析取巖黃連堿、DC-CS/PT-NPs、CS/PT-NPs 凍干粉、巖黃連堿與CS/PT-NPs 凍干粉的物理混合物進(jìn)行XRD 測(cè)定，測(cè)定條件：Cu κα 輻射（0.154 056 nm），掃描范圍5°～45°，掃描速率5°/min，結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果顯示，巖黃連堿的特征峰出現(xiàn)在巖黃連堿與CS/PT-NPs 物理混合物掃描圖中，在DC-CS/PT-NPs、CS/PT-NPs 掃描圖中消失，這表明DC-CS/PT-NPs 制備成功。

圖8 DC-CS/PT-NPs 的XRD 圖Fig.8 XRD of DC-CS/PT-NPs

2.6.6 體外釋藥特性[17]采用透析袋法考察DCCS/PT-NPs 的體外釋放。將1 mL DC-CS/PT-NPs 加入透析袋中，在20 mL pH 2.0 鹽酸溶液中懸浮振蕩2 h，模擬過(guò)渡胃狀態(tài)；然后，將透析袋懸浮在20 mL pH 6.8 磷酸鹽緩沖液（PBS）中振蕩4 h，以模擬小腸狀態(tài)；透析袋進(jìn)一步懸浮在20 mL 有腸道菌群（從SD 大鼠盲腸過(guò)濾液中獲得）存在的pH 7.4 PBS 中振蕩8 h。于（37.0±0.5）℃恒溫振蕩器中振蕩，在0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、6.00、8.00、10.00、12.00、14.00、16.00 h 取1 mL 釋放液，并補(bǔ)充等量等溫的釋放介質(zhì)。釋放液離心，取上清過(guò)0.22 μm 濾膜，進(jìn)行HPLC 測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 巖黃連堿和DC-CS/PT-NPs 體外釋放曲線Fig.9 Release profiles in vitro of dehydrocavidine and DCCS/PT-NPs

測(cè)試不同模擬生理?xiàng)l件下的DC-CS/PT-NPs 的粒徑和TEM 圖，結(jié)果見(jiàn)圖10。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DCCS/PT-NPs 在人工胃液中2 h 僅釋放24.35%，在人工腸液中4 h 釋放＜40%，在人工結(jié)腸液中釋放＞85%。從圖10 可看出，納米顆粒在pH 2.0 和pH 6.8條件下較為穩(wěn)定，粒徑變化較小，且納米粒較為完整，而在含有腸道微生物的pH 7.4 條件下較為敏感，粒徑明顯變大，且納米粒已被完全破壞。在結(jié)腸部位，由于pH 值的變化及腸道菌群介導(dǎo)，殼聚糖和果膠的靜電引力減弱，導(dǎo)致NPs 被破壞，大量巖黃連堿爆發(fā)釋放。

這個(gè)結(jié)果提示，DC-CS/PT-NPs 可能為一種很有前景的結(jié)腸給藥載體，可保護(hù)藥物不被腸道酶降解，同時(shí)減少上消化道刺激。

2.6.7 體外釋放模型的建立[18]根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版[19]，將釋放結(jié)果用常見(jiàn)的動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果見(jiàn)表9。決定系數(shù)（R2）越高的動(dòng)力學(xué)模型被認(rèn)為是最符合的藥物釋放動(dòng)力學(xué)模型[20]。從表9 可知，巖黃連堿和DC-CS/PT-NPs 的體外釋放分別以一級(jí)模型和Riger-Peppas 釋放模型釋放。經(jīng)過(guò)制備成NPs，改變了其釋放模型，DC-CS/PT-NPs 在胃和小腸生理?xiàng)l件下釋放緩慢，表現(xiàn)出較好的藥物緩釋效果，到達(dá)結(jié)腸部位大量釋放，起到了結(jié)腸靶向作用。

表9 巖黃連堿和DC-CS/PT-NPs 的釋藥模型擬合方程Table 9 Drug release model fitting equations of dehydrocavidine and DC-CS/PT-NPs

3 討論

巖黃連堿是從巖黃連中分離得到的季銨堿類化合物，是巖黃連總堿的主要活性成分。多項(xiàng)研究表明，巖黃連堿具有護(hù)肝及抗肝纖維化等藥理作用。Li 等[21]研究包括巖黃連堿在內(nèi)的4 種生物堿在大鼠體內(nèi)iv 和口服給藥2 種狀態(tài)下的藥動(dòng)學(xué)，其中巖黃連堿口服最終消除半衰期為（154.86±94.51）min，口服生物利用度為（13.24±10.86）%，表明巖黃連堿口服給藥后存在顯著的首過(guò)效應(yīng)，口服生物利用度低。同時(shí)，吳方等[22]證實(shí)了大鼠ig 給予巖黃連提取物后，其通過(guò)肝臟和腸道代謝，在大鼠血液、尿液及糞便中均可發(fā)現(xiàn)巖黃連堿的代謝物，表明巖黃連堿口服制劑的開發(fā)是一個(gè)有利的應(yīng)用方向。然而巖黃連堿水溶性差，口服生物利用度低限制了其開發(fā)應(yīng)用。納米粒包封是克服藥物疏水性方法中的一種。研究報(bào)道，結(jié)腸給藥系統(tǒng)是基于pH 敏感和控釋防止藥物在到達(dá)結(jié)腸前完全釋放[23]。殼聚糖/果膠聚電解質(zhì)復(fù)合物可成功負(fù)載牛血清蛋白（BSA），BSA 在結(jié)腸部位的累計(jì)釋放率達(dá)到30%～50%，表明殼聚糖/果膠可以用作結(jié)腸定位釋藥的載體[16,24]。

因此本研究選用巖黃連堿為模型藥物，殼聚糖和果膠作為口服給藥的載體材料，采用離子凝膠法制備一種對(duì)結(jié)腸特殊生理環(huán)境有特異性響應(yīng)的聚電解質(zhì)復(fù)合納米粒DC-CS/PT-NPs。本研究成功制備DC-CS/PT-NPs，并對(duì)其進(jìn)行表征。從TEM 結(jié)果可以看出，納米粒呈類球形；粒徑為（422.20±7.87）nm，較為均一，研究報(bào)道，粒徑＜500 nm 的顆粒可以通過(guò)腸上皮細(xì)胞的內(nèi)吞作用吸收[25]。DC-CS/ PTNPs 的表面負(fù)電荷為（?14.14±0.22）mV。納米顆粒是否會(huì)積聚或黏附在血流中或與帶相反電荷的細(xì)胞膜相互作用取決于ζ電位[26]。DC-CS/PT-NPs 包封率為（61.64±1.77）%，考慮是巖黃連堿在水和冷乙醇的溶解度較低[8]，部分藥物析出，從而導(dǎo)致包封率較低。

利用胃腸道pH 值的變化規(guī)律及腸道菌群的調(diào)控，采用殼聚糖和果膠這2 種輔料，將藥物制備成pH 依賴型聚合物。pH 值介于3.0～6.0 時(shí)，果膠分子中的-COOH 發(fā)生部分去質(zhì)子化，形成-COO?，可與殼聚糖中的-NH3+發(fā)生離子交聯(lián)，形成-COO?＋NH3-次價(jià)鍵，通過(guò)靜電作用形成聚電解質(zhì)復(fù)合物[27]。果膠耐受高酸的胃部環(huán)境，且并不被胃部?jī)?nèi)的蛋白酶、淀粉酶分解，可保護(hù)巖黃連堿在胃腸道環(huán)境中不被釋放。在富含菌群的人工結(jié)腸液段，腸道微生物觸發(fā)果膠的降解，同時(shí)因pH 值的改變果膠羧基基團(tuán)大量解離，納米粒溶解并釋放藥物。在本研究中，不同的pH 值環(huán)境模擬了體內(nèi)胃腸道，并測(cè)定DC-CS/PT-NPs 中巖黃連堿的釋放率。在人工胃液中2 h 僅釋放24.35%，隨著pH 值升高，巖黃連堿的釋放量逐漸增加，在人工腸液中4 h 累積釋放率＜40%，到達(dá)人工結(jié)腸液中10 h 后累積釋放率＞85%。結(jié)合DC-CS/PT-NPs 在不同pH 值條件下粒徑和形態(tài)變化，可以說(shuō)明DC-CS/PT-NPs 保護(hù)巖黃連堿不被胃和腸道破壞，起到結(jié)腸靶向作用。

綜上所述，本研究采用具有良好生物相容性的天然材料殼聚糖和果膠負(fù)載巖黃連堿，成功制備了類球形，粒徑較為均一的DC-CS/PT-NPs。通過(guò)體外釋放度實(shí)驗(yàn)，表明DC-CS/PT-NPs 可保護(hù)藥物經(jīng)過(guò)胃腸環(huán)境，在結(jié)腸環(huán)境釋放。DC-CS/PT-NPs 有望通過(guò)將巖黃連堿靶向結(jié)腸通過(guò)調(diào)控腸道微生物群和改善腸道屏障、腸肝炎癥從而起到抗肝纖維化效果。后續(xù)將繼續(xù)研究DC-CS/PT-NPs 體內(nèi)抗肝纖維化藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)，以期為民族藥巖黃連堿新型口服保肝制劑的研發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突