電針調控瞬時受體電位TRPV1表達與急性痛風性關節炎大鼠疼痛的關系*

李赟 張如峰 吳文英

(西寧市第一人民醫院風濕免疫血液科,青海 西寧 810000)

痛風疼痛是最嚴重的疼痛癥狀之一,會嚴重影響患者的生活質量[1]。因此,開發減輕痛風疼痛的有效止痛方法具有重要的臨床意義。當前減輕痛風疼痛的治療方法仍限于秋水仙堿、非甾體抗炎藥和皮質類固醇。然而,使用這些藥物常常會導致嚴重的不良反應,例如胃腸道不良反應、慢性腎功能不全、煩躁不安和免疫抑制[2-3]。電針(Electroacupuncture,EA)是一種將傳統針灸和現代電療相結合的技術,它可以在許多急性和慢性疼痛條件下產生令人滿意的鎮痛作用,并且幾乎沒有副作用[4]。動物研究表明,EA在多種炎癥性疼痛模型中均能抑制疼痛反應,包括完全弗氏佐劑引起的炎癥性疼痛,膠原蛋白引起的類風濕性關節炎疼痛,皮膚切開后疼痛和纖維肌痛[5-6]。在臨床上,據報道EA可以改善急性痛風性關節炎患者的視覺模擬量表評分[7]。然而,直到現在,尚不清楚EA在減輕急性痛風性關節炎動物模型中疼痛反應的潛在機制。香草酸(TRPV)是瞬時受體電位(TRP)家族的六個跨膜結構域之一,其中香草酸亞型1(TRPV1)是周圍感覺神經元的傷害感受器,可以識別來自周圍神經末梢的感覺輸入,并在尿酸單鈉鹽誘導的傷害感受和炎癥中起相關作用,表明它是治療急性痛風發作的潛在靶點[8]。因此,本研究通過將尿酸鈉注射至踝關節建立急性痛風性關節炎大鼠模型,觀察EA治療是否有助于降低該模型的疼痛反應以及對外周背根神經節與中樞脊髓背角中TRPV1及其相關下游分子表達情況的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 使用SPF級雄性SD大鼠60只,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司(合格證編號:SCXK 2016-0005),體重180～240 g。在可控溫度和光/暗周期為12 h的環境下,每只籠子飼養6只大鼠。自由攝取食物和水。本研究涉及的動物實驗方案經本院倫理委員會批準同意(倫理號:2019025)。

1.2 材料與儀器 尿酸鈉購自美國Sigma-alorich公司;蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液購自美國Amresco公司;抗TRPV1購自以色列Alomone公司;S100B、GFAP、RAGE購自美國Millipore公司;辣根過氧化物酶偶聯的二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;ECL Western印跡檢測試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司。LH-202H韓氏穴位神經刺激儀購自河北潤連機械設備有限公司;von Frey細絲購自意大利UGO Basile公司;37450動態足底觸覺儀購自意大利Ugo Basile公司;Quantity One軟件購自美國Bio-Rad實驗室。

1.3 方法

1.3.1 急性痛風性關節炎大鼠模型建立 60只大鼠分為4組,即對照組、模型組(尿酸鈉誘導的急性痛風性關節炎大鼠模型)、假EA治療組(Sham EA,尿酸鈉誘導的急性痛風性關節炎大鼠模型+假性EA治療)和EA治療組(尿酸鈉誘導的急性痛風性關節炎大鼠模型+EA治療),每組15只。將尿酸鈉懸浮在無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。在手術前,先用70%的酒精對腳踝區域進行消毒。對照組接受50 μL PBS注射。進行小切口后,通過一根21號針頭將1.25 mg尿酸鈉(50 μL)注射到大鼠踝關節中,該針頭恰好位于脛骨前肌腱的內側,其尖端傾斜成45°。注射后4～6 h,觀察到明顯的踝關節腫脹和機械痛覺過敏視為痛風性關節炎模型成功建立。模型組、假EA治療組和EA治療組所有大鼠均成功建立急性痛風性關節炎模型。

1.3.2 EA治療 EA治療組分別在模型建立后第8、24和48 h進行EA治療。具體操作為:將大鼠松散固定,將四根直徑0.25 mm的不銹鋼灸針以5 mm的深度插入雙側足三里(ST36,脛骨前小結外側5 mm)和昆侖(BL60,在踝關節水平、外踝尖和跟骨之間)穴位。針頭與LH-202H韓氏穴位神經刺激儀(河北潤連機械設備有限公司)連接。輸出2/100Hz疏密波(2Hz刺激的脈沖寬度:0.6 ms,100Hz刺激的脈沖寬度:0.2 ms,每種頻率持續3 s)和強度范圍為1～2 mA(開始時為1 mA持續15 min,然后切換為2 mA持續15 min),每次治療30 min。對于假EA治療組,將針頭皮下插入ST36和BL60,但沒有放電。

1.3.3 踝關節水腫的測定 水腫是通過數字卡尺測量的踝關節直徑增加而觀察到的,其計算公式為基礎值與測試值之間的差異(在關節內注射尿酸鈉或PBS后的不同時間點觀察結果)。

1.3.4 持續疼痛評分評估 將大鼠分別置于透明的有機玻璃室中并適應30 min,然后每只大鼠觀察5 min。在玻璃室中,以45°角放置一面鏡子,觀察大鼠的腳。根據以下等級評估并分類大鼠愿意放在注射肢體后爪上的重量(爪壓):0=正常爪壓,兩個后爪相等的重量;1=爪子壓力輕微降低(腳掌完全在地板上,但腳趾沒有散開);2=足爪壓力適度降低(腳卷曲,僅腳的某些部分輕輕接觸地面);3=爪子壓力嚴重降低(腳完全抬起)。

1.3.5 機械性疼痛測定 將大鼠分別置于高架網地板上的透明有機玻璃室內,并在測試前使其適應30 min。機械性痛覺超敏癥是通過一系列經校準的von Frey細絲(意大利UGO Basile公司)垂直于后爪的足底中部表面施加足夠的力,使細絲輕微彎曲3～5 s來確定。爪子突然縮回、舔以及對刺激的強烈震動被認為是疼痛樣反應。通過非參數Dixon測試計算出50%的爪退縮閾(PWT)。在正式測試之前,連續3 d每天進行PWT的基線測試,以使大鼠適應環境并確保各組之間沒有差異。

1.3.6 熱痛覺過敏的測定 使用37450動態足底觸覺儀(意大利Ugo Basile公司)評估對熱刺激(熱痛覺過敏)的超敏反應。在測試前使大鼠適應30 min。將燈泡產生的輻射光束導入右后爪,以確定爪縮回潛伏期(從刺激中移出爪所需的時間)。設置20 s的截止閾值,以避免過熱導致傷害。爪縮回潛伏期的明顯減少認為熱痛覺過敏。

1.3.7 踝關節的組織病理學評價 在注射尿酸鈉后8 h處死大鼠,解剖踝關節,去除關節周圍組織。將踝關節固定在10%福爾馬林中,并使用10% EDTA脫鈣。然后通過在不同等級的乙醇/氯仿混合物中進行處理將其脫水,并包埋在石蠟中。將切片切成6 μm的厚度,并用蘇木精和曙紅染色以在光學顯微鏡下進行病理檢查。

1.3.8 免疫印跡(Western blot)測定 在完成動物行為測試后,立即切除大鼠外周背根神經節與中樞脊髓背角以提取蛋白質。通過在含有50 mM Tris-HCl pH 7.4、250 mM NaCl,1%NP-40、5 mM EDTA,50 mM NaF,1 mM Na3VO4、0.02%NaN3和1x蛋白酶抑制劑混合物的裂解緩沖液(美國Amresco公司)中勻漿組織來制備總蛋白。將提取的蛋白質通過8%SDS-Tris甘氨酸凝膠電泳,然后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶在TBS-T緩沖液(10 mM Tris pH 7.5,100 mM NaCl,0.1%Tween 20)中封閉膜,并與抗TRPV1(～95 kDa,1∶1 000,以色列Alomone公司),S100B(～51 kDa,1∶1 000,美國Millipore公司),GFAP(～125 kDa,1:1 000,美國Millipore公司),RAGE(～80-82 kDa,1∶1 000,美國Millipore公司)在室溫下孵育過夜。在室溫下用適當的辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1∶5 000;美國Santa Cruz Biotechnology公司)覆蓋2 h。用ECL Western印跡檢測試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)對蛋白條帶進行可視化。使用Quantity One軟件(美國Bio-Rad實驗室)對條帶密度進行定量。

2 結果

2.1 尿酸鈉誘導大鼠急性痛風性關節炎模型的建立及鎮痛性能的評價 與對照組相比,模型組大鼠的踝關節在尿酸鈉注射后2 h時表現出廣泛的腫脹,并在8 h時達到峰值,持續到注射后48 h,在注射后72 h,踝關節腫脹完全消失(圖1A)。在注射尿酸鈉后8 h,顯微鏡觀察踝關節滑膜組織學切片顯示,模型組大鼠炎癥細胞廣泛浸潤,并伴有局灶性滑膜增生(圖1B)。模型組大鼠表現出明顯的持續性疼痛行為,這些行為持續到尿酸鈉注射后48 h(圖1C)。模型組大鼠表現出明顯而持久的機械性超敏反應,在尿酸鈉注射后2 h達到峰值,并持續到48 h(圖1D)。此外,模型組大鼠表現出輕度的熱超敏反應,該反應在尿酸鈉注射后4 h出現并持續到24 h(圖1E)。上述數據表明,該大鼠痛風模型概括了人類急性痛風發作的疼痛反應。因此,以下實驗利用該模型并在尿酸鈉注射后0～48 h之間進行,以研究EA是否以及如何減輕急性痛風性關節炎的疼痛反應。

圖1 大鼠急性痛風關節炎模型的建立以及疼痛的表征

2.2 EA對尿酸鈉所致痛風大鼠疼痛反應的影響 與之前一樣,將尿酸鈉注射到大鼠腳踝導致持續疼痛評分明顯升高,以及50% PWT和爪退縮潛伏期明顯減少。與假EA組相比,在8、24和48 h時間點,EA治療顯著降低了痛風大鼠的持續疼痛評分(P<0.05),同時顯著增加了50% PWT和爪退縮潛伏期(P<0.05)。以上結果表明,EA治療有效緩解了尿酸鈉誘發的急性痛風性關節炎的持續疼痛,并產生穩定而持久的抗痛覺過敏和抗熱痛覺過敏。見圖2。

圖2 EA對尿酸鈉所致痛風大鼠疼痛反應的影響

2.3 EA對TRPV1和相關下游分子的蛋白水平表達影響 使用Western blot分析來確定EA治療是否可以改變痛風大鼠疼痛反應相關的TRPV1及其下游分子的蛋白表達水平。結果表明,無論在背根神經節與中樞脊髓背角,與對照組相比,模型組TRPV1和相關的下游蛋白激酶(S100B、GFAP和RAGE)水平表達均顯著提高(P<0.05)。EA治療顯著降低了TRPV1和相關的下游蛋白激酶(S100B、GFAP和RAGE)的過表達(P<0.05),而假EA治療并沒有改變這一觀察結果。見圖3。

圖3 EA對TRPV1和相關下游分子的蛋白水平表達影響

3 討論

尿酸鈉在關節內和關節周圍沉積會引起白細胞浸潤,從而吞噬尿酸鈉。該過程將產生炎性和傷害感受介質[9-12]。這些介體(例如IL-1β和過氧化氫)可致敏或直接激活周圍感覺神經系統中的傷害感受器,并引起劇烈疼痛[13]。本研究通過將尿酸鈉注射到大鼠的踝關節中,建立了急性痛風性關節炎大鼠模型。該模型是用于研究痛風的疼痛反應和炎癥機制的常用動物模型。結果發現,在尿酸鈉注射后2～4 h,大鼠出現了強烈的踝關節腫脹和疼痛反應。在注射后8 h時,腫脹和疼痛反應達到高峰。踝關節滑膜組織顯示炎癥細胞廣泛浸潤和增生。這些跡象均與使用相同模型的其他研究一致,表明成功建立痛風模型[14]。但是與其他研究不同,本研究進一步延長了觀察時間,發現踝關節在尿酸鈉注射后48 h仍然表現出明顯的疼痛跡象,此后逐漸消退[15]。因此,本研究選擇在8～48 h的時間窗內檢查了EA的鎮痛作用。

先前研究比較了低頻(2 Hz)、高頻(100 Hz)和混合頻率(2/100 Hz)EA對急性痛風性關節炎的鎮痛作用,發現低頻(2 Hz)EA無效,高頻(100 Hz)與混合頻率(2/100 Hz)EA的鎮痛效果相似,但高頻(100 Hz)EA治療與混合頻率(2/100 Hz)EA治療相比,前者未能產生穩定而持久的抗痛覺過敏,表明通過重復使用100 Hz EA可能產生鎮痛耐受性[16]。還有研究報道了在弗氏完全佐劑誘發的炎癥性疼痛大鼠模型中,2/100 Hz或100 Hz EA會持續產生抗傷害感受,而10 Hz EA則完全無效[17]。基于上述數據,本研究認為2/100 Hz是減輕尿酸鈉誘發的急性痛風性關節炎疼痛反應的最佳EA頻率。因此,本研究在實驗中采用了2/100 Hz頻率進行EA治療,結果發現EA對急性痛風性關節炎大鼠模型的機械性痛覺過敏產生了良好的鎮痛效果,同時還可以顯著減輕模型大鼠的持續疼痛評分、熱痛覺過敏和踝關節腫脹。

已有研究顯示TRPV1參與多種疼痛性炎癥,包括急性痛風性關節炎[18-20]。在急性痛風發作中,通常伴隨著難以忍受的灼痛。TRPV1在有害熱的檢測中似乎很重要,因為TRPV1激動劑會誘發(而TRPV1拮抗劑會逆轉)人類的灼痛。TRPV1的激活可以進一步啟動Ca2+內流,使神經元去極化[20]。TRPV1功能的下調導致對高溫刺激,輻射熱和熱板測試不敏感[21]。炎性介質可誘導痛覺過敏激活TRPV1,提示其在炎性疼痛中的重要作用[14]。在炎性疼痛模型中,注射TRPV1拮抗劑卡西平可減輕熱痛覺過敏[22]。本研究發現,注射尿酸鈉后模型組大鼠在背根神經節與中樞脊髓背角中TRPV1的表達和相關的信號通路增加;EA處理可進一步降低TRPV1過表達,表明EA對急性痛風性關節炎疼痛有抵抗力。Wu等[23]研究表明ST36的解剖層,尤其是肌肉層中有大量的TRPV1。免疫熒光數據還顯示,TRPV1在ST36穴位神經和非神經細胞中表達。向ST36穴位注射辣椒素(TRPV1激動劑)可以像手動針灸治療一樣有效地緩解炎性疼痛,復制針灸的鎮痛作用。Zhang等[24]指出,在ST36穴位的EA可以通過減輕荷瘤大鼠背根神經節中TRPV1的mRNA和蛋白水平的表達來減輕癌癥引起的疼痛。Chen等[25]報道,在雙側ST36、BL60穴位處的EA可以減少因向踝關節內注射尿酸鈉引起的機械和熱痛覺過敏;TRPV1在炎癥性疼痛中增加,并且可以通過在周圍背根神經節處的EA刺激進一步減弱。這些結果不僅表明EA可以緩解疼痛,還表明EA可以減少小到大直徑神經元中TRPV1的過表達。此外,本研究還發現TRPV1的激活會增加S100B、GFAP和RAGE的表達,而EA治療可以減少GFAP、S100B和RAGE的過表達,從而減輕疼痛。

4 結論

EA在急性痛風性關節炎大鼠模型中可有效緩解疼痛反應,其主要通過TRPV1及其下游蛋白激酶S100B、GFAP和RAGE受體介導鎮痛作用,為實踐EA治療急性痛風性關節炎疼痛的臨床應用提供了重要證據。