攜帶不同耐藥基因對耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌適應性及毒力的影響*

瞿巧莉 李霄 王鵬飛 胡瑩 單斌 毛俊 陳如才

(1.昆明醫科大學第二附屬醫院檢驗科,云南 昆明 650101;2.云南大學省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室,云南 昆明 650032;3.昆明醫科大學第二附屬醫院中心實驗室,云南 昆明 650101;4.昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科,云南 昆明 650001)

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是自然界中常見的革蘭氏陰性腸桿菌,主要分布于人體內胃腸道和鼻咽部的正常寄居菌群[1]。當其生態位發生改變或者人體免疫力降低時,可引起肺炎、下尿路感染、菌血癥等嚴重的感染性疾病,是社區和院內感染最常見的機會致病菌之一[2];尤其對于ICU患者、有手術治療史及接受氣管插管等創傷性操作史的患者,肺炎克雷伯菌感染將帶來致命性的后果[3]。然而,隨著抗生素的不合理使用,肺炎克雷伯菌對多種抗生素的耐藥性正逐年增加,2017年曾倩倩等[4]的回顧性調查發現,肺炎克雷伯菌對頭孢吡肟、阿米卡星、頭霉素等各類常用抗生素的耐藥率也呈不同程度上升,使得碳青霉烯類抗生素成為了對抗肺炎克雷伯菌的最后一道防線[5]。然而,近十年來耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)的檢出率呈逐年上升趨勢[6]。這將給臨床感染的治療及控制帶來巨大的挑戰。有研究報導,我國目前流行的CRKP主要為CG258(Clonal group)克隆的ST11型菌株,占我國CRKP的60%[7]。CRKP的耐藥性主要通過菌體產生碳青霉烯酶水解抗生素所賦予,碳青霉烯酶基因通常由CRKP的大型耐藥質粒攜帶,常見的類型包括blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM及blaIMP等[8-9]。Bedhomme等[10]研究表明大型耐藥質粒的攜帶會帶來差異適應性。由于質粒的運輸成本,所以會造成宿主菌適應性的降低,除此之外適應性還與攜帶耐藥基因的質粒拷貝數相關。Newbury等[11]研究也證實了細菌長期暴露于抗生素環境中可能會增加質粒-宿主之間的連接性,其所攜帶的多個質粒之間會存在互利或拮抗的相互作用。雖然攜帶耐藥基因的大型質粒能為宿主菌帶來抗生素耐藥性,但如此大型的質粒對宿主菌更廣泛的適應性效應及毒力影響尚不明確[12]。本研究主要通過探究攜帶不同耐藥基因的質粒以及攜帶單個或多個耐藥基因的質粒對CRKP環境適應性及毒力作用的影響,以期對臨床CRKP的感染控制與治療提供重要的理論依據和用藥指導。

1 材料與方法

1.1 材料 ①細菌及線蟲:收集2011年～2015年昆明醫科大學第二附屬醫院CRKP臨床分離株共10株。N2野生型秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans,C. elegans)、大腸桿菌E.coli OP50、肺炎克雷伯菌質控菌株ATCC10031、肺炎克雷伯菌ATCC700603均購自American Type Culture Collection,ATCC(https://www.atcc.org/)。②培養基:NGM線蟲培養基配方(1L): NaCl 3 g,蛋白胨2.5 g,瓊脂17 g,膽固醇(5 mg/mL,無水乙醇配置,過濾除菌)1 mL,高壓滅菌后加入過濾除菌的1 M CaCl21 mL,1 M MgSO41 mL,1 M磷酸鹽緩沖液(pH=6.0)10 mL倒入平板,過夜晾干后加適量E.coli OP50單克隆菌液制成NGM發育板上,加適量CRKP分離株的單克隆菌液制成NGM檢測板備用;LB液體及固體培養基按常規方法配置[13-14]。③主要試劑及緩沖液:M9緩沖液(1 L):七水磷酸氫二鈉5.8 g,磷酸二氫鈉3.0 g,氯化鈉5.0 g,七水硫酸鎂0.25 g,添加ddH2O至1 L,高壓蒸汽滅菌備用;線蟲 Bleach裂解液(100 mL體系):5 M NaOH 10 mL,次氯酸鈉20 mL(5%有效氯含量),ddH2O 70 mL,4 ℃避光儲存備用;1 M磷酸鹽緩沖液(pH=6.0):KH2PO4117.3 g,K2HPO424.0 g,添加ddH2O 至1 L,高壓滅菌備用;線蟲凍存液 (1 L):NaCl 5.85 g,KH2PO46.80 g,甘油300 mL,1 M NaOH 5.60 mL,滅菌后加入0.3 mL無菌1M MgSO4備用。

1.2 細菌耐藥基因型鑒定 根據檢驗科VITEK平臺的藥敏及菌種鑒定結果,收集昆明醫科大學第二附屬醫院CRKP臨床分離株10株,根據《全國臨床檢驗規程》對菌株進行分離、純化、保菌備用。采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA,利用PCR技術對碳青霉烯酶基因blaKPC、blaNDM、blaOXA、blaVIM、blaIMP,β-內酰胺類耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCTX、blaLAP進行擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,隨后對陽性條帶進行測序、Blastn比對分析。肺炎克雷伯菌ATCC10031、ATCC700603作為對照菌株。見表1。

表1 各耐藥基因PCR引物

1.3 菌種鑒定及MLST分型 擴增16S rRNA基因,sanger雙向測序后進行Blastn比對分析,鑒定菌種;PCR擴增七個管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB),sanger雙向測序后通過等位基因數據庫比對鑒定其ST類型(http://bigsdb.web.pasteur.fr/)。

1.4 細菌生長曲線測定 分離純化后的菌株從-80 ℃取出,接種于5 mL未添加亞胺培南抗生素的LB液體培養基中,200 rpm,37 ℃搖菌復蘇培養4 h。將復蘇后的細菌在無抗性LB平板上劃線過夜培養,挑取單克隆菌落在5 mL無抗LB液體培養基中增殖培養8～12 h,待細菌進入指數生長期后,用無菌PBS稀釋菌液至OD600=0.1(MCF=0.13～0.14),取稀釋后的菌液50 μL接種至加有5 mL LB液體培養基的濁度瓶中,加入亞胺培南抗生素,濃度分別為:0、2和8 mg/mL,200 rpm,37 ℃搖菌培養。測定濁度瓶初始MCF值,之后每隔30 min測定一次MCF值,連續測定24 h。每個分離株的各抗生素濃度組平行培養2瓶,整體實驗重復兩次。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制生長曲線,采用Kruskal-Wallis檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析,P<0.05為差異具有統計學意義。

1.5 線蟲侵染實驗

1.5.1 線蟲復蘇及同步化 取凍存的線蟲室溫融化,用10 mL M9緩沖液洗滌,靜置后棄上清液。將線蟲沉淀加入到含有E.coli OP50的NGM發育板上,20 ℃培養2～3 d,期間顯微鏡下觀察線蟲發育情況、密度及產卵情況,直到平板上有大量蟲卵或者線蟲體內有大量蟲卵。用3 mL M9緩沖液將線蟲及蟲卵從平板上沖洗下來,得到的混懸液裝到15 mL離心管,離心棄上清。用5 mL M9緩沖液洗滌、離心、棄上清,盡量將細菌洗凈,剩余沉淀即為線蟲和蟲卵。加入2倍體積的線蟲裂解液,劇烈漩渦震蕩5 min直至液體變得清亮,離心棄上清。此時剩下的沉淀為蟲卵,加入10 mL M9緩沖液重懸蟲卵,離心棄上清,重復兩次,以去除殘余的線蟲裂解液。再加入1 mL M9緩沖液重懸蟲卵,吸取1～2 μL蟲卵液至載玻片上推開,在顯微鏡下觀察蟲卵數量及裂解效果,將重懸后的蟲卵傾斜放置于20 ℃培養箱孵化,16 h后得到同步化的線蟲幼蟲。將線蟲幼蟲加入NGM發育板中,20 ℃培養45～54 h得到同步化的線蟲成蟲。

1.5.2 線蟲侵染 在NGM培養基中加入0.2 mmol/L的氟尿苷(Floxuridine,FUDR)以抑制線蟲繁殖,倒板,取過夜培養的單克隆菌液用M9緩沖液稀釋25倍后鋪至無抗生素的NGM平板,配置成NGM檢測板,對照組采用肺炎克雷伯菌ATCC10031和ATCC700603菌株配置。將同步化的線蟲成蟲用M9緩沖液從發育板上洗脫下來,離心棄上清,加入適量M9緩沖液重懸,取適量重懸后的線蟲加到NGM檢測板及NGM對照板上,在體式解剖鏡下計數線蟲數量,控制每個平板線蟲數為(50±5)條,每個分離株做兩個平行檢測板,整體實驗重復兩次。

1.5.3 繪制線蟲生存曲線 每天同一時間段在顯微鏡下觀察線蟲的存活情況,記錄每日死亡數量,線蟲死亡的判定標準:蟲體僵直,腫脹破裂,輕輕敲打平板線蟲仍不能運動。利用GraphPad Prism 6.0軟件繪制線蟲生存曲線,Log-rank檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細菌耐藥基因型鑒定 10個分離株耐藥基因鑒定結果見圖1、表2。

圖1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因型電泳圖

表2 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥基因型鑒定及MLST序列分型

2.2 細菌菌種鑒定及ST分型 通過對10個分離株進行16S rRNA基因驗證,對sanger測序結果進行Blastn比對,確認10個分離株均為肺炎克雷伯菌;對七個管家基因PCR擴增后測序,MLST等位基因比對后,得到5種ST類型,其中ST-11型和ST-290型各三株、ST-395型兩株、ST-340型和ST-437型各一株。見表2。

2.3 菌株生長曲線 根據碳青霉烯類耐藥基因鑒定結果,對分離株進行分組(表3),繪制生長曲線。在沒有抗生素壓力下,各組菌株生長趨勢基本一致,在2～5 h處于指數生長期,細菌生長迅速;第5～24 h生長曲線趨于穩定,處于平臺期,體系MCF值趨于穩定,各組生長曲線差異無統計學意義(P>0.05)(圖2A)。在2 mg/mL亞胺培南壓力下,對照組全程未見生長,所有分離株均在4 h后才開始進入指數生長期,6 h后進入平臺期(圖2B),攜帶單個耐藥基因組中blaIMP組細菌總量最低,其次為blaKPC組;攜帶雙耐藥基因組中blaKPC+blaNDM組、blaIMP+blaOXA組細菌總量最高。采用Kruskal-Wallis檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析發現,除blaNDM組、blaOXA組與blaNDM+blaOXA組比較沒有差異,攜帶單個耐藥基因與攜帶雙耐藥基因對細菌的生長適應性和細菌總量有不同的影響,差異均有統計學意義(P<0.001)(圖3)。在8 mg/mL亞胺培南壓力下,對照組全程未見生長,其余各組菌株表現出不同程度的適應性差異(圖2C)。其中blaKPC組、blaKPC+blaNDM組最快進入指數生長期(4～6 h),其次為blaNDM組,blaOXA組在第14 h才開始生長,15～17 h處于對數期;blaKPC組在從16 h開始曲線出現下降趨勢進入衰亡期。細菌總量以blaKPC+blaNDM組最高,blaIMP+blaOXA組最低。采用Kruskal-Wallis檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析發現,單耐藥基因組中blaNDM組和blaIMP組適應性強于blaOXA組,差異具有統計學意義(P<0.001);雙耐藥基因組中blaKPC+blaNDM組和blaNDM+blaOXA組分別比單耐藥基因組blaKPC和blaOXA生長適應性強,差異具有統計學意義(P<0.001),見圖4。

圖2 不同抗生素濃度下各菌株的生長曲線

圖3 2 mg/mL亞胺培南培養基中各組細菌總量的兩兩比較

圖4 8 mg/mL亞胺培南培養基中各組細菌總量的兩兩比較

表3 根據菌株攜帶的碳青霉烯類耐藥基因分組

2.4 線蟲生存曲線 在沒有抗生素存在的情況下,用攜帶不同耐藥基因的菌株感染線蟲后,繪制線蟲的生存曲線(圖5),采用Log-rank檢驗法對組間數據進行差異顯著性分析,與對照組(中位生存時間為9 d)相比,blaKPC組、blaKPC+blaNDM組和blaIMP+blaOXA組的生存曲線右移,中位生存時間為10 d,菌株對線蟲的毒力作用減弱(P=0.009 2、0.022、0.001 7);blaIMP+blaNDM組生存曲線左移,中位生存時間為8 d,表明菌株對線蟲的毒力作用增強,差異具有統計學意義(P=0.0064);其余各組中位生存時間為9 d,與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05),菌株毒力未表現出增強或減弱。

圖5 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對線蟲毒力作用比較

3 討論

CRKP作為目前臨床耐碳青霉烯類腸桿菌科(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE)感染的主要病原菌,是臨床感染的治療與控制面臨的重大挑戰[17]。本研究通過細菌生長曲線及線蟲毒力模型,探究攜帶不同碳青霉烯類耐藥基因的CRKP菌株對環境的適應性和對線蟲毒力作用的影響,闡述不同碳青霉烯類耐藥基因的潛在風險,補充我國CRKP的分子流行特征,為CRKP的爆發流行和感染控制提供理論依據。

本研究通過在不同濃度抗生素壓力下測試各菌株的生長曲線來研究耐藥基因對CRKP適應性的影響。結果顯示,攜帶有blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株,在沒有抗生素的情況下生長速度與其他組沒有明顯差異;在抗生素存在的情況下,尤其是高濃度抗生素(8 mg/mL)下,生長速度明顯高于其他組,說明攜帶blaKPC和blaKPC+blaNDM抗性基因的菌株在抗生素環境中適應性更強,這或許是由于其對抗生素的耐受、水解能力增強,將有助于其在抗性環境中增殖與傳播。而攜帶blaOXA的菌株,在高濃度抗生素存在的情況下,生長明顯被抑制,這可能是由于其對亞胺培南的水解作用較弱所導致的。所以攜帶不同的耐藥基因會產生不同的適應性效應,在菌株的生長速度和細菌總量上體現出不同的效果。攜帶blaKPC和blaKPC+blaNDM的菌株在抗生素環境中表現出的較強種群生長增殖能力,使得他們更為廣泛傳播,而攜帶其他耐藥基因的菌株在高濃度抗生素下生長較弱,所以只是零星爆發。

本研究通過線蟲侵染模型探究不同碳青霉烯類耐藥基因對菌株毒力的影響。結果顯示,在沒有抗生素的情況,攜帶blaKPC、blaKPC+blaNDM和blaIMP+blaOXA耐藥基因的菌株感染線蟲后,線蟲中位生存時間較其他組有所延長,說明對線蟲的毒力作用相較于其他菌株更低,而D′Apolito[18]、McLaughlin[19]等的研究結果也表明攜帶blaKPC會使菌株毒力降低,本文研究結果與其一致。雖然毒力減弱或許更利于臨床感染的控制與治療,但是隨著近年來的高毒力耐藥株被報道,攜帶blaKPC的耐藥株的毒力作用也在逐漸增強[20],高毒力耐藥株的出現也將為臨床帶來新的挑戰。在感染blaNDM+blaIMP菌株后,線蟲中位生存時間有所縮短,說明其毒力作用增強了。攜帶blaNDM、blaIMP、blaOXA、blaNDM+blaOXA與對照組相比差異無統計學意義,說明菌株毒力并沒有表現出增強或者減低。G?ttig[21]和Liu等[22]研究結果表明攜帶blaNDM并不會增強菌株的毒力,Jia等[23]的研究結果表明其為低毒力菌株,本研究結果與其一致。而攜帶blaKPC的菌株毒力強于blaOXA菌株這一點在本研究中并沒有得到證實,與Mil-Homens等[24]的研究結果有差異。

碳青霉烯類耐藥基因一般位于大型質粒上,由于質粒之間存在相互作用,所以攜帶單個耐藥質粒與攜帶多個耐藥質粒所帶來的適應性和毒力作用不同[25]。在細菌生長曲線測試結果可以看出,攜帶多個耐藥質粒最終對細菌適應性的影響似乎有加乘效應。在抗生素存在時,單獨攜帶blaKPC或blaNDM的菌株生長適應性都較強,同時攜帶blaKPC和blaNDM的菌株表現出了強于單獨攜帶時的適應性。而且在blaIMP和blaOXA組也能觀察到相似的效應:同時攜帶blaIMP和blaOXA的菌株比單獨攜帶blaIMP或blaOXA的菌株表現出了更強的適應性,生長速度和細菌總量明顯高于單獨攜帶的菌株。但是在線蟲毒力模型中,攜帶雙抗性質粒的菌株,毒力作用的改變并不是兩個耐藥質粒毒力作用的簡單加乘或拮抗效果,由于本研究涉及樣本量較小,雙耐藥質粒對毒力作用的影響規律和作用機制還需要更進一步研究。

值得注意的是,結合耐藥基因與ST分型數據,本研究發現在本研究中所有ST11型菌株都恰好攜帶了blaKPC抗性基因。攜帶blaKPC基因所帶來的低毒力效應及高濃度抗生素壓力下的強適應性、強增殖能力,可能正是導致ST11型菌株成為我國CRKP的主要流行克隆株。

適合度代價是指在沒有選擇壓力的情況下,攜帶耐藥質粒的菌株相較于沒有該質粒的菌株表現出來的生長緩慢、競爭力減弱和(或)毒力減低等現象[26]。本研究發現無抗生素時,blaKPC組和blaKPC+blaNDM組菌株對線蟲的毒力作用有所降低,說明這兩組菌株可能存在一定的適合度代價。這可能是由于獲得耐藥質粒為宿主菌帶來了額外的DNA復制負擔,從而對細菌細胞的復制速率產生了負面影響[27],生長增殖速度降低;菌株在提高環境適應性的同時,通過降低自身毒力,以減輕宿主菌的代謝負擔,利于菌株的增殖與傳播。在選擇壓力存在的條件下,攜帶有耐藥質粒的菌株優勢就得以彰顯,將會表現出更高的環境適應性和更強的抗生素耐受能力。本研究中這兩組菌株在抗生素存在時顯示出明顯的生長優勢,也印證了適應性代價的存在。Li等[28]研究也證實了blaKPC基因的表達會帶來適應性代價,對菌株產生負面影響。對于blaKPC+blaNDM雙抗性菌株,臨床報道并不多,在Gao等[29]研究中,利用大腸桿菌EC600作為受體菌,獲得的雙抗性轉化株并不存在適應性代價,與本研究所采用雙抗性原始分離株進行測試的結果不符,這可能是因為耐藥質粒存在宿主菌依賴性。Di等[30]研究表明blaKPC在CRKP和在E.Coli中的適應度成本不一樣,說明質粒-宿主菌的相互作用是特異性的,不同遺傳背景的宿主菌基因表達會影響質粒基因的表達,這或許可以解釋為什么本研究中blaKPC+blaNDM雙抗性菌株存在適應性代價,而Gao等[29]的研究中卻有不一樣的結果。

4 結論

攜帶不同的碳青霉烯類耐藥基因會對CRKP菌群產生不同的適應性影響和毒力作用。了解臨床分離株的耐藥基因攜帶情況及既往抗生素使用史,有助于了解菌群的生長增殖狀態和毒力情況,從而更有針對性的選擇抗生素,并在不同的時間節點上調整抗生素用量,更好的控制感染。