冷鏈流通中溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦持水性及質(zhì)構(gòu)特性的影響

李楨楨,尹明雨,王錫昌*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海,201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海,201306) 3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,上海,201306)

南美白對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)屬十足目、對(duì)蝦科,其營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美、肉質(zhì)細(xì)膩,深受消費(fèi)者的喜愛(ài)。南美白對(duì)蝦在20世紀(jì)90年代初期成功進(jìn)行人工繁殖,其養(yǎng)殖規(guī)模隨消費(fèi)者需求量的增加而擴(kuò)大,2021年我國(guó)養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦產(chǎn)量高達(dá)197.74萬(wàn)t,占全國(guó)養(yǎng)殖蝦類(lèi)總產(chǎn)量的36.97%[1]。

目前,南美白對(duì)蝦主要以冷凍品形式銷(xiāo)售。冷鏈運(yùn)輸是指冷藏冷凍品從生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、銷(xiāo)售、配送直到消費(fèi)者手中、全過(guò)程始終處于維持其品質(zhì)所需的可控環(huán)境溫度下的特殊供應(yīng)鏈,減少因腐敗變質(zhì)引起的損耗,使產(chǎn)品保持相對(duì)較高的新鮮度[2]。近幾年,隨著人們對(duì)高品質(zhì)消費(fèi)需求的快速增長(zhǎng),冷鏈物流行業(yè)發(fā)展規(guī)模顯著擴(kuò)大。然而,冷鏈流通過(guò)程中由于冷鏈設(shè)備缺乏、物流技術(shù)落后和物流不規(guī)范等原因常會(huì)出現(xiàn)“斷鏈”現(xiàn)象[3],使得冷凍水產(chǎn)品在運(yùn)輸、貯藏和銷(xiāo)售等過(guò)程中不可避免地會(huì)發(fā)生溫度波動(dòng)。溫度波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致水產(chǎn)品肌肉組織中的冰晶重結(jié)晶、蛋白變性、汁液流失等,嚴(yán)重影響其食用品質(zhì)。韓洋[4]對(duì)國(guó)內(nèi)冷鏈近距離運(yùn)輸和遠(yuǎn)距離運(yùn)輸時(shí)低溫運(yùn)輸車(chē)內(nèi)的溫度進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄,總結(jié)發(fā)現(xiàn)3 d內(nèi)運(yùn)輸車(chē)內(nèi)小幅度溫度波動(dòng)范圍為5 ℃左右,大幅度溫度波動(dòng)范圍為12 ℃左右,某些極端條件下甚至?xí)郎刂? ℃,全程波動(dòng)頻率在1～4次。SZYMCZAK等[5]將腌制7 d后的海鯡魚(yú)片分別置于恒溫-19 ℃和在-19～-23 ℃周期性變化的溫度下貯藏5個(gè)月,結(jié)果發(fā)現(xiàn)溫度波動(dòng)組魚(yú)片的硬度、色澤和感官評(píng)分顯著高于恒溫組,溫度波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致肌肉組織結(jié)構(gòu)和溶酶體膜的分解。XIE等[6]模擬帶魚(yú)在恒溫冷鏈、運(yùn)輸和零售過(guò)程中的溫度波動(dòng),研究表明魚(yú)片溫度波動(dòng)次數(shù)越多,其品質(zhì)劣變速度越快,顯著高于貯藏在恒定溫度的樣品。ZHANG等[7]將冷凍凡納濱對(duì)蝦在-18～4 ℃進(jìn)行溫度波動(dòng),結(jié)果顯示溫度波動(dòng)會(huì)導(dǎo)致冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶現(xiàn)象,從而使得解凍損失、肌纖維間隙增大,降低了其硬度、彈性、肌原纖維蛋白含量和Ca2+-ATPase活性?，F(xiàn)階段,國(guó)內(nèi)外針對(duì)溫度波動(dòng)的研究主要集中在水產(chǎn)品的凍融循環(huán)過(guò)程,以及將物流運(yùn)輸分為多個(gè)階段,每個(gè)階段不同溫度的切換波動(dòng)中。而真正冷鏈流通中的溫度波動(dòng)研究較少,且鮮有對(duì)持水性及質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行深入的分析。

本研究依據(jù)冷鏈流通過(guò)程中環(huán)境溫度可能發(fā)生小幅度、大幅度以及極端波動(dòng),對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦分別進(jìn)行-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃ 3個(gè)溫度波動(dòng)處理,研究不同溫度波動(dòng)及次數(shù)對(duì)其持水性及質(zhì)構(gòu)的影響并探究其內(nèi)在機(jī)理,旨在為冷凍南美白對(duì)蝦在冷鏈流通過(guò)程中的品質(zhì)調(diào)控提供參考和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍南美白對(duì)蝦整蝦[(24.87±3.01) g/尾,n=2 000]于2022年8月采購(gòu)于上海新魚(yú)港國(guó)際貿(mào)易有限公司,置于泡沫箱中加干冰、冰袋,12 h內(nèi)運(yùn)輸至上海海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)室,在-18 ℃冰箱內(nèi)貯藏備用。該樣品由工廠(chǎng)專(zhuān)業(yè)化條件進(jìn)行凍結(jié)并在-18 ℃下貯藏12個(gè)月,出廠(chǎng)日期一致且均在保質(zhì)期內(nèi)。

濃鹽酸、Tris,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛固定液、考馬斯亮藍(lán),上海麥克林生化科技有限公司;Carnoy固定液、無(wú)水乙醇、伊紅染液,北京索萊寶科技有限公司;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5,5′-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB],上海阿拉丁生化科技股份有限公司;以上均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RC-4溫度記錄儀,江蘇省精創(chuàng)電子有限公司;DHG-9070A型鼓風(fēng)干燥箱,上海鰲珍儀器制造有限公司;TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀,英國(guó) SMS公司;BT-224S電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;FJ200-SH型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī),上海標(biāo)本模型廠(chǎng);H2050R高速冷凍離心機(jī),長(zhǎng)沙湘儀有限公司;UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),中國(guó)上海美普達(dá)公司;HWS-24電熱恒溫水浴鍋,上海恒科學(xué)儀器;AE-6500垂直電泳槽,日本ATTO公司;F-7100熒光分光光度計(jì),日本日立高新技術(shù)公司;Eclipse E100正置光學(xué)顯微鏡,日本Nikon;SU5000熱場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡,日本日立有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)韓洋[4]監(jiān)測(cè)到的國(guó)內(nèi)近距離冷鏈流通中存在的小幅度(約5 ℃)、大幅度(約12 ℃)和極端波動(dòng)(升溫至0 ℃)情況,本文設(shè)計(jì)了3種溫度波動(dòng)梯度范圍(-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃),使研究更貼合實(shí)際運(yùn)輸情況。

將冷凍南美白對(duì)蝦整蝦隨機(jī)分為3組(n=900),分別進(jìn)行-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃溫度波動(dòng)處理。溫度波動(dòng)過(guò)程主要是將冷凍南美白對(duì)蝦整蝦置于-18 ℃冰箱中并用溫度計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)其環(huán)境溫度,溫度穩(wěn)定后調(diào)節(jié)冰箱溫度至目標(biāo)溫度(-12、-6、0 ℃),待其環(huán)境溫度穩(wěn)定在目標(biāo)溫度后保持1 h,隨后將其溫度調(diào)回-18 ℃并在此溫度下貯藏24 h,即完成1次溫度波動(dòng)。重復(fù)上述操作,分別取溫度波動(dòng)0、1、3、5、7次的樣品進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.2 持水性測(cè)定

1.3.2.1 水分含量

水分含量測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》中直接干燥法。

1.3.2.2 解凍損失

稱(chēng)量解凍前和解凍后南美白對(duì)蝦的質(zhì)量,分別記為m1和m2,按公式(1)計(jì)算解凍損失:

(1)

1.3.2.3 離心損失

參考王玥科等[8]實(shí)驗(yàn)方法并略有改動(dòng)。稱(chēng)量去頭、去殼后的南美白對(duì)蝦的質(zhì)量,記為m3;用兩層濾紙包裹后置于離心管中,離心(5 000 r/min,15 min,4 ℃)后稱(chēng)量樣品質(zhì)量,記為m4。按公式(2)計(jì)算離心損失:

(2)

1.3.3 質(zhì)地剖面分析(texture profile analysis,TPA)及剪切力測(cè)定

參考李學(xué)鵬[9]的方法并略作修改。采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)南美白對(duì)蝦腹部第二節(jié)進(jìn)行2次質(zhì)地剖面分析。測(cè)定參數(shù)如下:采用P/5平底柱形探頭,測(cè)前速率為3.00 mm/s,測(cè)試速率為1.00 mm/s,測(cè)后速率為1.00 mm/s,壓縮變形率為50%,探頭2次測(cè)試停留間隔時(shí)間為5 s,觸發(fā)力為5 g,每組測(cè)定6個(gè)樣品并取平均值。

參考邱澤慧等[10]的方法并稍作修改。采用WBS探頭,沿垂直于南美白對(duì)蝦第二腹節(jié)方向完全切斷,測(cè)前速率為5.00 mm/s,測(cè)試速率為1.00 mm/s,測(cè)后速率為10.00 mm/s,壓縮程度為50%,每組樣品測(cè)6組平行并取平均值。

1.3.4 肌原纖維蛋白的提取

參考楊慧等[11]的方法并稍作修改。在2.0 g切碎的蝦肉中加入10倍體積預(yù)冷緩沖液A(0.1 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5),均質(zhì)(10 000 r/min,30 s/次)2次后離心(10 000 r/min, 10 min, 4 ℃)取沉淀。加入5倍體積緩沖液繼續(xù)離心(10 000 r/min,10 min,4 ℃),重復(fù)2次,最后所得沉淀加入相同體積緩沖液B(0.6 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5)后在4 ℃下浸提2 h,用雙層紗布過(guò)濾除去不溶性部分,濾液即為肌原纖維蛋白溶液。以牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.5 蛋白質(zhì)巰基含量的測(cè)定

根據(jù)ZHANG等[12]的測(cè)定方法并稍作修改。將提取的肌原纖維蛋白溶液調(diào)整為4 mg/mL,取0.5 mL蛋白溶液中加入4.5 mL 0.2 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5),充分混合。取上述混合液4 mL,加入0.5 mL DTNB,混合均勻后置于40 ℃水浴25 min。以0.6 mol/L的NaCl溶液代替蛋白質(zhì)溶液作為對(duì)照組,在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度。按公式(3)計(jì)算巰基含量:

(3)

式中:A412,412 nm處的吸光度;n,蛋白質(zhì)的稀釋倍數(shù);4,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL;13 600,摩爾吸光系數(shù),L/(mol·cm)。

1.3.6 內(nèi)源熒光強(qiáng)度的測(cè)定

參照Z(yǔ)HANG等[13]測(cè)定方法并稍作改動(dòng)。調(diào)整肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL,采用F-4600熒光分光光度儀進(jìn)行測(cè)定。設(shè)置參數(shù)如下:激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm,發(fā)射光譜范圍為300～400 nm,掃描速度為1 200 nm/min。

1.3.7 SDS-PAGE

參考LAEMMLI[14]的測(cè)定方法并加以調(diào)整。調(diào)整肌原纖維蛋白溶液質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL,加5×非還原蛋白上樣緩沖液并充分混合。在體積分?jǐn)?shù)4%～20%的預(yù)制膠中進(jìn)行電泳,上樣量為10 μL,在120 V電壓下電泳1 h。跑完后將凝膠置于體積分?jǐn)?shù)0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色10 min,用脫色液脫色。

1.3.8 冰晶形態(tài)的觀(guān)察與測(cè)定

參考ZHANG等[7]描述的蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色方法,觀(guān)察蝦肌肉組織中冰晶形態(tài)的變化情況。將樣品浸于固定液中過(guò)夜,用系列不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液(50%、70%、80%、90%、95%、100%)進(jìn)行梯度洗脫,用石蠟包埋后于切片機(jī)下切成5 μm厚的切片,通過(guò)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

參考史羽瑤等[15]的方法,使用ImageJ圖像分析軟件對(duì)橫截面切片圖像進(jìn)行處理并計(jì)算冰晶平均橫截面積和圓度,以評(píng)價(jià)冰晶的大小和形態(tài)。每組樣品至少選取3張圖片進(jìn)行計(jì)算,圖中的有效冰晶個(gè)數(shù)不少于100個(gè),以確保數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。

1.3.9 肌纖維微觀(guān)結(jié)構(gòu)測(cè)定

根據(jù)ZHANG等[7]方法并略有改動(dòng)。將解凍后的樣品切成2～3 mm厚的小塊,置于2.5%戊二醛固定液中固定24 h,隨后用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)洗脫3次,每次15 min;并用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)進(jìn)行梯度洗脫,每次10 min;冷凍干燥,鍍金后于掃描電鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次以上,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(Duncan’s法),顯著性差異為 95%置信區(qū)間(P<0.05)。所有圖的繪制使用Origin 2023軟件;采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行偏最小二乘法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦冰晶形態(tài)的影響

2.1.1 冰晶形態(tài)的變化

冷鏈物流中溫度波動(dòng)將導(dǎo)致冰晶的重結(jié)晶,當(dāng)冰晶再次凍結(jié)時(shí)會(huì)以小冰晶的積聚、遷移和表面等滲形式生長(zhǎng),從而使得冰晶體積變大、形態(tài)變得不規(guī)則化,擠壓肌肉組織甚至刺破細(xì)胞膜,造成不可逆的機(jī)械損傷,引起持水性、質(zhì)構(gòu)特性等食用品質(zhì)的降低[16]。冷凍南美白對(duì)蝦在不同溫度波動(dòng)下組織橫截面和縱截面中冰晶形態(tài)的變化如圖1所示,可看到未波動(dòng)組的南美白對(duì)蝦肌纖維連接緊密,部分出現(xiàn)組織間隙,但冰晶細(xì)小且分布均勻。隨著溫度波動(dòng)次數(shù)和范圍的增大,冰晶變得大且不規(guī)則,逐漸占據(jù)細(xì)胞外空間,肌纖維間隙增加,使得組織完整性降低。與-18～-12 ℃組相比,-18～-6 ℃和-18～0 ℃組樣品中冰晶形態(tài)變化更為明顯,波動(dòng)1次后冰晶開(kāi)始呈現(xiàn)出大而不規(guī)則的形態(tài),肌纖維間存在較大間隙。尤其-18～0 ℃組波動(dòng)7次后冰晶體積顯著增加,部分肌纖維膜不連貫,甚至嚴(yán)重解體,形成大量小碎片。溫度波動(dòng)次數(shù)和范圍越大,小冰晶積聚、遷移和表面等滲的程度越劇烈,形成的大且不規(guī)則冰晶極易導(dǎo)致肌肉軟化和肌纖維的形變[17]。ZHANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦在-18～4 ℃波動(dòng)6次后肌肉細(xì)胞外空間明顯變大,甚至導(dǎo)致肌肉嚴(yán)重解體,冰晶生長(zhǎng)也會(huì)降低結(jié)締組織的機(jī)械強(qiáng)度,從而引起質(zhì)構(gòu)特性的下降。

2.1.2 平均橫截面積及圓度分析

通過(guò)ImageJ圖像分析軟件計(jì)算出冷凍南美白對(duì)蝦橫截面中冰晶的平均橫截面積和圓度,可準(zhǔn)確地顯示出冰晶的大小和形態(tài),以更好地判斷溫度波動(dòng)過(guò)程中冰晶的變化對(duì)南美白對(duì)蝦品質(zhì)的影響[19]。結(jié)果如圖2所示。

3組樣品中冰晶的橫截面積整體上呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),-18～0 ℃組波動(dòng)7次橫截面積由322.07 μm2增加至2 059.91 μm2,增加幅度顯著高于其余兩組。圓度值可用來(lái)描述冰晶的形態(tài)大小,圓度值越接近1其形態(tài)越圓且規(guī)則。3組樣品的圓度值在波動(dòng)前3次均未發(fā)生顯著性變化(P>0.05),在波動(dòng)5次后開(kāi)始顯著性降低,波動(dòng)7次后3組樣品的圓度值從0.58分別下降至0.52、0.52和0.45。這說(shuō)明溫度波動(dòng)過(guò)程中前期冰晶的生長(zhǎng)主要以體積增大為主,但隨著波動(dòng)次數(shù)和范圍的增加,冰晶形態(tài)開(kāi)始不規(guī)則化,從而導(dǎo)致波動(dòng)后期對(duì)肌肉組織的損傷更為嚴(yán)重。

2.2 溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦持水性的影響

持水性一般指肌肉組織網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中保留水分的能力,是衡量水產(chǎn)品品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)[20]。水分是南美白對(duì)蝦中含量最豐富的成分,它直接影響蝦類(lèi)在溫度波動(dòng)過(guò)程中持水性、質(zhì)構(gòu)特性等品質(zhì)變化[21]。由表1可知,-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃組樣品水分含量整體上均隨波動(dòng)次數(shù)的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì),波動(dòng)7次后-18～-12 ℃顯著高于其余2組(P<0.05)。3組樣品經(jīng)溫度波動(dòng)7次后解凍損失由1.86%分別增加至3.29%、3.56%和3.86%,但-18～-12 ℃和-18～-6 ℃組沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。各組離心損失與解凍損失變化趨勢(shì)一致,-18～0 ℃組離心損失一直保持最高,表明溫度波動(dòng)幅度越大,持水性越差。

表1 不同溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦持水性的影響Table 1 Effect of different temperature fluctuations on water holding capacity of frozen L. vannamei

水產(chǎn)品肌肉組織中85%以上的水分存在于肌原纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)及其間隙中[22],由此推斷汁液流失主要與肌纖維的收縮程度及完整性有關(guān)。環(huán)境中的溫度波動(dòng)會(huì)使得冷凍品出現(xiàn)凍融現(xiàn)象,導(dǎo)致冰晶發(fā)生重結(jié)晶,改變冰晶的大小和形態(tài)[16],從而擠壓甚至刺破肌纖維細(xì)胞,引起解凍損失增加。3組樣品的離心損失及解凍損失均發(fā)生增加與圖2中冰晶面積增加、形態(tài)逐漸不規(guī)則化的趨勢(shì)相一致。當(dāng)溫度波動(dòng)次數(shù)過(guò)多時(shí),肌肉細(xì)胞受損嚴(yán)重,其細(xì)胞間結(jié)合力下降,一旦在外力的作用下如離心處理時(shí),肌肉中的水分會(huì)流出,造成較大的離心損失[23]。同時(shí),重結(jié)晶過(guò)程中冰晶的生長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致水分的遷移,不易流動(dòng)水逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樽杂伤鞒?使得水分含量降低。溫度波動(dòng)幅度越小,持水性越好,這可能是因?yàn)榄h(huán)境溫度波動(dòng)小,冰晶發(fā)生重結(jié)晶程度小,從而對(duì)肌肉組織形成的機(jī)械性損傷小,圖1中可直觀(guān)看出-18～0 ℃組發(fā)生冰晶重結(jié)晶現(xiàn)象較其余2組嚴(yán)重。

a-橫截面;b-縱截面

a-平均橫截面積;b-圓度

2.3 溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦質(zhì)構(gòu)特性的影響

硬度、內(nèi)聚性和咀嚼性等質(zhì)構(gòu)特性指標(biāo)對(duì)評(píng)價(jià)水產(chǎn)品品質(zhì)和消費(fèi)者可接受度具有十分重要的意義。質(zhì)構(gòu)特性主要與肌肉組織結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān),在溫度波動(dòng)過(guò)程中冰晶重結(jié)晶形成的較大冰晶會(huì)破壞肌纖維細(xì)胞的完整性;水分的遷移也可能會(huì)奪走與蛋白質(zhì)表面結(jié)合的水,使得其二硫鍵暴露導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,從而引起質(zhì)構(gòu)的劣變現(xiàn)象[24]。如圖3所示,3組樣品的硬度在溫度波動(dòng)過(guò)程中均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。與-18～-12 ℃和-18～-6 ℃組樣品相比,-18～0 ℃組南美白對(duì)蝦的硬度顯著降低(P<0.05)。波動(dòng)7次后,3組樣品的硬度分別減少15.54%、18.14%和19.54%。內(nèi)聚性和咀嚼性均隨波動(dòng)次數(shù)的增加而減小,與硬度變化趨勢(shì)相同,但3組之間無(wú)顯著性差異(P<0.05)。ZHANG等[7]研究中空白組凡納濱對(duì)蝦的硬度隨溫度波動(dòng)次數(shù)的增加而顯著降低,且顯著低于海藻糖組,其推斷可能是由于溫度波動(dòng)期間冰晶的形成和生長(zhǎng)導(dǎo)致的肌原纖維部分變性引起的聚集和水分損失。其中,-18～-12 ℃組樣品的內(nèi)聚性和咀嚼性在溫度波動(dòng)過(guò)程中均無(wú)顯著性差異(P<0.05),表明小幅度的溫度波動(dòng)對(duì)南美白對(duì)蝦內(nèi)聚性和咀嚼性并無(wú)影響。

剪切力是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品嫩度的一個(gè)重要指標(biāo),也可反映肌原纖維蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)狀態(tài)[25]。由圖3-b可知,在溫度波動(dòng)過(guò)程中3組樣品剪切力不斷下降,但-18～-12 ℃和-18～-6 ℃組整體無(wú)明顯差異(P>0.05);而-18～0 ℃組在波動(dòng)5次后開(kāi)始差異顯著,到第7次其剪切力達(dá)到3 501.53 g。這說(shuō)明溫度波動(dòng)幅度越大,剪切力越小,進(jìn)一步驗(yàn)證說(shuō)明大幅度的溫度波動(dòng)引起的重結(jié)晶會(huì)使得冰晶大而不規(guī)則,破壞肌肉纖維組織,導(dǎo)致肌原纖維蛋白變性,剪切力降低。

a-硬度、內(nèi)聚性;b-咀嚼性、剪切力

2.4 溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦蛋白質(zhì)性質(zhì)的影響

2.4.1 巰基含量

巰基是肌肉蛋白質(zhì)中最敏感的官能團(tuán)之一,70%以上的巰基存在于肌原纖維蛋白中,當(dāng)它受到自由基攻擊時(shí)極易氧化成二硫鍵,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性[26]。如圖4所示,各組樣品的巰基含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),這與上文提到的質(zhì)構(gòu)特性變化趨勢(shì)相一致。波動(dòng)7次時(shí),-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃組的巰基含量分別減少20.07%、30.44%和35.32%,-18～0 ℃組巰基含量下降程度是-18～-12 ℃和-18～-6 ℃的1.76和1.16倍,且顯著低于其余2組(P<0.05)。SRIKET等[27]研究發(fā)現(xiàn)黑虎蝦和南美白對(duì)蝦巰基含量隨凍融循環(huán)次數(shù)的增加而減少。這主要?dú)w因于溫度波動(dòng)會(huì)對(duì)肌肉細(xì)胞組織造成機(jī)械性損傷,破壞肌原纖維蛋白內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu),使得巰基暴露出來(lái)從而被氧化成二硫鍵,進(jìn)一步氧化則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的交聯(lián)。溫度波動(dòng)幅度越大,重結(jié)晶所形成的冰晶越大,肌肉組織損傷越嚴(yán)重,巰基含量越低。

圖4 不同溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦蛋白質(zhì) 巰基含量的影響Fig.4 Effects of different temperature fluctuations on sulfhydryl content of frozen L. vannamei

2.4.2 內(nèi)源熒光強(qiáng)度

色氨酸殘基主要位于蛋白質(zhì)內(nèi)核中,其極易受周邊微環(huán)境極性的影響,一旦色氨酸暴露于極性環(huán)境時(shí),蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光強(qiáng)度會(huì)降低,因此內(nèi)源熒光強(qiáng)度常被廣泛用于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定[28]。不同溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦的內(nèi)源熒光強(qiáng)度均會(huì)產(chǎn)生影響(圖5)。-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃組的冷凍南美白對(duì)蝦在溫度波動(dòng)過(guò)程中內(nèi)源熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)(P<0.05)。這表明蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)溫度波動(dòng)后逐漸展開(kāi),內(nèi)部的色氨酸殘基暴露在極性環(huán)境中,因此極易與蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)生的過(guò)氧化氫自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定的化合物,導(dǎo)致熒光猝滅。-18～0 ℃組的內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降程度最大,且顯著低于其余2組。與巰基相同,較大的溫度波動(dòng)幅度會(huì)導(dǎo)致更大且不規(guī)則的冰晶,從而對(duì)肌原纖維蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)造成的破壞較大,一定程度上也會(huì)影響持水性及質(zhì)構(gòu)特性的變化。DU等[26]研究結(jié)果也證實(shí)反復(fù)凍融形成的大冰晶會(huì)加劇蛋白質(zhì)的氧化程度,從而引起內(nèi)源熒光強(qiáng)度的降低。

2.4.3 SDS-PAGE圖譜

圖6為不同溫度波動(dòng)下冷凍南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜,其中主要條帶:肌球蛋白重鏈(約220 kDa),副肌球蛋白(約100 kDa),肌動(dòng)蛋白(約48 kDa)和原肌球蛋白(約34 kDa)。隨著溫度波動(dòng)次數(shù)的增加,4個(gè)條帶均逐漸變窄變淺,但肌動(dòng)蛋白條帶變化不明顯。-18～-12 ℃組變化最小,其肌球蛋白重鏈條帶在波動(dòng)7次后仍顯示出較寬且清晰的條帶;而-18～-6 ℃組和-18～0 ℃組的肌球蛋白重鏈條帶分別在波動(dòng)3次和5次后變窄變淺。這一結(jié)果與巰基含量和內(nèi)源熒光強(qiáng)度變化情況相同,推斷可能因?yàn)闇囟炔▌?dòng)過(guò)程中較大冰晶的形成破壞了蛋白質(zhì)內(nèi)部的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子不穩(wěn)定被氧化引起蛋白質(zhì)交聯(lián)、聚集,導(dǎo)致部分較大蛋白分子無(wú)法進(jìn)入凝膠。姜晴晴等[23]發(fā)現(xiàn)凍融循環(huán)后肌原纖維蛋白分子間二硫鍵、二酪氨酸的形成引起的蛋白聚集是導(dǎo)致重鏈肌球蛋白條帶變窄變淺的主要原因。這也進(jìn)一步解釋說(shuō)明了溫度波動(dòng)會(huì)使得肌原纖維蛋白發(fā)生交聯(lián)和聚集,溫度波動(dòng)次數(shù)越多、波動(dòng)幅度越大,則蛋白質(zhì)氧化變性程度越大。

圖6 不同溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦肌原纖維蛋白SDS-PAGE的影響Fig.6 Effects of different temperature fluctuations on SDS-PAGE pattern of myofibril protein of frozen L. vannamei

2.5 溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦組織結(jié)構(gòu)的影響

南美白對(duì)蝦的持水性及質(zhì)構(gòu)特性的變化與肌肉組織的微觀(guān)結(jié)構(gòu)密切相關(guān),通過(guò)圖7可對(duì)不同溫度波動(dòng)下其肌肉組織的形態(tài)變化進(jìn)行觀(guān)察,以判斷出其品質(zhì)的好壞。

從圖7中可以看出,未波動(dòng)組橫截面肌肉組織平整,存在少許冰晶留下的小孔洞,肌纖維束縱向排列緊密且有序。隨著波動(dòng)次數(shù)和范圍的增加,橫截面逐漸變得凹凸不平,孔洞增大且出現(xiàn)部分蜂窩狀小孔洞;肌纖維發(fā)生形變且間隙增加明顯,尤其在波動(dòng)7次后,-18～0 ℃組肌纖維間不相連,甚至出現(xiàn)斷裂,推斷這主要是冰晶生長(zhǎng)對(duì)肌纖維造成的擠壓,使得肌肉組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不可逆的變形。這與圖2中冰晶的大小和形態(tài)演變一致,深入驗(yàn)證了溫度波動(dòng)過(guò)程中冰晶重結(jié)晶的程度決定其品質(zhì)的好壞。QIAN等[29]研究發(fā)現(xiàn)肌肉組織間孔洞大小會(huì)影響肌肉組織的持水能力和汁液流失的程度,與上文解凍損失和離心損失變化趨勢(shì)相一致。LI等[30]研究證明了肌肉組織完整性的減小會(huì)導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)劣變,本文研究中硬度、內(nèi)聚性、咀嚼性等結(jié)果與肌肉組織完整性變化相關(guān)。周聃等[31]認(rèn)為肌纖維排列越致密,其硬度和咀嚼性越大,這與本文中硬度和咀嚼性研究結(jié)果相一致。

a-橫截面;b-縱截面

2.6 溫度波動(dòng)對(duì)冷凍南美白對(duì)蝦持水性及質(zhì)構(gòu)的影響機(jī)制

通過(guò)偏最小二乘法(partial least squares regression,PLS-R)來(lái)分析持水性、質(zhì)構(gòu)特性、冰晶形態(tài)及蛋白質(zhì)氧化間的相關(guān)關(guān)系,結(jié)果如圖8所示。

圖8 偏最小二乘回歸相關(guān)圖Fig.8 PLS-R correlation map

PC1和PC2方差貢獻(xiàn)率分別為89.20%和3.98%,總貢獻(xiàn)率達(dá)到了93.18%,說(shuō)明此模型能較好地評(píng)價(jià)各組別及指標(biāo)間的相關(guān)性,且各組別間距離越遠(yuǎn)則表示經(jīng)過(guò)不同溫度波動(dòng)處理后南美白對(duì)蝦間存在差異。-18～-12、-18～-6、-18～0 ℃組南美白對(duì)蝦在經(jīng)過(guò)溫度波動(dòng)后逐漸分布于右半部分,說(shuō)明其分別在波動(dòng)7、5和3次后各指標(biāo)發(fā)生顯著性變化(P<0.05),-18～0 ℃組各樣品點(diǎn)分布較遠(yuǎn),說(shuō)明該組受溫度波動(dòng)影響變化程度較大,驗(yàn)證了上文中-18～0 ℃組持水性及質(zhì)構(gòu)特性較其余2組差的結(jié)論。剪切力、咀嚼性、內(nèi)聚性、硬度和內(nèi)源熒光強(qiáng)度、巰基含量、圓度值之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性,這表明蛋白變性一定程度上會(huì)導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)特性劣變,這與吳興閣等[32]的研究結(jié)果相一致。巰基含量和內(nèi)源熒光強(qiáng)度值的降低會(huì)引起水分含量的下降,這意味著蛋白變性后內(nèi)部空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)汁液流失現(xiàn)象。解凍損失、離心損失和平均橫截面積間顯著相關(guān)(P<0.05),且平均橫截面積越大,解凍損失和離心損失越大,這說(shuō)明冰晶的生長(zhǎng)會(huì)引起持水性的下降。因此,綜合前面的分析結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明在溫度波動(dòng)過(guò)程中冰晶形態(tài)和蛋白變性程度均會(huì)影響冷凍南美白對(duì)蝦的持水性和質(zhì)構(gòu)特性。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示,隨著溫度波動(dòng)次數(shù)的增加,3組溫度波動(dòng)組南美白對(duì)蝦的水分含量、硬度、內(nèi)聚性、咀嚼性和剪切力逐漸減少,解凍損失、離心損失逐漸增加,表明在溫度波動(dòng)過(guò)程中持水性及質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生劣變且隨著波動(dòng)范圍的增加劣變程度加劇。巰基含量、最大內(nèi)源熒光強(qiáng)度不斷下降,且SDS-PAGE圖顯示肌原纖維蛋白部分發(fā)生氧化變性;通過(guò)微觀(guān)結(jié)構(gòu)更直觀(guān)地發(fā)現(xiàn)溫度波動(dòng)過(guò)程中各組的冰晶和肌肉組織中的孔洞逐漸增大且不規(guī)則化。此外,通過(guò)PLS-R進(jìn)一步闡明蛋白變性和冰晶的重結(jié)晶是引起持水性及質(zhì)構(gòu)特性下降的主要原因。因此,溫度波動(dòng)次數(shù)增加會(huì)加劇南美白對(duì)蝦持水性和質(zhì)構(gòu)特性的下降,應(yīng)盡量避免冷鏈流通過(guò)程中多次大幅度甚至極端溫度波動(dòng)情況的發(fā)生。