槲皮素通過下調緩激肽受體B1表達減輕糖尿病大鼠神經病理性疼痛

張書力 馮 丹 （武漢市第一醫(yī)院疼痛科，武漢 430022）

糖尿病神經病理性疼痛（diabetic neuropathic pain，DNP）是臨床上常見的糖尿病并發(fā)癥之一，以肢端誘發(fā)或自發(fā)性痛覺超敏為主，夜間疼痛加劇，造成患者失眠、煩躁、精神差，極大影響其工作效率與生活質量，是如今醫(yī)學研究的難點和熱點［1-2］。高糖引發(fā)的炎癥級聯反應在DNP的發(fā)生和病情進展過程中起到關鍵作用，積極抗炎、減輕軀體神經組織受損是很有前景的DNP治療策略［3-4］。槲皮素是普遍存在于植物中的黃酮類化合物，是一種天然抗氧化劑，具有降低血糖、消炎止痛、抗衰老等多種生物學活性，可通過降低血糖及抗氧化作用減輕糖尿病大鼠神經損傷，促使神經元存活［5］；還能夠以劑量依賴性方式降低紫杉醇誘導的炎癥因子表達，減輕大鼠神經病理學疼痛［6］。由此可知，槲皮素對DNP具有很大的治療潛力。激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)激活會促進病理性炎癥產生并進行放大，參與介導糖尿病視網膜病變、神經病理性疼痛等疾病發(fā)病過程。而緩激肽B1受體（bradykinin B1 receptor，BDKRB1）是調控激肽系統(tǒng)的重要受體蛋白，在糖尿病患者體內過度表達，對其進行抑制可限制炎癥發(fā)展，治療高糖引發(fā)的視網膜疾病，并改善神經病理性疼痛癥狀［7-8］。但槲皮素是否可以通過下調BDKRB1表達減輕糖尿病導致的神經病理性疼痛尚未有明確闡述。本文通過構建DNP大鼠模型對此問題進行研討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 78只SPF級SD雄性大鼠購自北京科興中維生物技術有限公司，許可證號：SYXK（京）2020-0054，體質量180～210 g。于武漢市第一醫(yī)院動物中心的屏障環(huán)境動物房中適應飼養(yǎng)1周后用于實驗，分籠飼養(yǎng)，5～6只/籠，采用明暗各12 h循環(huán)交替進行光照，溫度22.5～25.0 ℃，濕度55%～60%，通風設為9～12次/h。本研究經武漢市第一醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.1.2 主要試劑與儀器 槲皮素（純度：HPLC≥98%，貨號：SQ8030）、大鼠白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17） ELISA試劑盒（貨號：SEKR-0007）、總RNA提取試劑盒（貨號：R1200）、大鼠IL-18 ELISA試劑盒（貨號：SEKR-0054）、大鼠環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase，COX-2）ELISA試劑盒（貨號：SEKR-0075）、OCT冰凍切片包埋劑（貨號：4583）購自北京索萊寶科技有限公司；BDKRB1過表達質粒、空載質粒、BDKRB1與GAPDH引物、一步法反轉錄熒光定量試劑盒（貨號：B639277-0100）、RIPA裂解液（貨號：C500005-0050）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔源Anti-BDKRB1一抗（貨號：ABR-011）購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司；大鼠二步法免疫組織化學試劑盒（貨號：ZLI-9017）購自北京中杉金橋公司；兔源Anti-β-Tubulin一抗（貨號：ab21058）、兔源Anti-LFA-1一抗（貨號：ab186873）購自美國Abcam公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（貨號：P0012S）、羊抗兔二抗（貨號：A0277）購自上海碧云天生物技術有限公司。Von Frey纖毛機械刺激針購自意大利UGO公司；ZH-YLS-6B智能熱板儀購自上海珂淮儀器有限公司；ND-2000C超微量核酸分析儀、Multiskan FC多功能酶標儀購自美國賽默飛世爾科技公司；CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀、PowerPac Universal電泳儀購自美國Bio-Rad公司；CM1950冰凍切片機購自德國徠卡公司；CX23光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；eBlot L1快速濕轉儀購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司；JS-1070P化學發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海培清科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNP大鼠模型的制備及分組給藥 SD大鼠給予60 mg/kg的鏈脲佐菌素（溶于生理鹽水）腹腔注射，同時以Von Frey纖毛機械刺激針檢測大鼠后足機械性縮足閾值，作為基礎值，1周后取尾靜脈血測量空腹血糖，選用連續(xù)2次測量值均＞16.7 mmol/L的大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)，3周后再次檢測大鼠后足機械性縮足閾值，當其＜80%基礎值時，表明DNP模型建立成功［9］。本研究造模65只，共成功60只，將其以隨機數表法平均分為5組：模型組、槲皮素（100 mg/kg）組、BDKRB1過表達質粒組、空載質粒組、槲皮素（100 mg/kg）+BDKRB1過表達質粒組，另選12只大鼠，腹腔注射等劑量生理鹽水，作為對照組。

將槲皮素加入生理鹽水中溶解混勻，得到10 mg/ml的藥液，槲皮素+BDKRB1過表達質粒組大鼠以10 ml/kg劑量灌胃藥液，使槲皮素給藥劑量達到100 mg/kg，1次/d［10］。同時參照文獻［11］及說明書尾靜脈注射BDKRB1過表達質粒，給藥劑量為10 nmol，2次/周；槲皮素組大鼠每日灌胃100 mg/kg槲皮素1次，同時以與槲皮素+BDKRB1過表達質粒組相同的劑量尾靜脈注射生理鹽水，2次/周；BDKRB1過表達質粒組、空載質粒組大鼠參照文獻［9］及說明書尾靜脈注射BDKRB1過表達質粒與空載質粒，給藥劑量均為10 nmol，每周2次，同時每日以與槲皮素+BDKRB1過表達質粒組相同的劑量灌胃生理鹽水1次；對照組與模型組大鼠以與槲皮素+BDKRB1過表達質粒組相同的劑量尾靜脈注射生理鹽水，每周2次，同時每日以與槲皮素+BDKRB1過表達質粒組相同的劑量灌胃生理鹽水1次，各組大鼠均給藥干預3周。

1.2.2 檢測大鼠痛覺超敏癥狀 最后一次給藥后24 h，取出各組大鼠進行安撫，待其安靜后，以Von Frey纖毛機械刺激針刺大鼠右側后足至爪輕度彎曲，探針克數由小至大分別針刺6 s，記錄大鼠產生縮足或舔爪疼痛反應時的探針克數，重復測量3次，取平均值，即得到機械縮足閾值。

機械性刺激痛覺檢測結束后，將大鼠安撫至安靜，智能熱板儀的溫度設為43～45 ℃，待溫度達標后，分別將大鼠置于熱板上，記錄大鼠產生舔爪或撤回后足疼痛反應的所用時間，重復測量3次，取平均值，即得到熱縮足潛伏期，為避免大鼠受傷，熱縮足潛伏期最長為60 s。

熱刺激痛覺檢測結束后，將大鼠安撫至安靜，于其后足皮膚上滴加0.1 ml丙酮，大鼠出現抬足行為時開始計時，至其放下抬起的后足，計時結束，共重復3次，得到的時間取平均值，即為冷刺激抬足時間。

1.2.3 采集標本并檢測大鼠脊髓背根神經節(jié)淋巴細胞浸潤情況 痛覺超敏檢測結束后，大鼠吸入異氟醚麻醉，采集頸動脈血4 ℃離心，吸出上清、分組標記后-80 ℃保存?zhèn)溆谩ｎi椎脫臼處死大鼠，解剖取出脊髓背根神經節(jié)，以手術剪取下0.4 g組織塊保存在液氮中備用；以同樣方法再次取脊髓背根神經節(jié)組織0.5 g，剪碎，冰水浴勻漿，4 ℃離心，吸出上清，BCA測量蛋白總濃度，分組標記后于-80 ℃保存?zhèn)溆茫皇Ｓ嗉顾璞掣窠浌?jié)組織經生理鹽水漂洗、30%蔗糖脫水沉底、OCT包埋、液氮冰凍成塊、切片后，選出沒有破損且厚薄均勻的切片復溫5 min后浸入冰丙酮中固定，滴加LFA-1一抗孵育后洗滌，根據試劑盒說明書進行免疫組織化學染色后拍照，鏡下觀察，Image J軟件分析計算背根神經節(jié)LFA-1陽性細胞比例（%）=LFA-1陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 測定大鼠血清炎癥介質IL-17、COX-2、IL-18水平 取1.2.3中凍存的血清，冰水浴解凍，參照試劑盒說明書測量其中IL-17、COX-2、IL-18水平。

1.2.5 檢測大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1 mRNA表達水平 取1.2.3中凍存的脊髓背根神經節(jié)組織，置研缽中加入總RNA提取試劑研碎，參照試劑盒說明書提取組織中RNA后，超微量核酸分析儀測量其濃度，熒光定量PCR進行擴增，反應條件按照說明書設定，得到各組基因Ct值，以2-ΔΔCt法分析計算，GAPDH做內參對照，最終獲得BDKRB1 mRNA的相對表達水平，引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequences

1.2.6 檢測脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白表達自液氮中取出1.2.3中的脊髓背根神經節(jié)組織蛋白樣品液，根據分子量測定結果各組均取總蛋白20 μg，煮沸變性（100 ℃，6 min）、上樣電泳（恒壓120 V，60 min）、濕轉（穩(wěn)流40 mA，70 min），以脫脂奶粉溶液封閉分離后蛋白的非特異位點，然后將目的蛋白BDKRB1、β-Tubulin自硝酸纖維膜上剪下，孵育一抗（4 ℃，10 h）、TBST洗滌（3次，5 min/次）、孵育二抗（37.5 ℃，90 min）、TBST洗滌（3次，5 min/次）、化學發(fā)光法顯色、拍照，使用軟件Image J定量圖片中蛋白條帶灰度值，進行統(tǒng)計分析后獲得其相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗所得數據采用±s表示，作為計量資料輸入SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩組間差異比較采用t檢驗；多組間差異比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 槲皮素對大鼠疼痛的影響 與對照組比較，模型組大鼠機械性縮足閾值降低，熱敏潛伏期顯著縮短（P＜0.05），冷刺激抬足時間顯著延長（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達質粒組分別比較，槲皮素組大鼠機械性縮足閾值增大，熱敏潛伏期均延長（P＜0.05），冷刺激抬足時間縮短（P＜0.05）；BDKRB1過表達質粒組大鼠機械性縮足閾值降低，熱敏潛伏期均縮短（P＜0.05），冷刺激抬足時間延長（P＜0.05）；空載質粒組大鼠機械性縮足閾值、冷刺激抬足時間、熱敏潛伏期差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠機械性縮足閾值、冷刺激抬足時間、熱敏潛伏期（±s，n=12）Tab.2 Mechanical paw withdrawal threshold， cold stimulation foot lift time and heat sensitivity latency of rats in each group （±s，n=12）

表2 各組大鼠機械性縮足閾值、冷刺激抬足時間、熱敏潛伏期（±s，n=12）Tab.2 Mechanical paw withdrawal threshold， cold stimulation foot lift time and heat sensitivity latency of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid group， 3）P＜0.05.

Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid Quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid Mechanical paw withdrawal threshold/g 22.46±2.61 8.57±1.271）20.01±3.152）3）Cold stimulation paw lift time/s 2.43±0.36 13.05±1.431）3.01±0.392）3）Heat sensitivity latency/s 59.32±0.67 11.03±1.121）56.58±6.402）3）1.23±0.302）3）20.67±3.602）3）1.81±0.422）3）8.72±1.46 12.87±1.15 11.72±1.45 7.98±1.52 12.34±1.76 12.24±1.73

2.2 槲皮素對大鼠脊髓背根神經節(jié)淋巴細胞浸潤的影響 與對照組比較，模型組大鼠脊髓背根神經節(jié)LFA-1陽性細胞比例顯著升高（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達質粒組分別比較，槲皮素組大鼠脊髓背根神經節(jié)LFA-1陽性細胞比例均降低（P＜0.05）；BDKRB1過表達質粒組大鼠脊髓背根神經節(jié)LFA-1陽性細胞比例均升高（P＜0.05）；空載質粒組大鼠脊髓背根神經節(jié)LFA-1陽性細胞比例差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

圖1 免疫組織化學染色檢測各組大鼠脊髓背根神經節(jié)淋巴細胞浸潤（×200）Fig.1 Lymphocyte infiltration in spinal dorsal root ganglion of rats in each group was detected by immunohistochemical staining （×200）

表3 各組大鼠脊髓背根神經節(jié)LFA-1陽性細胞比例（±s，n=12）Tab.3 Proportion of LFA-1 positive cells in spinal dorsal root ganglion of rats in each group （±s，n=12）

表3 各組大鼠脊髓背根神經節(jié)LFA-1陽性細胞比例（±s，n=12）Tab.3 Proportion of LFA-1 positive cells in spinal dorsal root ganglion of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid group， 3）P＜0.05.

Proportion of LFA-1 positive cells/%1.84±0.51 24.53±3.921）2.72±0.462）3）39.86±5.132）3）25.15±4.61 22.47±4.18 Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid Quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid

2.3 槲皮素對大鼠血清炎癥介質IL-17、COX-2、IL-18水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清IL-17、COX-2、IL-18水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達質粒組分別比較，槲皮素組大鼠血清IL-17、COX-2、IL-18水平均降低（P＜0.05）；BDKRB1過表達質粒組大鼠血清IL-17、COX-2、IL-18水平均升高（P＜0.05）；空載質粒組大鼠血清IL-17、COX-2、IL-18水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 各組大鼠血清炎癥介質IL-17、COX-2、IL-18水平（±s，n=12）Tab.4 Levels of serum inflammatory mediators IL-17，COX-2 and IL-18 of rats in each group （±s，n=12）

表4 各組大鼠血清炎癥介質IL-17、COX-2、IL-18水平（±s，n=12）Tab.4 Levels of serum inflammatory mediators IL-17，COX-2 and IL-18 of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid group， 3）P＜0.05.

Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid IL-17/（pg·ml-1）9.13±1.25 43.74±5.611）10.84±1.372）3）COX-2/（ng·ml-1）0.92±0.13 6.03±1.291）1.18±0.362）3）IL-18/（pg·ml-1）48.63±5.72 115.42±13.561）51.72±6.342）3）71.23±8.122）3）11.24±2.182）3）194.26±25.812）3）44.09±6.40 6.15±1.53 116.35±15.13 40.98±6.04 5.69±1.05 112.06±15.40

2.4 槲皮素對大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1 mRNA表達水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達質粒組分別比較，槲皮素組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1 mRNA表達水平降低（P＜0.05）；BDKRB1過表達質粒組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1 mRNA表達水平均升高（P＜0.05）；空載質粒組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

表5 各組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1 mRNA表達水平（±s，n=12）Tab.5 Expression level of BDKRB1 mRNA in spinal dorsal root ganglion of rats in each group （±s，n=12）

表5 各組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1 mRNA表達水平（±s，n=12）Tab.5 Expression level of BDKRB1 mRNA in spinal dorsal root ganglion of rats in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group，2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid， 3）P＜0.05.

BDKRB1/GAPDH 0.97±0.12 1.78±0.361）1.08±0.152）3）2.46±0.412）3）1.83±0.32 1.49±0.24 Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid Quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid

2.5 槲皮素對大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白表達水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組、槲皮素+BDKRB1過表達質粒組分別比較，槲皮素組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；BDKRB1過表達質粒組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白表達水平均升高（P＜0.05）；空載質粒組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖2、表6。

圖2 免疫印跡檢測各組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白表達Fig.2 Expression of BDKRB1 protein in spinal dorsal root ganglion of rats in each group was detected by Western blot

表6 各組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白相對表達水平（±s，n=12）Tab.6 Relative expression level of BDKRB1 protein in spinal dorsal root ganglion of rats in each group（±s，n=12）

表6 各組大鼠脊髓背根神經節(jié)BDKRB1蛋白相對表達水平（±s，n=12）Tab.6 Relative expression level of BDKRB1 protein in spinal dorsal root ganglion of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid group， 3）P＜0.05.

BDKRB1/β-Tubulin 0.63±0.11 1.29±0.281）0.70±0.132）3）1.82±0.322）3）1.31±0.27 1.15±0.19 Groups Control Model Quercetin BDKRB1 overexpression plasmid Empty plasmid Quercetin+BDKRB1 overexpression plasmid

3 討論

我國糖尿病患者眾多，臨床資料顯示其中大多數會發(fā)生DNP，是造成患者肢端疼痛和步態(tài)障礙，甚至殘疾的重要因素，因此積極探索有效的治療藥物極具臨床價值［12］。本研究以腹腔注射60 mg/kg鏈脲佐菌素方法建立DNP大鼠模型，結果顯示，大鼠注射鏈脲佐菌素后，其血糖顯著升高，誘導炎癥細胞因子IL-17、COX-2及IL-18大量產生釋放，可引發(fā)神經炎癥反應，進而造成外周神經損傷［13］。LFA-1作為淋巴細胞功能相關抗原，是反映組織炎癥中淋巴細胞浸潤情況的重要標志物［14］。本實驗中造模大鼠脊髓背根神經節(jié)中LFA-1陽性細胞比例明顯升高，提示高糖誘導的炎癥因子過量表達導致了炎癥細胞浸潤脊髓神經組織，引發(fā)了嚴重的外周神經炎癥損傷，造成大鼠機械性刺激與冷、熱刺激痛覺超敏，表明DNP模型建立成功。

目前DNP的臨床治療方法不多，主要以維生素營養(yǎng)神經、抗炎止痛及降低血糖等為主，但患者預后并不理想，如今中醫(yī)藥中含有的天然化合物在DNP的治療中越來越受到重視［15-16］。槲皮素作為一種天然抗炎抗氧化劑，常用于改善糖尿病、關節(jié)炎、慢性前列腺炎等多種炎癥性疾病的治療，可明顯抑制炎癥介質的表達和分泌，減輕慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛綜合征大鼠痛覺超敏，并顯著改善紫杉醇所致的神經病理學疼痛［6，17-18］。因此，槲皮素可作為防治DNP的潛在藥物。本實驗以槲皮素處理DNP大鼠，可顯著降低炎癥因子IL-17、COX-2及IL-18水平及LFA-1陽性細胞比例，阻礙炎癥細胞浸潤脊髓背根神經節(jié)，減弱大鼠機械性刺激與冷、熱刺激痛覺超敏，表明槲皮素可抑制炎癥因子表達，阻礙炎癥細胞浸潤及脊髓神經組織炎性級聯反應，減輕DNP大鼠疼痛，與既往研究結果相似，具有很強的消炎鎮(zhèn)痛功效，在DNP的治療中具有很大的發(fā)展前景。

BDKRB1是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的重要調控蛋白，在糖尿病、谷氨酸誘導的神經毒性、神經疼痛等病理過程中均過表達，下調BDKRB1表達或拮抗其活性可抑制高糖引發(fā)的炎癥，改善谷氨酸導致的神經元損傷，并通過阻礙炎癥進展減輕創(chuàng)傷引起的慢性疼痛，提示BDKRB1是DNP的一個潛在治療靶點［7，19-20］。本研究探討了下調BDKRB1表達是否為槲皮素改善DNP疼痛癥狀的分子機制，結果顯示，以BDKRB1過表達質粒上調DNP大鼠BDKRB1表達，可促進炎癥細胞因子分泌，加重炎癥細胞浸潤，最終加劇大鼠疼痛；當其與槲皮素合用時，可拮抗槲皮素對炎癥因子表達與炎癥細胞浸潤的抑制作用，并減弱對大鼠痛覺超敏的改善作用，最終逆轉槲皮素對DNP大鼠的鎮(zhèn)痛作用。

綜上，本研究證實槲皮素可通過下調BDKRB1表達減少炎癥因子的生成分泌，抑制炎性淋巴細胞浸潤，抵抗脊髓背根神經炎癥，減弱DNP大鼠疼痛超敏癥狀，最終發(fā)揮顯著的消炎止痛功效。本研究為DNP的臨床治療提供了新的參考，對槲皮素的推廣應用做出了一定貢獻。