水飛薊素抑制鼻咽癌模型大鼠鼻黏膜組織炎癥及損傷

徐輝聰 鐘零珠 梁衛(wèi)勤 王少軍 （海口市第三人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，海口 571100）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一種起源于鼻咽部的頭頸部惡性腫瘤，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為鼻塞、涕中帶血、耳悶、聽(tīng)力下降以及頭痛等，因其臨床癥狀不典型，發(fā)現(xiàn)時(shí)常已進(jìn)展至中晚期［1］。目前，手術(shù)切除及放化療可有效延長(zhǎng)NPC患者的生存時(shí)間，但易造成放射性鼻竇炎等不良反應(yīng)，從而影響NPC患者預(yù)后［2］。既往研究表明，NPC與EB病毒感染、遺傳、環(huán)境等因素均密切相關(guān)，NPC發(fā)生過(guò)程中通常伴隨炎癥反應(yīng)［3］。IL-6是存在于黏膜固有層的一種重要促炎因子，在炎癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是IL-6信號(hào)通路的關(guān)鍵下游調(diào)節(jié)因子，可持續(xù)激活炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)細(xì)胞癌變［5-6］。

中藥因其安全、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，在臨床防治NPC上可能具有良好的前景，既往研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)中藥對(duì)NPC的治療效果顯著［7］。水飛薊素（Silymarin，SIL）是從菊科植物水飛薊種子或果實(shí)中提取出的一種黃酮木質(zhì)素類化合物，具有消炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫以及抗腫瘤等作用［8］。研究顯示，SIL與臨床上一些常規(guī)化療藥物具有一定的協(xié)同作用，在臨床上能夠有效發(fā)揮抗腫瘤作用［9］。本研究通過(guò)建立NPC大鼠模型，觀察SIL對(duì)NPC大鼠鼻黏膜損傷的保護(hù)作用，并初步探究SIL的可能作用機(jī)制，旨在為SIL用于臨床上NPC防治提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠共60只，6～7周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0011。實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)條件溫度22～25 ℃，濕度45%～55%，晝夜時(shí)長(zhǎng)12 h/12 h，期間不限制飲水飲食。研究經(jīng)海口市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審批號(hào)：2022013）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 二亞硝基哌嗪（dinitrosopiperazine，DNP，SCSI-316048）購(gòu)自上海賽可瑞生物科技有限公司；佛波醇酯（SL9964626）購(gòu)自上海一基實(shí)業(yè)有限公司；SIL（B3746）購(gòu)自北京康納瑞生物科技有限公司；IL-6/STAT3通路抑制劑（AG-490，HY-107459）購(gòu)自美國(guó)MCE公司；HE染色試劑盒（G1120）、DAB顯色試劑盒（DA1016）、ECL發(fā)光試劑盒（PE0010）均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（YT2205）購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；IL-6、IL-10、IL-1β ELISA試劑盒（H007-1-1、H009-1、H002）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；UBAP1抗體（ab89124）、IL-6抗體（ab259341）、STAT3（ab68153）、β-actin（ab8227）、山羊抗兔（HRP，ab6721）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 OLYMPUS IX53顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；GelView 5000Plus智能凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自廣州博鷺騰生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與分組給藥 參照文獻(xiàn)［10］建立NPC大鼠模型：取50只SD大鼠，腋部皮下注射誘癌劑DNP 15 mg/kg，同時(shí)注射促癌劑佛波醇酯100 mg/kg，每3 d注射1次，7 d測(cè)量1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整用藥量，連續(xù)注射90 d。大鼠出現(xiàn)涕流滿面、抓鼻不止、頻繁打噴嚏等行為后進(jìn)行組織病理檢測(cè)，以鼻咽組織出現(xiàn)癌變細(xì)胞表明NPC大鼠模型建立成功。建模成功后將大鼠隨機(jī)分為模型組、SIL-L組（50 mg/kg）、SIL-M組（100 mg/kg）、SIL-H組（200 mg/kg）、SIL+AG-490組（SIL200 mg/kg加AG-490 2 mg/kg混合液）。另選10只大鼠腋部皮下注射生理鹽水，作為空白對(duì)照組［11-12］。造模成功后各組給予相應(yīng)藥物治療。模型組與空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水。給藥方式均為腹腔注射，1次/d，連續(xù)給藥90 d。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平 末次給藥后12 h，用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，行氣管切開(kāi)術(shù)。微量蠕動(dòng)泵灌洗鼻腔，并收集鼻腔灌洗液，2 500 r/min離心15 min，取上清，ELISA檢測(cè)IL-6、IL-10、IL-1β。操作嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 HE染色觀察鼻黏膜組織病理變化 每組取5只大鼠取鼻黏膜組織，4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色后生物光學(xué)顯微鏡下觀察鼻黏膜組織病理學(xué)變化。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)鼻黏膜組織細(xì)胞凋亡 取1.2.3中制備好的組織切片，常規(guī)脫蠟處理、二甲苯透明、梯度乙醇脫水后加蛋白酶K室溫孵育15 min，PBS漂洗，采用過(guò)氧化氫封閉10 min，再次漂洗，加入TUNEL工作液，進(jìn)行染色，生物光學(xué)顯微鏡下觀察鼻咽組織細(xì)胞凋亡情況并拍照。采用Image J 7.0軟件進(jìn)行圖像分析。細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)（棕色）/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)鼻黏膜組織中UBAP1的表達(dá) 取1.2.3制備好的組織切片，脫蠟至水，枸櫞酸修復(fù)抗原，5%BSA封閉2 h，加入U(xiǎn)BAP1一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗，37 ℃孵育2 h，DAB顯色，光鏡下觀察切片并拍照，采用Image J 7.0軟件分析積分光密度值，作為目的蛋白陽(yáng)性表達(dá)量。

1.2.6 Western blot檢測(cè)鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá) 取大鼠鼻黏膜組織，使用RIPA裂解液分離總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉2 h，加入IL-6、STAT3及內(nèi)參β-actin一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗室溫孵育2 h，電化學(xué)發(fā)光試劑（efficient chemiluminescence，ECL）顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，目的蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIL對(duì)NPC大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平明顯升高，IL-10水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SIL-L、SIL-M、SIL-H組鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平依次降低，IL-10水平依次升高（P＜0.05），顯示出藥物具有劑量效應(yīng)關(guān)系；與SIL-H組比較，SIL+AG-490組鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平顯著降低，IL-10水平顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的比較（±s，n=10，pg/ml）Tab.1 Comparison of IL-6， IL-10 and IL-1β levels in nasal lavage fluid of rats in each group （±s，n=10，pg/ml）

表1 各組大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的比較（±s，n=10，pg/ml）Tab.1 Comparison of IL-6， IL-10 and IL-1β levels in nasal lavage fluid of rats in each group （±s，n=10，pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

IL-1β 24.25±2.28 87.18±8.371）73.84±7.182）65.86±5.952）3）53.21±5.342）3）4）34.82±3.285）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490 IL-6 35.47±3.56 121.49±10.261）94.16±8.662）78.58±6.852）3）61.28±5.582）3）4）49.54±4.225）IL-10 47.51±3.13 13.08±1.471）16.82±1.842）22.31±2.422）3）27.18±1.972）3）4）34.76±3.685）

2.2 SIL對(duì)NPC大鼠鼻黏膜組織病理變化的影響HE染色結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊、形狀規(guī)則，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞癌變現(xiàn)象；模型組大鼠黏膜組織結(jié)構(gòu)紊亂，大量細(xì)胞癌變，細(xì)胞層次增多，排列不規(guī)則；SIL各劑量組隨著劑量的增加，細(xì)胞形態(tài)逐漸清晰，癌變細(xì)胞逐漸減少；SIL+AG-490組大鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)與空白對(duì)照組接近，細(xì)胞層次較清晰，癌變細(xì)胞數(shù)量較少。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理變化情況（HE，×200）Fig.1 Histopathological changes of nasal mucosa of rats in each group （HE，×200）

2.3 SIL對(duì)NPC大鼠鼻黏膜組織細(xì)胞凋亡情況的影響 空白對(duì)照組大鼠鼻黏膜組織中的細(xì)胞凋亡率為（3.79±0.43）%；與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織細(xì)胞凋亡率（52.91±4.36）%顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SIL各劑量組隨著劑量升高，鼻黏膜組織細(xì)胞凋亡率逐漸降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率分別為（41.76±3.24）%、（32.01±2.33）%、（24.38±2.07）%；與SIL-H組比較，SIL+AG-490組大鼠鼻黏膜組織細(xì)胞凋亡率（16.43±1.71）%顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL，×200）Fig.2 Apoptosis of nasal mucosal tissue cells of rats in each group （TUNEL，×200）

2.4 SIL對(duì)NPC大鼠鼻黏膜組織中UBAP1表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中UBAP1表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SIL各劑量組大鼠鼻黏膜組織中UBAP1表達(dá)顯著升高（P＜0.05），且具有劑量效應(yīng)（P＜0.05）；與SIL-H組比較，SIL+AG-460組大鼠鼻黏膜組織中UBAP1表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖3、表2。

表2 各組大鼠鼻黏膜組織UBAP1表達(dá)的比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of UBAP1 expressions in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

表2 各組大鼠鼻黏膜組織UBAP1表達(dá)的比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of UBAP1 expressions in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

Nite：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

UBAP1 7.41±0.66 1.96±0.211）3.01±0.292）3.98±0.42 2）3）4.96±0.492）3）4）5.83±0.545）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490

2.5 SIL對(duì)NPC大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，SIL各劑量組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），且各劑量組間具有劑量效應(yīng)（P＜0.05）；與SIL-H組比較，SIL+AG-460組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖4、表3。

圖4 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)的比較Fig.4 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group

表3 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)的比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

表3 各組大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)的比較（±s，n=5）Tab.3 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

STAT3 0.22±0.02 0.85±0.091）0.72±0.082）0.59±0.052）3）0.47±0.042）3）4）0.36±0.035）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490 IL-6 0.16±0.02 0.67±0.041）0.56±0.042）0.48±0.032）3）0.37±0.022）3）4）0.24±0.025）

3 討論

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球有約80%的NPC患者在中國(guó)，并且，近年來(lái)由于人們生活方式以及生活環(huán)境的改變，其發(fā)病率及年輕化程度均逐年升高［13-14］。NPC起病隱匿、病情發(fā)展迅速，大多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)展至中晚期，且NPC發(fā)病與環(huán)境因素、遺傳因素以及病毒感染等有密切關(guān)系［15-16］。早期放化療能夠有效延長(zhǎng)患者生命，但長(zhǎng)期放化療易產(chǎn)生相關(guān)不良反應(yīng)及放化療抵抗，因此，尋找安全有效的治療藥物對(duì)于臨床上NPC的防治工作具有重要意義。

IL-6、IL-1β是機(jī)體的關(guān)鍵促炎因子，研究表明其參與炎癥反應(yīng)發(fā)生、機(jī)體免疫應(yīng)激以及腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲［17］。UBAP1在NPC的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中均呈異常表達(dá)，其在NPC癌細(xì)胞惡性行為學(xué)的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［18］。本研究結(jié)果顯示，NPC大鼠模型鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平升高，抑炎因子IL-10水平降低，鼻黏膜組織受損嚴(yán)重，鼻腔黏膜細(xì)胞癌變與凋亡增加，提示大鼠鼻腔黏膜炎癥反應(yīng)激活，可誘導(dǎo)鼻黏膜細(xì)胞癌變與凋亡，同時(shí)鼻黏膜組織中UBAP1表達(dá)降低，促進(jìn)NPC發(fā)展。

劉易婷等［19］曾通過(guò)建立DNP與硫酸鎳聯(lián)合誘導(dǎo)NPC大鼠模型，發(fā)現(xiàn)益氣解毒顆粒能夠有效降低NPC大鼠癌變發(fā)生率。SIL是菊科植物水飛薊的主要生物活性成分，其具有清除ROS、抗炎、抗氧化能力［20］。研究報(bào)道SIL抗腫瘤作用主要是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、抵抗血管生成等作用抑制腫瘤生長(zhǎng)［21］。本研究結(jié)果顯示，低、中、高劑量的SIL均能不同程度地下調(diào)IL-6、IL-1β表達(dá)，上調(diào)IL-10表達(dá)，減輕鼻黏膜組織炎癥反應(yīng)及組織損傷，減少細(xì)胞癌變以及抑制鼻黏膜上皮細(xì)胞凋亡。

IL-6是參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，其通過(guò)與下游受體sIL-6R結(jié)合，誘導(dǎo)下游效應(yīng)因子STAT3活化，從而進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，加重機(jī)體損傷［22］。研究表明，IL-6/STAT3信號(hào)通路被激活后可引起過(guò)度炎癥反應(yīng)， STAT3過(guò)表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的清除進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［23］。因此，抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路，能夠有效減少NPC癌細(xì)胞增殖與侵襲［24］。本研究結(jié)果表明，NPC模型大鼠鼻黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)明顯升高，提示NPC模型大鼠機(jī)體IL-6/STAT3信號(hào)通路被激活，炎癥反應(yīng)加劇，從而促進(jìn)鼻黏膜組織癌變，SIL-L、SIL-M、SIL-H組大鼠鼻咽部黏膜組織中IL-6、STAT3蛋白表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，提示SIL可抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路的激活；且SIL配伍通路抑制劑AG-490干預(yù)后，IL-6、STAT3蛋白表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，說(shuō)明SIL可能通過(guò)抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮抗炎、抗凋亡作用，緩解NPC大鼠鼻黏膜組織炎癥損傷。

綜上所述，SIL通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生和細(xì)胞凋亡減輕NPC大鼠鼻黏膜組織損傷，其作用機(jī)制可能與抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。