低氧條件下食管癌來源外泌體調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型分化與自噬的機(jī)制研究

尹星 邢艷麗 常歡 周陽 付民 尹先哲 （南陽市第二人民醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，南陽 473000）

食管癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和致死率逐年升高，我國食管癌發(fā)病率已躍居所有腫瘤第三位，病死率位居第四［1-2］。根據(jù)病理特征，食管癌可分為食管腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌，食管鱗狀細(xì)胞癌主要發(fā)病于中國等亞洲國家，目前食管癌治療主要包括外科手術(shù)、放療和化療等傳統(tǒng)治療方式，雖然治療效果逐漸提高，但總體預(yù)后較差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重［3-4］。因此，探究食管癌的發(fā)病機(jī)制對其治療和藥物設(shè)計至關(guān)重要。缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的主要特征，缺氧環(huán)境可誘導(dǎo)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移［5］。腫瘤外泌體是一類由腫瘤分泌的納米級囊泡，可調(diào)控腫瘤生長、血管新生、免疫逃逸等，而缺氧條件下腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體亦可通過多種途徑影響腫瘤發(fā)生發(fā)展［6］，如缺氧誘導(dǎo)的腫瘤外泌體調(diào)控PTEN/PI3Kγ誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌生長和轉(zhuǎn)移，而缺氧誘導(dǎo)的卵巢癌外泌體可通過調(diào)控STAT3/Rab促進(jìn)卵巢癌化療耐藥［7-8］。已有研究表明，缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤外泌體可通過增強(qiáng)自噬促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞形成［9］。本研究探討了低氧條件下食管癌細(xì)胞分泌的外泌體對巨噬細(xì)胞分化和自噬的影響，旨在為臨床研究提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料 食管癌細(xì)胞Eca-109、食管上皮細(xì)胞HEEC、人外周血單核細(xì)胞THP-1均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA，美國Sigma公司）；PKH-26染料（美國SIGMA-ALDRICH公司）；IL-1β、IL-12、TNF-α、Arg1、IL-10、TGF-β ELISA檢測試劑盒（天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司）；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司）；Fast Quant RT Kit和Real Universal Color PreMix（美國TIANGEN公司）；CD9、CD63、CD81、CD14、CD206抗體（Cell Signaling Technology公司）；p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt、mTOR、GAPDH、山羊抗兔IgG、CD14、CD206抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 食管癌細(xì)胞Eca-109和食管上皮細(xì)胞HEEC均培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，人外周血單核細(xì)胞THP-1培養(yǎng)于含12%FBS+1%青霉素-鏈霉素+50 μmol/L β-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)于含5%CO2、37 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱，低氧誘導(dǎo)的Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)于含0.2%O2、5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時傳代，隔天更換培養(yǎng)基。

1.2.2 外泌體提取、鑒定與攝取 將各組Eca-109和HEEC細(xì)胞培養(yǎng)基更換為含10%無外泌體胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，超速離心法提取細(xì)胞培養(yǎng)液中的外泌體：細(xì)胞培養(yǎng)液2 000 g離心10 min，收集上清，1 000 g離心30 min去除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，100 000 g超高速離心70 min，所得沉淀用無菌PBS溶液重懸后再次100 000 g超高速離心70 min，所得沉淀即為外泌體，400 μl PBS重懸外泌體，-80 ℃保存。HEEC細(xì)胞、Eca-109細(xì)胞、低氧條件下Eca-109細(xì)胞分泌的外泌體分別記為HEEC-exo、Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo。透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，Western blot檢測外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、CD81表達(dá)。巨噬細(xì)胞攝取外泌體檢測：用PKH-26染料試劑盒將外泌體標(biāo)記為紅色熒光，將1×104個M0型巨噬細(xì)胞接種至激光共聚焦培養(yǎng)皿，DAPI染料標(biāo)記M0型巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核，將帶有紅色熒光的外泌體10 μg/ml與M0型巨噬細(xì)胞共孵育2 h，取出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，無水甲醛固定30 min，清洗后于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化與共孵育 50 ng/ml PMA誘導(dǎo)1×106個THP-1細(xì)胞48 h分化為M0型巨噬細(xì)胞。THP-1細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，M0型巨噬細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞貼壁即為誘導(dǎo)成功。共孵育：將誘導(dǎo)分化的M0型巨噬細(xì)胞分別加入Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo、HEEC-exo及等體積PBS，各組共孵育體系中外泌體濃度均為10 μg/ml，共孵育48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù) 收集與各組外泌體共孵育的M0型巨噬細(xì)胞，每組5×105個，每組細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌1次，用100 μl含10%FBS的無菌PBS溶液重懸，各組細(xì)胞加入1 μg FITC-CD14抗體和1 μg PECD206抗體，設(shè)置單獨(dú)加入FITC-CD14抗體和PECD206抗體的組別調(diào)補(bǔ)償，空白管調(diào)電壓，將細(xì)胞與抗體4 ℃避光孵育30 min，收集細(xì)胞用300 μl PBS重懸，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞CD14和CD206表達(dá)。

1.2.5 ELISA檢測細(xì)胞因子 采用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液炎癥因子IL-1β、IL-12、TNF-α、Arg1、IL-10和TGF-β水平：96孔板內(nèi)包被一抗，加入40 μl待測樣品和10 μl生物素標(biāo)記抗體，室溫靜置30 min后加入100 μl辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體，37 ℃孵育75 min，清洗3次，加入顯色液顯色，450 nm處測吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各細(xì)胞因子含量。

1.2.6 qRT-PCR 使用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞RNA，核酸定量儀定量，F(xiàn)ast Quant RT Kit試劑盒合成mRNA的cDNA，Real Universal Color PreMix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 各組基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes in each group

1.2.7 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 Transwell小室中每孔接種50 μl Matrigel膠檢測細(xì)胞侵襲，小室中接種無血清RPMI1640重懸的1×104個Eca-109細(xì)胞，置于24孔板，接種用含10%FBS RPMI1640重懸的1×104個M0型巨噬細(xì)胞，分別加入Nom-exo、Hypo-exo、HEEC-exo及等體積PBS，各組外泌體濃度為10 μg/ml，共培養(yǎng)72 h，清洗各組小室底部，無水甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，清洗晾干后顯微鏡下觀察拍照，比較各組細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)。

1.2.8 Western blot 收集各組與外泌體共孵育的巨噬細(xì)胞，RIPA蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞或外泌體總蛋白，BCA定量，各組蛋白取10 μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后5%BSA封閉，清洗，與1∶1 000稀釋的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt、mTOR、GAPDH、CD9、CD61、CD81、LC3-Ⅱ、p62、Beclin 1一抗孵育過夜，與山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，ECL試劑盒曝光拍照，Image J軟件對曝光結(jié)果進(jìn)行定量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism軟件繪制圖形，所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果 透射電鏡觀察外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示（圖1A）：HEEC-exo、Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo粒徑為30～100 nm，雙層膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)呈“杯托”樣，Western blot檢測結(jié)果顯示（圖1B），HEEC-exo、Nom-Eca-109-exo、Hypo-Eca-109-exo均表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、CD81，說明提取的外泌體符合其生物學(xué)特征。

2.2 外泌體攝取結(jié)果 紅色PKH-26染料標(biāo)記外泌體，藍(lán)色DAPI染料標(biāo)記巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核，共孵育后檢測發(fā)現(xiàn)，DAPI染料標(biāo)記的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞核附近出現(xiàn)紅色熒光，說明外泌體可被巨噬細(xì)胞攝取（圖2）。

圖2 外泌體攝取鑒定結(jié)果（×20）Fig.2 Identified results of exosomal uptaking （×20）

2.3 低氧誘導(dǎo)的食管癌外泌體促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分化 qRT-PCR檢測結(jié)果（圖3A）顯示，與各組外泌體共孵育后，相比于PBS組，HEEC-exo組M1和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)均無顯著差異（P＞0.05），而Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo組M1型標(biāo)志蛋白CCR7和TLR2表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD206和CD14表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.001），說明Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo可顯著誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，而Hypo-Eca-109-exo組細(xì)胞CD206和CD14表達(dá)顯著高于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.001），說明低氧條件下Eca-109細(xì)胞外泌體能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步鑒定結(jié)果顯示（圖3B），Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo組CD206+CD14+細(xì)胞比例顯著升高（P＜0.001），且Hypo-Eca-109-exo組CD206+CD14+細(xì)胞比例高于Nom-Eca-109-exo組，進(jìn)一步說明低氧誘導(dǎo)的食管癌外泌體能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。

圖3 Hypo-Eca-109-exo促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分化Fig.3 Hypo-Eca-109-exo promotes differentiation of M2 type macrophages

2.4 低氧誘導(dǎo)的食管癌外泌體促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌 ELISA檢測結(jié)果（圖4）顯示，相比于PBS組，HEEC-exo組巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子無顯著變化（P＞0.05），Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo組細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-12、TNF-α顯著減少（P＜0.05），Arg1、IL-10和TGF-β分泌顯著增加（P＜0.001），Hypo-Eca-109-exo組IL-1β、IL-12、TNF-α分泌顯著少于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.05），Arg1、IL-10和TGF-β分泌顯著多于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.05），IL-1β、IL-12、TNF-α由M1型巨噬細(xì)胞分泌，Arg1、IL-10和TGF-β由M2型巨噬細(xì)胞分泌，說明Hypo-Eca-109-exo可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分化。

2.5 低氧誘導(dǎo)的食管癌外泌體促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞自噬 Western blot檢測結(jié)果（圖5）顯示，與Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo共孵育后，巨噬細(xì)胞中LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)顯著高于PBS組和HEEC-exo組（P＜0.001），p62表達(dá)顯著低于PBS組和HEEC-exo組（P＜0.001），且Hypo-Eca-109-exo組細(xì)胞LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)顯著高于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.01），p62表達(dá)顯著低于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.001），LC3-Ⅱ和Beclin-1表達(dá)與細(xì)胞自噬水平呈正相關(guān)，p62表達(dá)與細(xì)胞自噬呈負(fù)相關(guān)，說明Hypo-Eca-109-exo可顯著促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞自噬。

圖5 Hypo-Eca-109-exo調(diào)控自噬相關(guān)基因的蛋白表達(dá)Fig.5 Hypo-Eca-109-exo regulates protein expressions of autophagy-related genes

2.6 低氧條件下食管癌外泌體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)食管癌細(xì)胞遷移和侵襲 外泌體和M0型巨噬細(xì)胞共孵育后檢測發(fā)現(xiàn)（圖6），Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)均顯著高于PBS組和HEEC-exo組（P＜0.05），而Hypo-Eca-109-exo組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)顯著高于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.001），說明Hypo-Eca-109-exo可促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型分化，從而促進(jìn)食管癌遷移和侵襲。

圖6 Hypo-Eca-109-exo誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化影響食管癌細(xì)胞遷移和侵襲（×10）Fig.6 Hypo-Eca-109-exo-induced polarization of M2 macrophages affects migration and invasion of esophageal cancer cells （×10）

2.7 低氧條件下食管癌外泌體激活PI3K/Akt/mTOR信號通路 Western blot檢測結(jié)果（圖7）顯示，與Nom-Eca-109-exo和Hypo-Eca-109-exo共孵育后，巨噬細(xì)胞中PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平均顯著高于PBS組和HEEC-exo組（P＜0.01），Hypo-Eca-109-exo組細(xì)胞PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平均顯著高于Nom-Eca-109-exo組（P＜0.001），說明Hypo-Eca-109-exo可顯著激活PI3K/Akt/mTOR信號通路。

圖7 Hypo-Eca-109-exo激活巨噬細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號通路Fig.7 Hypo-Eca-109-exo activates macrophage PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

3 討論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤賴以生存和發(fā)展的必要條件，在食管癌腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等對其生長、代謝和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要調(diào)控作用［10］。其中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠通過PD-1信號通路調(diào)控食管癌免疫逃逸，腫瘤浸潤的巨噬細(xì)胞與食管癌化療耐藥和患者預(yù)后相關(guān)［11-12］。缺氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的重要特征，是誘導(dǎo)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要因素，缺氧誘導(dǎo)因子激活可促進(jìn)腫瘤血管新生、轉(zhuǎn)移、耐藥等［13］。研究表明低氧可誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌生長和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，低氧誘導(dǎo)的miR-10b-3p通過靶向TSGA10促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌生長和轉(zhuǎn)移［14-15］。

外泌體是一類由多種活細(xì)胞分泌的納米級囊泡，粒徑為30～100 nm，內(nèi)含多種母細(xì)胞遺傳物質(zhì)，調(diào)控遠(yuǎn)端靶組織和靶器官，腫瘤外泌體由腫瘤細(xì)胞分泌至腫瘤微環(huán)境作用于免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞等［16-17］。巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的重要免疫細(xì)胞，可分為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞，M1型巨噬細(xì)胞具有促炎功能，有抗腫瘤活性，M2型巨噬細(xì)胞是免疫抑制細(xì)胞表型，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生和發(fā)展，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與M2型巨噬細(xì)胞相似，可誘導(dǎo)腫瘤血管新生、促進(jìn)免疫逃逸等［18］。研究表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可富集于缺氧部位［19］。亦有研究表明，缺氧環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞外泌體對腫瘤發(fā)展有顯著促進(jìn)作用。本研究分別提取了食管上皮細(xì)胞HEEC、食管癌細(xì)胞Eca-109及低氧誘導(dǎo)的Eca-109細(xì)胞分泌的外泌體，檢測發(fā)現(xiàn)與Hypo-Eca-109-exo共孵育后巨噬細(xì)胞CCR7和TLR2表達(dá)顯著下調(diào)，CD206和CD14表達(dá)顯著上調(diào)，且細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-12、TNF-α分泌顯著減少，Arg1、IL-10和TGF-β分泌顯著增加，CCR7和TLR2為M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白，CD206和CD14為M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白，IL-1β、IL-12、TNF-α為M1型巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，Arg1、IL-10和TGF-β為M2型巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子，說明低氧條件下食管癌細(xì)胞分泌的外泌體可顯著促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分化。WANG等［7］研究表明，缺氧條件下胰腺癌外泌體miR-301a可通過激活PTEN/PI3Kγ信號通路誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。推測低氧條件下食管癌細(xì)胞分泌的外泌體也可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化影響食管癌生物學(xué)功能。

自噬是一種依賴溶酶體的自我保護(hù)機(jī)制，主要通過清除不必要或有害的物質(zhì)以及不同應(yīng)激反應(yīng)中損壞的細(xì)胞器維持正常細(xì)胞內(nèi)環(huán)境［20］。LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62是參與自噬的重要蛋白，LC3-Ⅱ則由LC3-Ⅰ經(jīng)泛素樣加工修飾而成，Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)與自噬小體數(shù)量成正比，p62蛋白可使泛素化底物在自噬溶酶體內(nèi)降解，p62表達(dá)與自噬呈負(fù)相關(guān)［21］。本研究發(fā)現(xiàn)與Hypo-Eca-109-exo共孵育后巨噬細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin-1表達(dá)顯著上調(diào)，p62表達(dá)顯著下調(diào)，說明低氧條件下食管癌細(xì)胞分泌的外泌體可顯著促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞自噬。將Eca-109細(xì)胞與外泌體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞共孵育后發(fā)現(xiàn)，與Hypo-Eca-109-exo共孵育的巨噬細(xì)胞可顯著誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞遷移和侵襲，說明低氧條件下食管癌細(xì)胞分泌的外泌體促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分化或自噬而誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移。CHEN等［22］研究表明，自噬介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分化有腫瘤治療潛力，提示食管癌外泌體調(diào)控巨噬細(xì)胞極化和自噬或可作為腫瘤治療靶點(diǎn)，其臨床應(yīng)用還需進(jìn)一步探究。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是調(diào)控自噬和巨噬細(xì)胞分化的重要信號通路，研究表明，結(jié)直腸癌分泌的EGF可通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化［23］。調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路亦可調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬［24］。miR-125a可通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)控巨噬細(xì)胞自噬［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，與Hypo-Eca-109-exo共孵育的巨噬細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號通路顯著激活，說明Hypo-Eca-109-exo可通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化和自噬。

綜上，低氧條件下，食管癌細(xì)胞外泌體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型分化和自噬而促進(jìn)食管癌遷移和侵襲，其機(jī)制可能為激活PI3K/Akt/mTOR信號通路，為食管癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了補(bǔ)充，但食管癌外泌體能否成為其臨床治療和診斷靶點(diǎn)還需進(jìn)一步探究。