脂聯素通過NF-κB通路調節高糖所致內皮細胞損傷的保護作用

袁靜 程楊陽 李紅梅 周科技

（1.武漢理工大學醫院，武漢 430070；2.中國人民解放軍中部戰區總醫院，武漢 430070）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）的傳統特征為高血糖引起的代謝和血流動力學變化［1-2］。越來越多的證據表明，脂質代謝紊亂在DN發展和進展中起關鍵作用［3-5］。脂肪不僅是最大的儲能器官，也是重要的內分泌器官，分泌大量具有生物活性的脂肪因子。脂聯素又稱脂肪細胞補體相關蛋白30（Acrp30），是一種在脂肪組織中大量存在的特異性脂肪因子，可增強機體對胰島素的敏感性［6］。脂聯素因其抗糖尿病和抗動脈粥樣硬化作用引起廣泛關注，有望成為糖尿病相關代謝綜合征的新療法。脂聯素有利于血管內皮細胞增殖，參與血管新生調控，包括DN血管內皮細胞［7］。氧化應激相關通路或炎癥相關通路是脂聯素有效降低糖尿病相關血管內皮損傷的主要途徑［8］。NF-κB、NLRP3炎癥小體是DN的重要炎癥刺激物，直接參與內皮細胞炎癥過程［9］。本課題組猜測NF-κB通路可能與脂聯素作用機制有關。本研究旨在探究脂聯素調控高糖誘導的內皮細胞存活及氧化應激、炎癥反應及線粒體功能的潛在機制及其與NF-κB通路的聯系。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞HUVEC購自美國菌種保藏中心；重組人脂聯素（球狀）購自上海高創化學科技公司；DMEM培養基、胎牛血清購自Hyclonc 公司；CCK8、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）購自上海碧云天；ROS檢測試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司；乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒、丙二醛（MDA）含量檢測試劑盒、人IL-4、IL-6、IL-1β ELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人臍靜脈內皮細胞HUVEC使用含10%胎牛血清的DMEM培養于37 ℃、5%CO2、飽和濕度恒溫培養，每2 d更換1次培養液。

1.2.2 細胞分組 含5 mmol/L葡萄糖培養基培養48 h的內皮細胞標記為NC組；含25 mmol/L葡萄糖培養基培養48 h的內皮細胞標記為HG組。含1、2、4 μg/ml脂聯素與25 mmol/L葡萄糖共同培養48 h的內皮細胞依次標記為L組、M組、H組。PBS、LPS聯合4 μg/ml脂聯素處理的HUVEC細胞標記為H+PBS組、H+LPS組。

1.2.3 CCK8檢測細胞增殖 收集細胞，用培養液調整密度至0.5×105個/ml，200 μl/孔接種96孔板，分別培養24 h、48 h、72 h、96 h。20 μl/孔加入CCK8反應液振蕩混勻，避光孵育25 min，終止反應，檢測細胞吸光度（A490）。實驗重復3次，每次3個復孔。細胞存活率（%）=A490實驗組/A490對照組×100%。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡收集細胞，預冷PBS洗滌5次，500 μl結合緩沖液重懸。加入Annexin V-FITC工作液5 μl、PI工作液5 μl，室溫避光孵育30 min。300目篩過濾，流式儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次，每次3個復孔。細胞總凋亡率（%）=早期凋亡率（%）+晚期凋亡率（%）。

1.2.5 Western blot檢測細胞Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB和p-I-κBα蛋白表達 收集待測細胞，充分裂解，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性。取變性蛋白上清進行SDS-PAGE蛋白電泳、轉膜。0.5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，洗膜3次。加入稀釋后的一抗Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB和p-I-κBα（均為1 000倍稀釋），4 ℃孵育過夜；洗滌3次，加入HRP標記的二抗（500倍稀釋），37 ℃孵育2 h，洗滌3次。ECL顯色液顯影，凝膠成像系統曝光，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參計算蛋白表達。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.2.6 ELISA檢測細胞上清LDH、GSH-Px、SOD、MDA、IL-4、IL-6、IL-1β濃度 收集細胞，按試劑盒說明書操作，3 000 r/min離心5 min，取上清。檢測樣本中LDH、GSH-Px、SOD、MDA、IL-4、IL-6、IL-1β濃度。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.2.7 免疫熒光法檢測細胞ROS 收集細胞，按ROS檢測試劑盒操作，暗室內用1 000倍稀釋的DCFH-DA培養液孵育細胞1 h，胰酶消化，3 000 r/min離心5 min，PBS清洗。熒光顯微鏡下觀察拍照。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.2.8 JC-1染色法檢測細胞線粒體膜電位 收集細胞，冷卻PBS清洗3次。按線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）說明書操作，5倍稀釋的JC-1染色工作液染色，37 ℃孵育20 min，JC-1染色緩沖液洗滌3次，細胞培養液收集細胞，流式細胞儀分析細胞線粒體膜電位水平。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.2.9 RT-qPCR檢測NLRP3表達 TRIzol液提取總RNA，使用Primescript RT試劑將總RNA反轉錄為cDNA。RT-qPCR試劑盒檢測NLRP3水平。以β-actin為內參，2-ΔΔCt計算NLRP3相對表達。引物由primer premier 5.0和NCBI的primer BLAST設計：NLPR3 正向引物：5'-AGTGGATGGGTTTGCTGGGAT-3'，反向引物：5'-TGCGTGTAGCGACTGTTGAGG-3'。β-actin正向引物：5'-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3'，反向引物：5'-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3'。實驗重復3次，每次3個復孔。

1.3 統計學處理 實驗數據用SPSS23.0統計分析。計量資料以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脂聯素對高糖處理的內皮細胞增殖的影響與NC組相比，HG組內皮細胞48 h、72 h、96 h增殖率均降低（P＜0.05）；與HG組相比，M、H組內皮細胞48 h增殖率均升高，L、M、H組內皮細胞72 h、96 h增殖率均升高（P＜0.05）；與L組相比，M、H組內皮細胞48 h、72 h、96 h增殖率升高（P＜0.05）；與M組相比，H組內皮細胞48 h、72 h、96 h增殖率升高（P＜0.05，圖1）。可見脂聯素以濃度依賴性提升高糖處理的內皮細胞增殖率。

圖1 不同濃度脂聯素促進高糖處理的內皮細胞增殖Fig.1 Different concentrations of adiponectin promotes proliferation of endothelial cells treated with high glucose

2.2 脂聯素對高糖處理的內皮細胞凋亡的影響與NC組相比，HG組內皮細胞Cleaved caspase-3蛋白表達、凋亡率均升高（P＜0.05）；與HG組相比，L、M、H組內皮細胞Cleaved caspase-3蛋白表達、凋亡率均降低（P＜0.05，圖2），且呈劑量依賴性。

圖2 內皮細胞Cleaved caspase-3表達和流式細胞術檢測細胞凋亡Fig.2 Expression of Cleaved caspase-3 in endothelial cells and detection of apoptosis by flow cytometry

2.3 脂聯素對高糖處理的內皮細胞氧化應激的影響 與NC組相比，HG組內皮細胞LDH、SOD和MDA濃度均升高，ROS、GSH-Px濃度均降低（P＜0.05）；與HG組相比，L、M、H組內皮細胞LDH、SOD和MDA濃度均降低，ROS、GSH-Px濃度均升高（P＜0.05，圖3），且呈劑量依賴性。

圖3 脂聯素對高糖處理的內皮細胞LDH、ROS、GSH-Px、SOD和MDA的影響Fig.3 Effects of adiponectin on LDH， ROS， GSH-Px， SOD and MDA in high glucose treated endothelial cells

2.4 脂聯素對高糖處理的內皮細胞線粒體膜電位的影響 與NC組相比，HG組內皮細胞線粒體膜電位水平、IL-4、IL-6、IL-1β濃度均升高（P＜0.05）；與HG組相比，L、M、H組內皮細胞線粒體膜電位水平、IL-4、IL-6、IL-1β濃度均降低（P＜0.05，圖4），且呈濃度依賴性。

圖4 脂聯素對高糖處理的內皮細胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effect of adiponectin on mitochondrial membrane potential of high glucose treated endothelial cells

2.5 脂聯素對高糖處理的內皮細胞NF-κB通路的影響 與NC組相比，HG組內皮細胞NLRP3、ASC、Cleaved caspase-3、p-NF-κB蛋白表達均升高，p-IκBα蛋白表達降低（P＜0.05，圖5）；與HG組相比，L、M、H組內皮細胞上述指標均發生負調控，且呈濃度依賴性。

圖5 脂聯素對高糖處理的內皮細胞NLRP3、ASC、Cleaved caspase-3、p-NF-κB和p-I-κBα蛋白表達的影響Fig.5 Effects of adiponectin on NLRP3， ASC， Cleaved caspase-3， p-NF-κB and p-I-κBα protein expressions of endothelial cells treated with high glucose

2.6 PBS對脂聯素抵抗高糖處理的內皮細胞損傷作用的調控 與H+PBS組相比，H+LPS組內皮細胞48 h、72 h、96 h活性顯著降低，LDH、SOD和MDA均升高，ROS、GSH-Px均降低，細胞凋亡率、線粒體膜電位、IL-4、IL-6、IL-1β含量均升高，Cleaved caspase-3、NLRP3、ASC、Caspase-1、p-NF-κB蛋白表達均升高，p-I-κBα蛋白表達降低（P＜0.05，圖6）。

圖6 PBS對脂聯素調控高糖處理的內皮作用的影響Fig.6 Effect of PBS on adiponectin regulation of endothelial cells treated with high glucose

3 討論

人和嚙齒類動物代謝過程中，脂聯素具有胰島素增敏、抗動脈粥樣硬化和抗炎作用，因此脂聯素替代療法可能成為治療肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和動脈粥樣硬化的潛在多功能靶點［10］。KIM等［11］研究報道，高糖處理的腎小球內皮細胞（glomerular cell，GEC）、小鼠足細胞中，脂聯素提高細胞內Ca2+水平，激活CaMKKβ、Ser431LKB1磷酸化、Thr172 AMPK/PPARα通路及下游信號傳導，降低高糖誘導的氧化應激和凋亡，改善內皮功能障礙，說明脂聯素通過激活細胞內Ca2+/LKB1-AMPK/PPARα通路改善GEC和足細胞損傷。本研究在體外建立高糖誘導的內皮細胞損傷模型，不同濃度脂聯素處理后，內皮細胞增殖能力得到恢復，凋亡率下調，LDH、SOD、MDA、IL-4、IL-6、IL-1β分泌受到抑制，ROS、GSH-Px濃度回升，線粒體膜電位水平也得到恢復，且具有濃度依賴性，充分說明脂聯素在抵抗高糖對內皮細胞損害中的潛在價值。杜蕓輝等［12］報道，脂聯素在糖尿病血管內皮損傷中的保護作用機制與APPL1（APPL1基因編碼的銜接蛋白包含PH結構域、PTB結構域以及亮氨酸拉鏈基序）通路、窖蛋白-1信號通路、cAMP/PKA通路活性相關。但脂聯素在內皮細胞抗糖作用機制與NF-κB通路的關系有待深入研究。

NF-κB通路參與包括糖尿病在內的許多疾病炎癥階段，但該通路與脂聯素的相互作用尚未清楚［13］。HU等［14］發現，晚期糖基化終產物誘導的內皮細胞損傷模型中，NF-κB/NLRP3通路激活，AMPK活性受抑制，紅景天苷能夠激活AMPK磷酸化，抑制NF-κB p65和NLRP3炎癥小體，減輕內皮細胞炎癥和氧化應激，說明紅景天苷通過AMPK/NF-κB/NLRP3信號通路改善晚期糖基化終產物誘導的內皮炎癥和氧化應激。YI等［15］報道，NF-κB/NLRP3信號通路參與高糖誘導的系膜細胞炎癥、纖維化和增殖，linc-RNA-Gm4419特異性抑制該通路活性減輕高糖對系膜細胞的損傷。孟祥龍等［16］在糖尿病小鼠模型中發現，NF-κB/NLRP3通路異常活躍，給予生、熟地黃后該通路活性通過AMPK得到抑制，小鼠器官代謝及抗炎功能均得到改善。說明NF-κB/NLRP3通路活性增強參與糖尿病形成、發生、發展及治療。本研究發現高糖誘導的內皮細胞中，NF-κB通路關鍵基因NLRP3、ASC、Cleaved caspase-3、p-NF-κB表達上升，說明該通路活性得到激活，與既往研究結果一致。進一步研究顯示，脂聯素呈濃度依賴性下調NLRP3、Caspase-1、p-NF-κB，上調p-I-κBα，證明脂聯素抑制高糖誘導的內皮細胞NF-κB通路活性。LPS刺激NF-κB信號通路進行恢復實驗顯示，激活NF-κB明顯降低脂聯素對高糖誘導的內皮細胞的保護作用，說明NF-κB參與脂聯素抵抗高糖所致細胞損傷過程。

綜上，脂聯素減輕高糖對內皮細胞炎癥和氧化應激等損傷作用，維持內皮細胞線粒體功能，潛在機制與抑制NF-κB通路相關，為脂聯素在糖尿病臨床治療中的應用奠定了理論基礎。本研究結果僅在體外得到初步驗證，下一步將開展動物體內研究，為脂聯素用于糖尿病治療提供更有說服力的支持。