基于生物信息學研究宮內生長受限的免疫機制及中藥預測

杜志欣 劉岳軒 張一格 江煜 張桐 楊麗萍

（1.河南中醫藥大學醫學院，鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 450046）

宮內生長受限（intrauterine growth restriction，IUGR）是圍產兒死亡的第二大原因，與多種不良妊娠結局相關，同時影響患者兒童期以及成年期的健康，與成年后的神經系統疾病、心血管疾病、內分泌疾病等慢性非傳染性疾病密切相關［1］。我國2019年《胎兒生長受限專家共識》將IUGR定義為受母體、胎兒、胎盤等多種因素影響，胎兒生長未達到其應有的生長潛能，多表現為超聲估測胎兒體質量或腹圍低于相應胎齡第10百分位數以下的胎兒［2］。隨著我國二孩政策的開放，IUGR的發病率日益升高，影響我國的經濟發展與家庭幸福感。目前國內外對IUGR發病機制已有一定研究，包括胎兒、母體及胎盤等，但具體機制仍未明確。

現有研究發現母胎的免疫耐受在妊娠過程中發揮重要作用［3］。胎兒和母體的免疫細胞如淋巴細胞、調節性T細胞、巨噬細胞等之間的作用是妊娠所必需的［4］。母胎界面的免疫失調是IUGR、先兆子癇等妊娠疾病發生的主要原因［5］。從免疫的角度研究IUGR的發生發展已經成為學者研究的熱點。

本文通過生物信息學對IUGR胎盤的芯片數據進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）分析，通過R包篩選IUGR胎盤組織與正常胎盤組織之間的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），對DEGs進行富集分析并尋找出影響IUGR發病的關鍵基因，通過關鍵基因的受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析評價關鍵基因的診斷效能。通過單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）算法評估24種免疫細胞在IUGR胎盤的相對含量分析，進行關鍵基因與免疫浸潤的相關性分析，篩選免疫相關的關鍵基因并對其進行中藥預測。本研究旨在為IUGR的診斷與治療提供思路和方法，為研究IUGR發生發展的分子機制和實驗研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 芯片數據來源 以“fetal growth restriction”為關鍵詞，基于GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）檢索基因表達譜，選擇“Homo sapiens”人類樣本，獲得編號為GSE12216的數據集。該數據集共包含16個樣本，8個健康對照組及8個IUGR組的胎盤樣本，平臺為GPL2986、ABI Human Genome Survey Microarray Version 2。

1.2 芯片數據預處理和DEGs的篩選 對芯片數據進行處理后，通過“ggplot2”包對質量控制后的芯片數據進行可視化分析。R語言“limma conductor”軟件包對芯片數據進行分析，以|log2FC|＞1，P＜0.05作為篩選標準［6］。基于“ggplot2”包，根據差異表達數據繪制火山圖，同時使用“ComplexHeatmap”包繪制基因矩陣熱圖。

1.3 GSEA分析 GSEA分析對數據集所有基因進行分析，可以敏感地找到顯著富集的基因集及其變化趨勢。運用R“clusterProfiler”包進行GSEA的基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析［7］，并使用“ggplot2”對富集前5結果進行可視化，以FDR＜0.25且P＜0.05為篩選標準。

1.4 DEGs功能富集分析及關鍵基因的篩選 運用R包“GOplot”對DEGs進行結合log值的GO與KEGG分析［8］。將DEGs輸入STRING（https：//stringdb.org/）數據庫進行蛋白-蛋白相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析，選取得分＞0.9的基因通過Cytoscape軟件進行可視化分析。應用Cytoscape中的CytoHubba插件的最大集團中心度（maximal clique centrality，MCC）算法找出排名前10的基因定義為關鍵基因［9］。

1.5 關鍵基因的ROC分析 對關鍵基因進行ROC分析，采用R語言的“pROC”包進行數據分析，“ggplot2”包用于可視化分析，相關基因的治療與診斷作用根據血藥濃度-時間曲線下面積（area under curve，AUC）進行評價［10］。

1.6 免疫浸潤分析 ImmuCellAI（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI/#！/）是科研團隊基于ssGSEA算法開發的一種T細胞浸潤豐度分析的工具，可以計算24種免疫細胞豐度［11］。通過ImmuCellAI獲得樣本的免疫細胞浸潤情況，使用“ggplot2”包創建了包含24種免疫細胞類型的熱圖。兩組之間免疫細胞的豐度差異通過Wilcoxon秩和檢驗分析比較，以P＜0.05為篩選標準，使用“ggplot2”包進行可視化分析。

1.7 關鍵基因與免疫浸潤的相關性分析及潛在中藥預測 通過Spearman統計分析的方法計算關鍵基因與免疫細胞豐度之間的相關性，并通過“ggplot2”包可視化分析［12］。Coremine Medical（https：//coremine.com/medical/#search）用于篩選與關鍵基因相關的中藥［13］。根據預測結果，對中藥進行功效及歸經的統計分析，并篩選出現頻次最高的中藥進行網絡藥理學分析。

從TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems pharmacology）數據庫（口服生物利用度≥30%，類藥性≥0.18）以及BATman（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）數據庫篩選活性成分及相關靶點信息。通過蛋白質數據庫UniProt（http：//www.uniprot.org/uploadlists/）統一靶點名稱。基于CytoHubba的MCC算法篩選出排列前20的靶點。

2 結果

2.1 DEGs芯片數據質量控制 將基因芯片GSE12216數據集中的數據進行標準化處理，并繪制均一化圖（圖1）。結果顯示，16個樣本數據的中位數基本處于一條線上，表明該數據集質量可靠，可進行下一步數據分析。

2.2 DEGs的篩選 基于GEO數據庫將GSE12216中8例正常胎盤樣本和8例IUGR胎盤樣本分為對照組和實驗組進行差異基因篩選，共獲得228個DEGs，其中上調基因154個，下調基因74個，熱圖與火山圖如圖2。

圖2 GSE12216的熱圖（A）與火山圖（B）Fig.2 Heat map （A） and volcano map （B） of GSE12216

2.3 GSEA基因富集分析 對數據集基因進行GSEA分析，GSEA-KEGG結果顯示（圖3），IUGR組胎盤基因主要富集于溶酶體信號通路、細胞周期信號通路、鞘糖脂生物合成的血紅蛋白信號通路、類固醇激素生物合成信號通路以及剪接體信號通路。其中，溶酶體信號通路具有最高的標準化富集得分（normalized enrichment score，NES）（NES=1.77，P＜0.001）。GSEA-GO分析顯示（圖4），IUGR胎盤基因顯著富集在趨化因子受體結合、對趨化因子的反應、G蛋白偶聯神經遞質受體活性、有絲分裂DNA復制以及趨化因子活性，其中，趨化因子受體結合（NES=-2.06，P＜0.001）。

圖3 GSEA-KEGG分析Fig.3 GSEA-KEGG analysis

圖4 GSEA-GO分析Fig.4 GSEA-GO analysis

2.4 DEGs功能富集分析及關鍵基因的篩選 對DEGs進行GO功能分析和KEGG通路分析（圖5），GO分析結果顯示其生物過程主要集中在氧化應激、胎盤發育以及神經元發育等方面；細胞組成主要集中在質膜、薄膜筏、膜微區、突觸后膜等部位。KEGG信號通路富集分析顯示TNF信號通路、IL-17信號通路和NF-κB信號通路顯著富集。將差異基因導入STRING數據庫中進行PPI分析，通過Cytoscape軟件繪制PPI網絡，通過CytoHubba的MCC算法篩選出10個關鍵基因：CSF2、IRAK1、PTGS2、FLT1、CHUK、CXCL12、FOS、LEP、CXCL2以及RELB（附圖1，www.immmune99.com）。

圖5 DEGs的GO（A）和KEGG（B）分析Fig.5 GO （A） and KEGG （B） analysis of DEGs

2.5 關鍵基因的ROC分析 對10個關鍵基因進行ROC分析（圖6），結果顯示10個關鍵基因均AUC＞0.7，提示關鍵基因的診斷價值良好。

圖6 關鍵基因的ROC分析Fig.6 ROC analysis of hub genes

2.6 免疫浸潤分析 基于ImmuCellAI進行免疫浸潤分析。熱圖顯示了每個樣本中24種免疫細胞類型（圖7）。豆莢圖顯示了IUGR組與正常組胎盤組織樣本中免疫浸潤細胞的差異（圖8）。研究發現在IUGR胎盤組織中自然殺傷T（natural killer T，NKT）細胞明顯增多（P＜0.001）；單核細胞在IUGR組的胎盤組織中減少（P＜0.05）。

圖7 IUGR免疫浸潤熱圖Fig.7 IUGR immune infiltration heat map

圖8 IUGR與正常組胎盤的免疫浸潤差異分析Fig.8 Analysis on difference of placental immune infiltration between IUGR and normal group

2.7 關鍵基因與免疫細胞浸潤相關性分析及中藥預測 相關性熱圖提示關鍵基因CSF2、IRAK1、PTGS2、CHUK、CXCL12、CXCL2以及RELB與免疫細胞浸潤有較高的相關性（圖9）。

圖9 關鍵基因與免疫浸潤的相關性熱圖Fig.9 Heat map of correlation between hub genes and immune infiltration

將7個免疫浸潤相關關鍵基因映射到Coremine Medical數據庫，篩選出潛在中藥，以P＜0.05為差異有統計學意義，共篩選出143味相關中藥（表1）。將這些中藥進行歸經以及功效分析，結果顯示IUGR免疫浸潤相關中苷多歸屬肝經、肺經、腎經以及脾經，以清熱類和補虛類中藥為主（圖10）。

表1 免疫相關關鍵基因及其映射的中藥Tab.1 Immune related key genes and their mapping of traditional Chinese medicine

結合文獻研究結果發現免疫相關中藥出現頻次最高的為人參以及黃芩。故篩選上述2味中藥構建“藥物-活性成分-作用靶點”網絡（附圖2，www.immune99.com）。基于CytoHubba插件通過MCC算法篩選排列前20的靶點，結果提示，人參和黃芩的藥物活性成分參與調節TNF、IL6、JUN、TP53以及AKT1等基因，可能成為治療IUGR的潛在中藥。見圖11。

圖11 免疫相關中藥治療IUGR關鍵靶點圖Fig.11 Targets of immune-related traditional Chinese medicine in treatment of IUGR

3 討論

IUGR的發病與母胎免疫系統環境的異常密切相關，尋找影響IUGR患者母胎免疫系統環境中的關鍵基因或功能對于在分子水平上揭示IUGR的發病機制具有重要意義，也可為IUGR的早期診斷和新治療策略的制定提供依據。本研究通過對正常和IUGR胎盤組織進行DEGs分析，篩選出228個DEGs，包括上調基因154個和下調基因74個。根據全基因組的GSEA分析可知，IUGR組胎盤基因的GO富集主要集中在趨化因子及其受體。趨化因子與其受體的相互作用在免疫反應、細胞及器官的發育以及炎癥反應等方面均發揮重要作用。研究發現趨化因子12及其受體調節子宮內膜炎癥和胚胎植入的重塑，當失調時導致不良妊娠結局如IUGR和先兆子癇［14］。GSEA-KEGG富集結果顯示IUGR組胎盤基因主要富集在溶酶體信號通路。溶酶體可以促進免疫反應，促進細胞的新陳代謝以及維持細胞穩態等。自噬-溶酶體系統降解蛋白質是維持胎盤發育所必需的，其功能的異常會致使胎盤發育不良，從而導致先兆子癇或IUGR等不良妊娠的發生［15］。GSEA分析結果提示，免疫功能異常與IUGR的發病密切相關。

DEGs的KEGG分析顯示DEGs主要富集在TNF信號通路、NF-κB信號通路以及IL-17信號通路。TNF-α是機體免疫應答的重要組成，可以激活免疫系統［16］。TNF-α可以調節胎兒的生長發育，其表達的異常會導致胎盤的氧化應激以及血管功能障礙，從而導致IUGR的發生［17］。NF-κB是經典的炎癥因子，是免疫應答的中心調節分子［18］。NF-κB途徑可以誘導分離蛻膜基質細胞的凋亡與炎癥，誘導不良妊娠如IUGR的發生［19］。IL-17是免疫反應的重要成員，可以調控機體免疫系統［20］。在妊娠合并IUGR以及先兆子癇中，IL-17水平升高［21］。綜上所述，已有大量研究表明TNF信號通路、NF-κB信號通路以及IL-17信號通路與IUGR的發生發展有著密切聯系，表明本研究對于IUGR的生物信息學分析結果可靠。DEGs的功能富集結果進一步提示，IUGR的發生發展與機體免疫功能關系密切。

通過Cytohubba軟件的MCC算法，研究預測了與IUGR發病具有緊密關聯的10個關鍵基因：

CSF2、IRAK1、PTGS2、FLT1、CHUK、CXCL12、FOS、LEP、CXCL2以及RELB，重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子2（colony stimulating factor 2，CSF2）可以介導母胎界面的免疫調節，參與胚胎生長發育［22］。白細胞介素1受體相關激酶1（interleukin 1 receptor associated kinase 1，IRAK1）在流產患者中表達增加［23］。前列腺素內過氧化物合成酶2（prostaglandinendoperoxide synthase 2，PTGS2）與卵泡的生長發育密切相關，其表達的增加可以改善不良妊娠結局［24］。血管生長因子受體1（vascular endothelial growth factor receptor-1，FLT1）是胎盤功能障礙的生物標志物，可用于識別IUGR等不良妊娠的發生［25］。螺旋環螺旋結構域擴散激酶（conserved helix-loophelix ubiquitous kinase，CHUK）可影響NF-κB信號通路活性，從而參與IUGR病理過程［26］。趨化因子配體12（CXC chemokine ligand 12， CXCL12）是胎盤血管生成的關鍵驅動因素，在IUGR患者中表達水平升高［27］。原癌基因（FBJ osteosarcoma oncogene，FOS）可以影響胎盤滋養層細胞的增殖，在IUGR患者表達降低［28］，瘦素可以調節胎盤的細胞增殖、蛋白質合成、侵襲和凋亡等過程，其表達的改變與流產、先兆子癇以及IUGR的發病息息相關［29］。轉錄因子RELB可以調節胎盤中促腎上腺皮質激素釋放和前列腺素的釋放，在妊娠中發揮重要作用［30］。趨化因子配體2（CXC chemokine ligand 2， CXCL2）在早產小鼠的胎盤中表達上升［31］。對10個關鍵基因進行ROC分析發現10個關鍵基因均有良好的診斷效果，進一步驗證了關鍵基因的準確性。

為深入探索免疫浸潤在IUGR發病中的作用，本研究利用ssGSEA算法對樣本進行分析。結果顯示，與正常的胎盤組織相比，IUGR胎盤組織中NKT細胞明顯增多，單核細胞在IUGR胎盤組織中減少。NKT細胞介導了胎兒母體免疫，在妊娠早期的Th1型應答中起重要作用，NKT細胞的激活會導致小鼠流產［32］。單核細胞能夠吞噬衰老、受傷的細胞和入侵人體內部的異物，對人體免疫功能發揮重要作用。研究表明，淋巴細胞與單核細胞比例的增高提示不良妊娠的發生［33］。以上文獻研究提示本預測具有一定的參考意義。此外，本研究通過評估IUGR胎盤相關免疫細胞的浸潤情況及分析關鍵基因表達水平的高低與不同免疫細胞浸潤程度的相關性，發現這7個關鍵基因的異常表達與免疫細胞的浸潤有一定相關性。

為了從眾多中藥中篩選治療IUGR的藥物，本文通過COREMINE數據庫對干預IUGR免疫浸潤的相關中藥進行預測并對其歸經和功效分析，發現藥物多歸于肺經、肝經以及腎經且藥物多為清熱類以及補虛類。根據預測結果選出出現頻數最高的中藥，并結合相關文獻研究，發現人參以及黃芩最有可能通過干預IUGR的免疫機制起到治療效果。人參味甘微溫，自古以來便有百草之王之稱。現代研究發現人參發揮重要的免疫調節作用，可以增強機體的免疫功能［34］。臨床研究發現人參治療先兆流產的療效可靠，這與人參能提高機體免疫力以及抑制血清TNF-α的分泌等機制有關［35］。實驗研究發現人參莖葉總皂苷可以通過抑制炎癥反應以及氧化應激改善IUGR大鼠的妊娠結局［36］。黃芩為性寒味苦，具有清熱安胎之功效，臨床常用黃芩來治療妊娠類疾病［37］。黃芩苷是黃芩的主要活性成分，具有抗炎和抗凋亡的功能，黃芩苷可有效減輕先兆子癇大鼠胎盤中的促炎細胞因子產生，抑制免疫反應，改善妊娠結局［38］。黃芩苷還可提高IUGR胎鼠存活率，增加IUGR胎鼠體質量［39］。以上文獻研究進一步證實人參以及黃芩最有可能通過干預機體免疫功能，作為IUGR分子治療藥物的潛在來源。

本文利用生物信息學方法對于IUGR的免疫浸潤機制進行分析，并預測免疫相關關鍵基因所涉及的中藥，對于IUGR的機制研究及臨床用藥具有參考意義。本研究局限之處在于數據分析來源依賴于GEO數據庫中的IUGR芯片，芯片納入的樣本數量有限，對于結果的分析可能造成偏差，因此需要進一步實驗驗證。