經后增殖方含藥血清對超排卵大鼠卵巢顆粒細胞GDF9表達及凋亡的調控機制

楊貞， 陳小燕， 江少如， 葉淑珠， 方曉宏， 鄧偉民， 郭新宇

（1.揭陽市人民醫院，廣東揭陽 522000；2.南部戰區總醫院，廣東廣州 510010；3.前海人壽廣州總醫院，廣東廣州 511325）

本課題組前期通過臨床研究證實，益氣血法能提高不孕患者體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中胚胎移植成功率和妊娠率[1-2]。但益氣血法具體作用機制尚不完全清楚。顆粒細胞，作為卵泡中數量最多的一種細胞，能通過合成和表達多種激素、生長因子及相關受體，調節卵母細胞及卵泡的發育[3]；而顆粒細胞凋亡則可影響該過程，促使卵泡閉鎖[4]。作為IVF-ET 周期中的關鍵環節，控制性超排卵（COH）的應用，能使一個月經周期中卵巢有多個卵泡同時發育。但有研究證實，在COH 中所使用的促性腺激素釋放激素激動劑（GnRHa）、促性腺激素（Gn）等，可破壞卵細胞中遺傳物質的穩定性，影響核質成熟的同步性，從而抑制卵細胞的發育，降低胚胎質量及妊娠率[5-6]。因此，如何提高卵細胞及胚胎質量一直是生殖醫學領域的研究熱點之一?；诖?，本研究擬通過細胞實驗探討益氣血法經后增殖方含藥血清對超排卵大鼠卵巢顆粒細胞的調控機制，以期進一步完善益氣血法應用于IVF-ET 的理論依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雌性SD大鼠27只，鼠齡6~8周，體質量180~220 g，購自南方醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（粵）2021-0041，飼養于中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，實驗動物使用許可證號：SYXK（粵）2018-0131。動物實驗方案已獲得揭陽市人民醫院倫理委員會批準，批準編號：201903。實驗遵照《關于善待實驗動物的指導性意見》（國科發財字[2006] 398 號）。自然光照，大鼠自由飲水和攝食，適應性飼養1周后開始實驗，以陰道脫落細胞涂片檢查動情周期。

1. 2 藥物 經后增殖方（組成：黨參15 g、白術12 g、茯苓12 g、甘草6 g、熟地黃12 g、白芍12 g、當歸6 g、川芎6 g、菟絲子15 g、鹿角霜20 g、杜仲15 g、山萸肉10 g、川椒3 g），顆粒劑，10 g/袋，由廣東一方制藥有限公司制備，由南部戰區總醫院提供，批號：J2001003）；醋酸曲普瑞林（GnRHa，瑞士輝凌公司生產，批號：S11775A）；孕馬血清促性腺激素（PMSG，北京索萊寶公司生產，批號：601Q021）；人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠藥業，批號：201202）。

1. 3 試劑與儀器 M199 培養液（美國Hyclone 公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制劑SB203580（美國MCE公司，貨號：HY-10256）；核轉錄因子kappaB（NF-κB）抑制劑PDTC（美國MCE 公司，貨號：HY-18738）；逆轉錄試劑盒（美國Thermo 公司）；熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測試劑盒（美國Genecopoeia 公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的GAPDH 優質內參（上?？党缮锕荆?；兔多克隆生長分化因子9（GDF9）抗體（英國Abcam 公司）；山羊抗兔IgG（H+L）二抗（美國Southern Biotech 公司）；二喹啉甲酸（BCA）法蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物公司）；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）試劑盒（美國Promega 公司）。7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；multiscan MK3 酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；VE180 垂直電泳槽、VE186 轉移電泳槽（上海天能公司）；BG-Power 600i 型電泳儀（北京百晶生物公司）；CKX41倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；DMI6000B 倒置熒光顯微鏡（德國Leica 公司）。

1.4 COH模型及含藥血清的制備 將12只雌性大鼠隨機分為2組：COH組、COH+中藥組。COH模型的建立：陰道涂片為動情周期第3 天時，COH組、COH+中藥組的大鼠于每日上午9 時腹腔注射GnRHa 20 μg/kg，給藥濃度為20 μg/mL，連續7 d。第7 天同時注射PMSG 400 IU/kg，給藥濃度為400 IU/mL，48 h 后注射HCG 1 IU/g，給藥濃度為1 000 IU/mL。解剖可見大鼠雙側卵巢有多個優勢卵泡，則判斷造模成功。中藥灌胃：COH 造模第1 天起，COH+中藥組大鼠每日上午9 時分別給予經后增殖方4.5 g/kg（相當于3倍臨床等效劑量）[7]灌胃，給藥濃度0.33 g/mL，連續9 d；COH組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃。采血：造模第9 天，麻醉大鼠后腹主動脈取血，離心取上清液，56 ℃滅活，同組血清混勻分裝，-80 ℃保存，備用。

1. 5 顆粒細胞的制備 15 只雌性大鼠連續觀察2 個動情周期均正常。建立COH 模型，在注射HCG 后1.5 h 頸椎脫臼處死。無菌條件下快速取出大鼠雙側卵巢，置入37 ℃、5%CO2過夜預熱的M199培養液中，轉移至解剖顯微鏡下37 ℃恒溫板上，M199 培養液中洗3 次。解剖顯微鏡下，用鑷子輕輕撕開形態明顯的卵泡的卵泡膜，使卵泡內的顆粒細胞釋放到培養液中。加入0.1%透明質酸酶消化液，置于CO2孵箱中，5 min 后取出，用移液器輕輕吹打使其分散為單個細胞，加入10%胎牛血清培養液以中和透明質酸酶的作用從而中止消化。經一次性的200目細胞篩過濾后，以1 000 r/min（離心半徑16 cm）離心5 min，棄去培養液。M199培養液洗2 次，再次加入適量的M199 培養液重懸顆粒細胞，移液器輕柔抽吸使顆粒細胞重懸。用臺盼藍染色并計數，細胞存活率＞85%，再加入含M199培養液調至1×106個/mL。

1.6 顆粒細胞的培養 將顆粒細胞隨機種入事先用0.05%L-多聚賴氨酸均勻涂抹過的6孔板中，隨機分為5 組：空白血清組、含藥血清組、含藥血清+SB203580 組、含藥血清+PDTC 組、含藥血清+SB203580+PDTC 組。每孔2.5 mL，包含M199培養液89%體積，青-鏈霉素雙抗1%體積，大鼠血清10%體積[上述各組分別對應加入空白血清（COH組大鼠血清）、含藥血清（COH+中藥組大鼠血清）、含藥血清+p38MAPK 抑制劑SB203580（按說明書1∶1 000稀釋度，即濃度10 μmol/mL，SB203580試劑濃度10 mol/L，添加體積2.5 μL）、含藥血清+NF-κB抑制劑PDTC（按說明書1∶1 000稀釋度，即濃度10 μmol/mL，PDTC 試劑濃度10 mmol/mL，添加體積2.5 μL）、含藥血清+SB203580+PDTC（添加濃度及體積同上）]，于CO2孵箱中繼續培養24 h后，收集顆粒細胞用于后續檢測。

1.7 qRT-PCR 法檢測卵巢顆粒細胞中p38MAPK、酪蛋白激酶2（CK2）、核因子κB抑制蛋白α（IκBα）、NF-κB、GDF9 mRNA 的表達 按qPCR 試劑盒說明書進行操作。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。PCR 反應條件為：95 ℃、10 min 預變性；95 ℃、10 s 退火，55 ℃、20 s變性，72 ℃、35 s延伸，40個循環。循環結束后從55 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。以GAPDH進行參照，應用2-ΔΔCt法計算p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB、GDF9 mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.8 Western Blot 法檢測顆粒細胞中GDF9 蛋白的表達 提取顆粒細胞總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒測定蛋白水平后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），蛋白質聚偏氟乙烯（PVDF）膜上轉膜，添加兔多克隆GDF9一抗（1∶5 000 稀釋度）及山羊抗兔IgG（H+L）二抗（1∶20 000 稀釋度），添加發光液，顯影，ImageJ 軟件處理系統分析目的蛋白及內參GAPDH灰度值。

1.9 TUNEL法檢測卵巢顆粒細胞凋亡率 TUNEL檢測操作按試劑盒說明書進行，熒光鏡下觀察，每張封片隨機挑選5 個200 倍視野拍照，用ImageJ軟件處理系統分析顆粒細胞凋亡率。

1.10 統計方法 采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差（）表示。方差齊性檢驗采用Levene 法，多組間比較采用單因素方差分析。組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠卵巢顆粒細胞p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB的mRNA表達比較 含藥血清組的p38MAPK表達水平顯著低于空白血清組（P＜0.05）；含藥血清組NF-κB mRNA 表達水平低于空白血清組，但差異無統計學意義（P＞0.05）；含藥血清組IκBα、CK2 mRNA 表達水平均顯著高于空白血清組（均P＜0.05）。見表2。

表2 兩組大鼠卵巢顆粒細胞p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB mRNA相對表達水平比較Table 2 Comparison of mRNA relative expressions of p38MAPK，CK2，IκBα and NF-κB in ovarian granulosa cells between the two groups of rats（）

表2 兩組大鼠卵巢顆粒細胞p38MAPK、CK2、IκBα、NF-κB mRNA相對表達水平比較Table 2 Comparison of mRNA relative expressions of p38MAPK，CK2，IκBα and NF-κB in ovarian granulosa cells between the two groups of rats（）

注：①P＜0.05，與空白血清組比較

組別空白血清組含藥血清組t值P值NF-κB 1.003±0.140 0.817±0.031 2.249 0.088復孔數/個3 3 p38MAPK 1.000±0.053 0.777±0.075①4.212 0.014 CK2 1.003±0.101 1.993±0.369①-4.482 0.011 IκBα 1.000±0.035 1.920±0.266①-5.934 0.004

2.2 各組大鼠卵巢顆粒細胞GDF9 mRNA 和蛋白表達比較 各組GDF9 mRNA的表達水平：含藥血清組＞空白血清組＞含藥血清+PDTC 組＞含藥血清+SB203580 組＞含藥血清+SB203580+PDTC 組。其中：含藥血清+SB203580組和含藥血清+PDTC組比較，空白血清組和含藥血清+PDTC 組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；其余各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組GDF9 蛋白的表達水平：含藥血清組＞含藥血清+PDTC 組＞含藥血清+SB203580 組＞空白血清組＞含藥血清+SB203580+PDTC 組。其中：含藥血清+SB203580組與含藥血清+PDTC 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠卵巢顆粒細胞GDF9蛋白表達的Western Blot條帶Figure 1 Western Blot bands of GDF9 protein expression in ovarian granulosa cells in each group of rats

表3 各組大鼠卵巢顆粒細胞GDF9 mRNA和蛋白相對表達水平Table 3 Comparison of mRNA and protein relative expressions of GDF9 in ovarian granulosa cells among various groups of rats（）

表3 各組大鼠卵巢顆粒細胞GDF9 mRNA和蛋白相對表達水平Table 3 Comparison of mRNA and protein relative expressions of GDF9 in ovarian granulosa cells among various groups of rats（）

注：①P＜0.05，與空白血清組比較；②P＜0.05，與含藥血清組比較；③P＜0.05，與含藥血清+SB203580 組比較；④P＜0.05，與含藥血清+PDTC組比較

GDF9蛋白0.666±0.012 0.991±0.012①0.690±0.008①②0.693±0.007①②0.333±0.006①②③④1 789.369＜0.001組別空白血清組含藥血清組含藥血清+SB203580組含藥血清+PDTC組含藥血清+SB203580+PDTC組F值P值復孔數/個3 3 3 3 3 GDF9 mRNA 1.010±0.168 1.987±0.304①0.573±0.067①②0.817±0.126②0.257±0.047①②③④45.031＜0.001

2.3 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較 TUNEL染色后，熒光鏡下細胞核呈現藍色熒光的為正常細胞，呈現綠色熒光的為凋亡細胞?？瞻籽褰M呈現綠色熒光的細胞多，中藥血清組呈現綠色熒光的細胞少，加入抑制劑后呈現綠色熒光的細胞不同程度增多。各組卵巢顆粒細胞凋亡率：含藥血清組＜含藥血清+PDTC組＜含藥血清+SB203580組＜含藥血清+SB203580+PDTC 組＜空白血清組。其中：含藥血清+SB203580組和含藥血清+PDTC組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各組間比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡比較（DAPI染色，×200）Figure 2 Comparison of ovarian granulosa cells apoptosis among various groups of rats（DAPI staining，×200）

表4 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較Table 4 Comparison of the apoptosis index of ovarian granulosa cells among various groups of rats （）

表4 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較Table 4 Comparison of the apoptosis index of ovarian granulosa cells among various groups of rats （）

注：①P＜0.05，與空白血清組比較；②P＜0.05，與含藥血清組比較；③P＜0.05，與含藥血清+SB203580 組比較；④P＜0.05，與含藥血清+PDTC組比較

凋亡率/%42.818±1.290 5.878±0.823①15.124±0.328①②14.156±1.885①②23.842±1.075①②③④691.419＜0.001組別空白血清組含藥血清組含藥血清+SB203580組含藥血清+PDTC組含藥血清+SB203580+PDTC組F值P值復孔數/個5 5 5 5 5

3 討論

中醫藥在體外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期中的應用收效明顯，已被越來越多的臨床醫生及患者所接受。中醫對不孕的治療多以益氣血、補肝腎為主。本研究所用具有益氣血作用的經后增殖方，是由經典方八珍湯（黨參、白術、茯苓、甘草、熟地黃、當歸、白芍、川芎）加山萸肉、菟絲子、鹿角霜、杜仲、川椒組成。全方補益氣血、溫腎助陽，契合了不孕癥多肝腎氣血虧虛的特點。本課題組前期臨床研究發現，本方能提高人體內雌激素分泌的水平，促進卵泡發育，提高胚胎的著床潛能及種植率[1-2]。本課題組開展的多項研究證實，益氣血法能提高卵母細胞分泌GDF9的水平，并維持Bim低表達水平，促進顆粒細胞的增殖，抑制其凋亡，從而促進卵丘-卵母細胞復合體的發育，提高控制性超排卵（COH）卵泡和胚胎質量[7-11]。因此，在前期的研究基礎上，本研究進一步探討益氣血法在調節GDF9分泌及顆粒細胞凋亡過程中的作用機制。

p38MAPK/NF-κB 通路在細胞生長發育及細胞凋亡過程中具有重要的調節作用[12-13]。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）家族成員之一。有研究在DNA損傷細胞中發現，活化的p38MAPK能控制多種轉錄因子mRNA 表達的活性，在細胞因子產生、遺傳物質基因轉錄、基因翻譯和細胞生長發育、細胞凋亡過程中均起到重要作用[14-15]。在生殖系統中，睪丸和卵巢中主要有p38δ 亞型的表達[16]。NF-κB是重要的核轉錄調節因子，參與機體器官發育、組織損傷、免疫應答、細胞凋亡等多種生物學功能的調節[17]，在生殖方面，參與卵細胞生長及胚胎發育等過程中與凋亡相關基因的表達和調控[18]。有研究在DNA 損傷的細胞中發現，p38MAPK 能激活CK2，使IκBα 發生磷酸化反應，繼而激活NF-κB[14]。

GDF9 是轉化生長因子β（TGF-β）超家族成員，是卵母細胞分泌的生長因子。GDF9調控卵細胞中顆粒細胞的增殖、分化，調節卵母細胞的發育、排卵及黃素化[19-20]，是卵泡生長發育的重要調節因子。有研究[21]表明，多囊卵巢綜合征患者卵巢腔前卵泡中GDF9的表達明顯低于正常卵巢，可導致早期卵泡發育異常。而GDF9敲除的新生小鼠始基卵泡池規模幾乎不受影響，但始基卵泡消耗快，基因組測序結果提示GDF9與早發性卵巢功能不全相關[22]。

本研究結果顯示，經后增殖方含藥血清可提高COH大鼠卵巢顆粒細胞GDF9的表達，分別單獨阻斷p38MAPK和NF-κB通路均能減弱該作用，使GDF9 的表達水平下降，而同時阻斷p38MAPK 和NF-κB 通路使COH 大鼠卵巢卵巢顆粒細胞GDF9的表達水平進一步下降，且遠低于單獨阻斷p38MAPK 或NF-κB 通路。經后增殖方含藥血清可抑制COH 大鼠卵巢顆粒細胞的凋亡，p38MAPK 或NF-κB 通路的阻斷能減弱該作用，使COH 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率增加，而同時阻斷p38MAPK 或NF-κB 通路使COH 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率進一步升高，且遠高于單獨阻斷p38MAPK或NF-κB通路。提示益氣血法調節GDF9 分泌及顆粒細胞凋亡的機制可能與p38MAPK 通路或/和NF-κB 通路有關。

綜上所述，益氣血法經后增殖方對COH 大鼠卵巢顆粒細胞GDF9表達的促進作用和對卵巢顆粒細胞凋亡的抑制作用，可能是與p38MAPK通路或/和NF-κB通路雙信號通路基因表達有關。