益腸散結(jié)顆粒對(duì)結(jié)腸癌小鼠腸道菌群及免疫功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究

侯?lèi)?ài)畫(huà)， 戴玲玲， 孟鵬， 張曉妮， 譚松， 劉澤， 趙嘯虎

（1.煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，山東煙臺(tái) 264000；2.煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤四科，山東煙臺(tái) 264000；3.煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤一科，山東煙臺(tái) 264000）

結(jié)腸癌是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占全球惡性腫瘤的第3 位，死亡率占第5 位[1]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]顯示，我國(guó)每年約有120萬(wàn)患者被診斷為結(jié)直腸癌，其中，因結(jié)腸癌死亡的患者超過(guò)60 萬(wàn)。近年來(lái)研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)可介導(dǎo)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。腸道菌群失衡會(huì)導(dǎo)致腸道黏膜上皮細(xì)胞遺傳學(xué)改變，引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)和微環(huán)境紊亂，同時(shí)還可通過(guò)持續(xù)產(chǎn)生細(xì)胞毒素刺激腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前，姑息手術(shù)、放化療、靶向治療、免疫治療和介入治療等是晚期結(jié)腸癌的主要治療手段，但由于晚期結(jié)腸癌患者正氣不足和免疫力低下往往難以承受，且藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)亦致機(jī)體免疫力降低，對(duì)患者毒副作用較大[6]。因此，尋找有效低毒的治療方法對(duì)臨床治療結(jié)腸癌具有重要意義。中醫(yī)治法在結(jié)腸癌的綜合治療中具有獨(dú)特的辨證論治和整體思想，不僅可以幫助患者增強(qiáng)正氣和免疫力，還可以減輕臨床癥狀，提高生活質(zhì)量[7-8]。我院國(guó)家重點(diǎn)專(zhuān)科學(xué)術(shù)帶頭人、山東省名老中醫(yī)專(zhuān)家侯?lèi)?ài)畫(huà)教授總結(jié)中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)識(shí)及多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，基于“扶正祛邪治癌”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，以“益氣健脾、祛濕化濁、散結(jié)消積”為主要治法，擬定益腸散結(jié)方。本方治療結(jié)腸癌的臨床療效顯著，能減輕患者的臨床主癥，提高免疫功能及生活質(zhì)量，但具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探究益腸散結(jié)顆粒對(duì)結(jié)腸癌小鼠腸道菌群及免疫功能的作用及機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只SPF級(jí)4~6周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量17~19 g，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。將小鼠飼養(yǎng)于溫度21~25 ℃，相對(duì)濕度55%~65%的動(dòng)物房?jī)?nèi)，光照晝夜交替12 h/12 h循環(huán)，標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料及無(wú)菌水飼養(yǎng)，自由飲食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本研究方案已通過(guò)煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：2021-013-KY）。

1. 2 藥物、試劑與儀器 益腸散結(jié)顆粒（黨參24 g、炒白術(shù)15 g、黃芪30 g、茯苓15 g、薏苡仁15 g、砂仁9 g、姜半夏9 g、女貞子15 g、陳皮15 g、郁金9 g、大青葉6 g、魚(yú)腥草9 g、浙貝9 g、甘草9 g），由煙臺(tái)市中醫(yī)醫(yī)院制劑室加工顆粒。葡聚糖硫酸鈉（DSS，美國(guó)Sigma 公司）；氧化偶氮甲烷（AOM，瑞典TdB 公司）；過(guò)表達(dá)黑色素瘤缺失基因2（AIM2）質(zhì)粒（pcDNA-AIM2，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；免疫球蛋白（Ig）G、IgM、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（北京Solarbio 公司）；磁珠法土壤和糞便基因組DNA 提取試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）；AIM2、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）、胱天蛋白酶1（caspase-1）等抗體（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；CD4+抗體、CD3+抗體、CD8+抗體（美國(guó)Abcam公司）。高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；PCR儀（美國(guó)ABI公司）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Illumina MiseqDNA 測(cè)序儀（美國(guó)Illumina Sandiego公司）。

1.3 分組、模型制備與給藥 將60只小鼠隨機(jī)分為6 組，即正常組、模型組，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組，pcDNA-AIM2干預(yù)組，每組10只。采用AOM/DSS誘導(dǎo)法制備結(jié)腸癌模型[9]。除正常組外，其余各組小鼠均一次性腹腔注射10 mg/kg的致癌劑AOM；正常組一次性腹腔注射生理鹽水10 mg/kg?；謴?fù)7 d 后，除正常組外，其余各組小鼠灌胃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的DSS 水溶液，每日1 次，持續(xù)5 d，開(kāi)始腸炎Ⅰ期造模，而后換回飲用水持續(xù)14 d 為腸炎恢復(fù)期，如此19 d 為1 個(gè)DSS 周期。結(jié)腸癌模型的建立一共需要3個(gè)DSS周期，之后正常飼養(yǎng)直至腫瘤成熟，整個(gè)模型周期約4個(gè)月。同期，正常組小鼠對(duì)應(yīng)給予生理鹽水處理。

從腸炎恢復(fù)期Ⅰ期第11 天開(kāi)始，各組給藥。根據(jù)成人臨床用量換算后的動(dòng)物用量，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組分別灌胃含生藥0.56、1.11、1.67 g/kg的益腸散結(jié)顆粒水溶液，每日1次，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束需8周；pcDNA-AIM2組給予一次性腹腔注射10 μg pcDNA-AIM2質(zhì)粒；正常組和模型組小鼠一次性腹腔注射生理鹽水。各組均飲用高壓滅菌水直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 觀察指標(biāo)與方法

1.4.1 小鼠一般狀況 在實(shí)驗(yàn)周期中，觀察各組小鼠飲食、活動(dòng)、精神、毛發(fā)、糞便性狀及生存情況，并繪制各組小鼠生存曲線。

1. 4. 2 小鼠成瘤情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食8 h，用2%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將胸腔和腹腔剖開(kāi)。從盲腸的末端開(kāi)始，逐步分離結(jié)腸和直腸，一直到達(dá)肛門(mén)處。PBS漂洗結(jié)腸，觀察小鼠成瘤情況并計(jì)算腫瘤體積[（最長(zhǎng)徑×垂直短徑2）/2]。

1.4.3 脾指數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后，解剖各組小鼠取脾組織，吸水紙將組織表面的水分吸干，稱(chēng)取質(zhì)量，并計(jì)算脾指數(shù)。脾指數(shù)=脾質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）。

1.4.4 ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IgG、IgM、IL-1β和IL-18 水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食8 h，小鼠麻醉滿(mǎn)意后，抽取腹主動(dòng)脈血，離心取血清。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IgG、IgM 水平和炎癥因子IL-1β和IL-18水平。

1. 4. 5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T 細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+水平 取各組小鼠全血100 μL，置于2 mL 不含肝素的EP 管中，分別加入2 μL 的CD4+抗體和5 μL 的CD3+、CD8+抗體，充分振蕩均勻，在室溫的環(huán)境中避光反應(yīng)15 min。將1.5 mL的紅細(xì)胞裂解液加入到樣品中染色，混勻后，在4 ℃環(huán)境中避光孵育15 min，以離心機(jī)1 000 r/min（離心半徑15 cm）的速度離心5 min。收集并棄掉上清液，用PBS溶液洗滌沉淀1次，后將0.5 mL的PBS稀釋沉淀，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)各組小鼠全血中CD3+、CD4+、CD8+水平，并計(jì)算CD4+/CD8+比值。

1. 4. 6 HE 染色法檢測(cè)結(jié)腸組織病理學(xué)變化 取小鼠結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中，石蠟包埋后切片，經(jīng)酒精脫水，二甲苯中透明。加入蘇木素染色，蒸餾水沖洗后酒精脫水，伊紅染色，于顯微鏡下觀察。

1. 4. 7 16S-rDNA 腸道菌群測(cè)序 收集各組小鼠糞便，使用磁珠法土壤和糞便基因組DNA 提取試劑盒抽提糞便中DNA，電泳質(zhì)檢并定量DNA 定量。加入338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）-806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物，對(duì)16S rRNA 基因擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃、3 min，變性95 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共27 個(gè)循環(huán)。將提取的DNA于-80 ℃環(huán)境保存，將PCR產(chǎn)物構(gòu)建測(cè)定文庫(kù)，用Illumina MiSeq 平臺(tái)測(cè)序并分析數(shù)據(jù)。使用QIIME程序?qū)π蛄羞M(jìn)行生物學(xué)分析，uPares軟件對(duì)有效數(shù)據(jù)在97%水平的操作分類(lèi)單元（OTU）行聚類(lèi)分析。根據(jù)OTU 結(jié)果（包括Observed 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)），以微生物多樣性分析比較組間菌群差異。

1. 4. 8 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)結(jié)腸組織中AIM2、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá) 取結(jié)腸組織，提取總蛋白，用BCA 法檢測(cè)總蛋白濃度。將蛋白溶液的終濃度配制為2 μg/mL，置于熱水中煮沸10 min，后保存在-20 ℃冰箱中。將30 μg的蛋白樣品用200 V 電壓電泳，轉(zhuǎn)移蛋白樣品于PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h。將一抗（1∶500 稀釋?zhuān)┘尤氲絇VDF 膜上，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h。加入ECL 放光液，曝光顯影后用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用Graphpad priam 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。針對(duì)多組間的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，進(jìn)行Log-Rank 檢驗(yàn)比較生存率之間的差異。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較 除正常組外，其余各組小鼠在腸炎Ⅰ期飲用3%DSS 第5 天起腸炎癥狀最為明顯，腹瀉嚴(yán)重且伴有出血，進(jìn)食飲水量減少，毛色暗淡，精神狀態(tài)差，活動(dòng)減少?；謴?fù)6 d 后腸炎癥狀逐漸減輕，10 d 后體質(zhì)量恢復(fù)平穩(wěn)，此時(shí)給藥組開(kāi)始給藥干預(yù)。腸炎Ⅱ、Ⅲ期小鼠癥狀較Ⅰ期癥狀有所減輕，此時(shí)為腸炎慢性期，可見(jiàn)藥物組小鼠的狀態(tài)明顯好于模型組。造模80 d 后小鼠結(jié)腸腫瘤逐漸形成，部分可見(jiàn)肛外瘤。

2.2 各組小鼠生存率及腫瘤體積比較 圖1 結(jié)果顯示：正常組小鼠生存率為100%；與正常組比較，模型組小鼠生存率顯著降低（P＜0.05），生存率為20%（2/10），腫瘤體積顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組小鼠生存率顯著升高（P＜0.05），分別為40%（4/10）、50%（5/10）、90%（9/10），腫瘤體積減少（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性；益腸散結(jié)顆粒高劑量組小鼠生存率[均為90%（9/10）]、腫瘤體積與pcDNA-AIM2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠生存率和腫瘤體積比較Figure 1 Comparison of survival and tumor volume in mice among various groups

2. 3 各組小鼠血清中IgG、IgM、IL-1β 和IL-18水平比較 圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠血清中IgG、IgM水平顯著降低，IL-1β、IL-18水平顯著升高（均P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組小鼠血清中IgG、IgM水平顯著升高，IL-1β、IL-18 水平顯著降低（均P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性；益腸散結(jié)顆粒高劑量組小鼠血清中IgG、IgM、IL-1β 和IL-18 水平與pcDNA-AIM2 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組小鼠血清中IgG、IgM、IL-1β和IL-18水平比較Figure 2 Comparison of serum levels of IgG，IgM，IL-1β，and IL-18 among various groups of mice

2.4 各組小鼠外周血T 細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+水平比較 圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠外周血中CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+比值降低，CD8+水平升高（均P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組小鼠外周血中CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+比值升高，CD8+水平降低（均P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性；益腸散結(jié)顆粒高劑量組小鼠外周血中CD3+、CD4+、CD8+水平及CD4+/CD8+比值與pcDNA-AIM2 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各組小鼠外周血T細(xì)胞CD3+、CD4+、CD8+水平比較Figure 3 Comparison of levels of peripheral blood CD3+，CD4+，CD8+T cells among various groups of mice

2.5 各組小鼠脾指數(shù)比較 圖4 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠脾指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組小鼠脾指數(shù)顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性；益腸散結(jié)顆粒高劑量組小鼠脾指數(shù)與pcDNA-AIM2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組小鼠脾指數(shù)比較Figure 4 Comparison of splenic index among various groups of mice

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化比較 圖5 結(jié)果顯示：正常組小鼠結(jié)腸隱窩排列緊湊整齊，黏膜層和肌層結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠有顯著的隱窩腺瘤，且伴有炎癥浸潤(rùn)，隱窩分支且擴(kuò)張；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒中劑量組、益腸散結(jié)顆粒高劑量組和pcDNA-AIM2 組結(jié)腸組織惡性程度顯著降低，隱窩腔雖有部分?jǐn)U張，但大部分較為完整。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果（×200）Figure 5 HE staining results of mice colon tissue in each group（×200）

2.7 各組小鼠腸道菌群α 多樣性比較 圖6 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠Observed 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組小鼠Observed 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)均升高（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性；益腸散結(jié)顆粒高劑量組小鼠Observed 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)與pcDNA-AIM2 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 各組小鼠腸道菌群α多樣性比較Figure 6 Comparison of the α diversity of the intestinal flora in various groups of mice

2.8 各組小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)比較

2.8.1 門(mén)水平上 圖7-A 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）菌落相對(duì)豐度顯著降低，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、 放線菌門(mén)（Actinobacteria）和Patescibateria 菌落相對(duì)豐度顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)菌落相對(duì)豐度顯著升高，厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和Patescibateria菌落相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05）；益腸散結(jié)顆粒高劑量組腸道菌群菌落相對(duì)豐度與pcDNA-AIM2 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖7 各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)圖Figure 7 Structure of intestinal flora in each group of mice

2.8.2 屬水平上 圖7-B 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組鼠桿菌科（Muribaculaceae）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae-NK4A136group）和瘤胃梭菌屬（Ruminiclostridium）菌落相對(duì)豐度顯著降低，乳桿菌屬（Lactobacillus）、臭桿菌屬（Odoribacter）、別樣桿菌屬（Alistipes）、未培養(yǎng)的瘤胃球菌科（Ruminococcaceaeuncultured）和擬桿菌屬（Bacteroides）菌落相對(duì)豐度顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組桿菌科、毛螺菌屬和瘤胃梭菌屬菌落相對(duì)豐度顯著升高，乳桿菌屬、臭桿菌屬、別樣桿菌屬、未培養(yǎng)的瘤胃球菌科和擬桿菌屬菌落相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05）；益腸散結(jié)顆粒高劑量組腸道菌群菌落相對(duì)豐度與pcDNA-AIM2組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.9 各組小鼠結(jié)腸組織中AIM2、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)比較 圖8結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中AIM2、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，益腸散結(jié)顆粒低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸組織中AIM2、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴(lài)性；益腸散結(jié)顆粒高劑量組小鼠結(jié)腸組織中AIM2、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)與pcDNA-AIM2 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖8 各組小鼠結(jié)腸組織中AIM2、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)比較Figure 8 Comparison of protein expressions of AIM2，ASC，and caspase-1 in the colonic tissues among various groups of mice

3 討論

結(jié)腸癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”“臟毒”“腸積”“鎖肛痔”等病癥范疇，病機(jī)特點(diǎn)為正虛為本，邪實(shí)為標(biāo)。正氣不足，臟腑功能失調(diào)，加之各種致病因素導(dǎo)致痰凝、濕滯、血瘀、熱毒等證候要素出現(xiàn)，使得邪毒內(nèi)侵，長(zhǎng)期閉阻經(jīng)脈，阻礙氣血暢通，精血和津液凝聚，邪毒在腸道內(nèi)瘀結(jié)，最終演變成為腸癌[10]。故結(jié)腸癌以正氣不足、脾腎功能失調(diào)為根本病機(jī)，同時(shí)發(fā)生濕熱、瘀毒等證候要素相互結(jié)合[11]。侯?lèi)?ài)畫(huà)教授認(rèn)為，治療結(jié)腸癌應(yīng)以中西醫(yī)結(jié)合的方式，二者取長(zhǎng)補(bǔ)短，使臨床療效最大化，創(chuàng)立了中藥復(fù)方益腸散結(jié)方。全方注重扶正驅(qū)邪，共奏補(bǔ)脾燥濕、散結(jié)軟堅(jiān)的功效。本研究采用AOM 和DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸癌小鼠模型，結(jié)果顯示，模型組小鼠生存率和腫瘤體積顯著增加，不同劑量的益腸散結(jié)顆粒均可抑制小鼠生存率和腫瘤體積，提示益腸散結(jié)顆粒對(duì)結(jié)腸癌小鼠有較好的療效。

細(xì)胞免疫系統(tǒng)在機(jī)體免疫對(duì)抗腫瘤中扮演主要角色，而作為細(xì)胞免疫最重要的T淋巴細(xì)胞，則通過(guò)功能各異的T淋巴細(xì)胞亞群來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。其中，CD3+細(xì)胞分布在每個(gè)T淋巴細(xì)胞中，代表T淋巴細(xì)胞的總數(shù)，還可以作為鑒別T淋巴細(xì)胞的指標(biāo)。CD4+細(xì)胞主要是輔助體液免疫和細(xì)胞免疫，若CD4+細(xì)胞的表達(dá)水平降低，會(huì)通過(guò)降低免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)作用降低機(jī)體抗腫瘤的能力[12]。CD8+細(xì)胞是一種抑制性T淋巴細(xì)胞，可抑制自身抗體生成負(fù)性調(diào)控免疫反應(yīng)[13]。當(dāng)CD4+/CD8+比值較低時(shí)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)的功能會(huì)受到影響，對(duì)外界病原微生物和突變細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力會(huì)降低，從而為腫瘤的迅速生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及繼發(fā)感染等病理過(guò)程創(chuàng)造了條件[14]。本研究結(jié)果顯示，益腸散結(jié)顆?？稍黾咏Y(jié)腸癌小鼠外周血中CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+比值，降低CD8+水平，提示益腸散結(jié)顆?？稍鰪?qiáng)結(jié)腸癌小鼠機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體識(shí)別殺傷突變細(xì)胞的能力。

免疫球蛋白是機(jī)體免疫防御機(jī)制的重要組成部分，能識(shí)別并消滅外來(lái)病原體和異常細(xì)胞。當(dāng)B淋巴細(xì)胞接觸到外來(lái)的病原體時(shí)，就會(huì)開(kāi)始分泌免疫球蛋白，包括IgA、IgG、IgM等。這些抗體可以識(shí)別與病原體相關(guān)的物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)合與破壞，從而發(fā)揮體液免疫的作用[15]。其中，IgG 是血液中主要的免疫球蛋白，可以激活補(bǔ)體和促進(jìn)吞噬功能，在機(jī)體再次遭受同樣病原體攻擊時(shí)，扮演著關(guān)鍵的角色[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益腸散結(jié)顆粒能夠增加結(jié)腸癌模型小鼠血清中IgG和IgM的含量，表明益腸散結(jié)顆粒有助于提高結(jié)腸癌小鼠自身的體液免疫能力，從而能更好地對(duì)抗結(jié)腸癌的侵襲。

脾指數(shù)是指脾臟大小在體內(nèi)所占比例，可評(píng)估機(jī)體的免疫防御和造血功能[16]。本研究結(jié)果顯示，益腸散結(jié)顆粒可抑制結(jié)腸癌小鼠脾指數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)益腸散結(jié)顆粒可增加結(jié)腸癌小鼠自身免疫力。

腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，在腸道結(jié)構(gòu)、免疫及代謝作用中起重要作用，通過(guò)其代謝物參與碳水化合物和蛋白的水解發(fā)酵，影響腸上皮細(xì)胞增殖和分化[17]。腸道菌群微生物組成的改變有利于致癌細(xì)菌的滋生，影響結(jié)腸癌的相關(guān)微環(huán)境。α多樣性反應(yīng)的是單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，其中，Observed和Chao1指數(shù)越高代表菌群豐度越高，Shannon 值越大代表菌群多樣性越高。謝輝等[18]研究證實(shí)，可通過(guò)增加小鼠腸道菌群豐度及多樣性抑制結(jié)腸癌的發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，益腸散結(jié)顆?？稍黾幽c道菌群豐度和多樣性，且能抑制厚壁菌門(mén)、放線菌門(mén)和Patescibateria菌落及乳桿菌屬、臭桿菌屬、別樣桿菌屬、未培養(yǎng)的瘤胃球菌科和擬桿菌屬菌落相對(duì)豐度，糾正腸道菌群紊亂，通過(guò)調(diào)節(jié)菌群而抑制腸癌的發(fā)展。

AIM2 是一種細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體，能夠激活炎癥小體的形成[19]。炎癥小體由3 種蛋白質(zhì)組成，包括感受器、接頭蛋白ASC 和效應(yīng)分子caspase 前體。炎癥小體的主要作用是激活caspase-1，將IL-1β、IL-18 等細(xì)胞因子的前體切割為成熟的細(xì)胞因子，從而發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用。炎癥小體是炎癥反應(yīng)關(guān)鍵的組成部分，其失調(diào)與多種慢性炎癥、感染和自身免疫性疾病密切相關(guān)[20]。Zhu等[21]研究證實(shí)，結(jié)腸癌易敏感的AIM2-/-小鼠因腸道微生物群失調(diào)而加重，但與健康小鼠腸道微生物群的交換改善了結(jié)腸癌易感性。因此推測(cè)，AIM2在結(jié)腸癌中起著保護(hù)作用，其可能通過(guò)炎癥小體獨(dú)立的方式發(fā)揮功能，控制腸道干細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)腸道微生物群。本研究結(jié)果顯示，益腸散結(jié)顆?？稍黾咏Y(jié)腸癌小鼠腸道組織中AIM2、ASC 和caspase-1 蛋白表達(dá)，抑制血清中IL-1β、IL-18 水平，提示益腸散結(jié)顆?？赡芡ㄟ^(guò)促進(jìn)結(jié)腸癌AIM2炎性小體的激活，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，增加自身免疫力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本結(jié)果，本研究采用過(guò)表達(dá)AIM2質(zhì)粒和高劑量益腸散結(jié)顆粒聯(lián)合干預(yù)結(jié)腸癌小鼠，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)AIM2和高劑量益腸散結(jié)顆粒具有相似的作用，均能激活A(yù)IM2 信號(hào)，增強(qiáng)自身免疫力，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)。

綜上所述，益腸散結(jié)顆?？稍鰪?qiáng)結(jié)腸癌小鼠自身免疫力，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，其作用機(jī)制可能與激活A(yù)IM2炎性小體有關(guān)。由于時(shí)間和成本等因素，本研究尚未對(duì)AIM2炎性小體對(duì)益腸散結(jié)顆粒改善結(jié)腸癌小鼠腸道菌群的影響進(jìn)行驗(yàn)證，使本研究結(jié)果存在一定局限性，在今后的研究中會(huì)完善相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，為臨床治療結(jié)腸癌提供更多真實(shí)有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。