基于下丘腦瘦素受體介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路探討穴位埋線治療食源性肥胖大鼠的中樞機(jī)制

張榮， 伍先明， 楊碩， 莫倩

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州貴陽(yáng) 550003）

肥胖是心腦血管等疾病的高危因素，我國(guó)肥胖發(fā)生率逐年升高[1]。肥胖防治問(wèn)題亟需解決。機(jī)體能量代謝紊亂是導(dǎo)致肥胖發(fā)生的重要原因。下丘腦是調(diào)控機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)的重要高級(jí)中樞[2]，而瘦素（leptin）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的關(guān)鍵上游因子，主要通過(guò)下丘腦長(zhǎng)型瘦素受體（LepR）介導(dǎo)的Janus激酶2（JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）通路傳遞能量代謝信號(hào)[3]。穴位埋線減肥在臨床上已被證實(shí)是一項(xiàng)安全有效的方法[4]。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，以中脘、水道、天樞、脾俞、胃俞、三焦俞等穴組方，穴位埋線治療肥胖癥臨床療效顯著[5-6]，其機(jī)制可能與調(diào)控血清瘦素的表達(dá)從而良性調(diào)節(jié)外周脂肪代謝有關(guān)[7-8]，但是否同時(shí)影響中樞有待于進(jìn)一步研究。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究以下丘腦LepR介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路為切入點(diǎn)，觀察該通路在正常狀態(tài)下及被特異性阻斷劑AG490 阻斷時(shí)，穴位埋線對(duì)食源性肥胖（diet-induced obesity，DIO）大鼠減重降脂效用變化，初步探討穴位埋線治療肥胖癥的中樞機(jī)制，以期為臨床治療本病提供科學(xué)佐證，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只，1 月齡，體質(zhì)量120～140 g，購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2017-0002，飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，光照12 h 晝夜交替，室溫（23±2）℃，濕度（40±5）%。本研究獲得貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2015088）。動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[9]。

1.2 試劑與儀器 AG490（美國(guó)MCE公司）；甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）生化檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；瘦素檢測(cè)試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；RNA 提取及純化試劑盒（德國(guó)Qiagen 公司）；RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒（日本TaKaRa公司）；LepR兔多抗、JAK2 兔單抗、STAT3兔單抗（美國(guó)Abcam公司）；β-actin抗體、羊抗兔IgG二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。7號(hào)一次性埋線針（蘇州市吳中區(qū)東方針灸器械廠）；3-0號(hào)羊腸線（上海信成醫(yī)療器械有限公司）；凝膠掃描成像系統(tǒng)、CFX96熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；酶標(biāo)儀、核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1. 3 模型制備與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用隨機(jī)抽樣的方法選取10 只作為正常組，給予普通飼料飼養(yǎng)。剩余30 只大鼠給予高脂飼料（配方：普通飼料60%，豬油12%，雞蛋10%，花生、奶粉、蔗糖各5%，食鹽2%，麻油1%，由北京科澳協(xié)力有限公司配制）飼養(yǎng)25 周建立DIO 模型[10-11]，自由攝食、飲水。25周后體質(zhì)量高于正常組平均體質(zhì)量20%及以上的示為造模成功[12]。將DIO 造模成功后的大鼠隨機(jī)分為模型組、埋線組、埋線+AG490組，每組10只。

1. 4 干預(yù)方法 埋線組、埋線+AG490 組在造模成功后第1、8、15、22 天進(jìn)行埋線治療，操作方法：參照文獻(xiàn)研究[13-16]選取中脘、水道、天樞、脾俞、胃俞、三焦俞等穴位，自制固定架固定大鼠，穴區(qū)皮膚備皮，將0.5~0.6 mm 的3-0 號(hào)羊腸線用7 號(hào)一次性埋線針埋入上述穴位的脂肪層[7]，共治療4 次。埋線+AG490 組埋線期間每天腹腔注射AG490（1 mg/kg）[17]。正常組和模型組僅抓取固定。干預(yù)期間，各組均用普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 樣本采集 治療結(jié)束后大鼠禁食過(guò)夜，腹主動(dòng)脈取血，離心后將上清液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌EP 管中，-80 ℃冰箱冷凍保存。處死大鼠后迅速取下丘腦組織分裝至無(wú)酶EP 管，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 血清生化指標(biāo)及瘦素檢測(cè) 采用ELISA 方法檢測(cè)各組血清TG、TC、LDL-C、HDL-C及瘦素水平，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1. 5. 3 Western Blot 法檢測(cè)下丘腦LepR、JAK2、STAT3蛋白表達(dá) 提取下丘腦總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白的分子量配制相應(yīng)濃度的分離膠和濃縮膠，以β-actin 為內(nèi)參，采用十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）（恒壓60 V 持續(xù)1 h，120 V 持續(xù)30 ~40 min），濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（恒流，250 mA，約3 h），封閉，TBST 洗膜。分別加入一抗（LepR 1∶1 500，JAK2 1∶5 000，STAT3 1∶2 000，β-actin 1∶5 000），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜，加入羊抗兔IgG 二抗（稀釋比例為1∶10 000）孵育1.5 h。TBST洗膜后再加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）顯影劑，放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)曝光，并保存圖片。用Image Lab Software 5.2分析條帶，計(jì)算灰度值。

1.5.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)下丘腦中LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá) 提取下丘腦總RNA 并檢測(cè)其濃度及純度。逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。按PCR 擴(kuò)增試劑盒配制反應(yīng)液進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃、30 s；變性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，擴(kuò)增39 個(gè)循環(huán)；變性95 ℃、10 s，延伸65 ℃、5 s，酶瞬間滅活97 ℃、5 s。以GAPDH 為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1. 6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。如果方差齊，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；如果方差不齊，兩兩比較則采用Tamhane’s T2 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較 圖1 結(jié)果顯示：干預(yù)前，與正常組比較，模型組、埋線組、埋線+AG490組大鼠體質(zhì)量均升高（P＜0.01），提示DIO 造模成功；與模型組比較，埋線組、埋線+AG490 組體質(zhì)量無(wú)顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。干預(yù)后，與模型組比較，埋線組體質(zhì)量降低（P＜0.01）；與埋線+AG490組比較，埋線組體質(zhì)量降低（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較Figure 1 Comparison of body mass among various groups of rats before and after intervention

2. 2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C含量比較 圖2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組TG、TC、LDL-C 含量均升高（P＜0.05），HDL-C無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與模型組比較，埋線組TG、TC、LDL-C 含量降低（P＜0.05），HDL-C 無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；與埋線+AG490組比較，埋線組TG、TC、LDL-C含量降低（P＜0.05），HDL-C無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比較Figure 2 Comparison of serum TG，TC，LDL-C，HDL-C levels among various groups of rats

2.3 各組大鼠血清瘦素比較 圖3 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組瘦素水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，埋線組瘦素水平降低（P＜0.01）；與埋線+AG490 組比較，埋線組瘦素水平降低（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠血清瘦素水平比較Figure 3 Comparison of serum leptin level among various groups of rats

2. 4 各組大鼠下丘腦組織LepR、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較 圖4結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，埋線組LepR、JAK2、STAT3 mRNA 表達(dá)量均升高（P＜0.01）；與埋線+AG490 組比較，埋線組LepR、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)量均升高（P＜0.01）。

圖4 各組大鼠下丘腦組織中的LepR、JAK2、STAT3 mRNA表達(dá)水平比較Figure 4 Comparison of mRNA expression levels of LepR，JAK2 and STAT3 in hypothalamus tissue among various groups of rats

2. 5 各組大鼠下丘腦組織LepR、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平比較 圖5 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組LepR、JAK2、STAT3 蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.01）；與模型組比較，埋線組LepR、JAK2、STAT3 蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.01）；與埋線+AG490組比較，埋線組LepR、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.01）。

圖5 各組大鼠下丘腦組織中的LepR、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)水平比較Figure 5 Comparison of protein expression levels of LepR，JAK2 and STAT3 in hypothalamus tissue among various groups of rats

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肥胖多與飲食不節(jié)、勞逸失調(diào)等因素有關(guān)，基本病機(jī)為脾胃虛衰，運(yùn)化功能失常，痰濕聚集，壅滯臟腑經(jīng)絡(luò)[18]，病位主要在脾胃，故肥胖治療多以調(diào)脾胃、祛痰濕為主。本團(tuán)隊(duì)前期臨床研究[5-6]顯示，穴位埋線治療肥胖癥臨床療效顯著，且基礎(chǔ)研究[7-8]結(jié)果顯示，在降低肥胖大鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)以及調(diào)節(jié)外周脂質(zhì)代謝方面，脂肪層埋線效果優(yōu)于肌肉層埋線。因此，本研究采用脂肪層穴位埋線的方法，選取脾胃經(jīng)之背俞穴脾俞、胃俞以健脾和胃，胃、大腸經(jīng)之募穴中脘、天樞以和胃氣，調(diào)節(jié)胃腸，配合水道、三焦俞以疏利三焦、通調(diào)水道，達(dá)健脾胃、祛痰濕、利水道之功。結(jié)果顯示，脂肪層穴位埋線可顯著降低食源性肥胖（DIO）大鼠的體質(zhì)量，下調(diào)血清TG、TC、LDL-C水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

目前肥胖動(dòng)物多以飲食誘導(dǎo)為主[19]，故本研究以高脂飲食誘導(dǎo)建立DIO 模型，以體質(zhì)量超過(guò)同期普通飼料飼養(yǎng)大鼠的20%為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[12]。

肥胖的發(fā)生是遺傳、社會(huì)環(huán)境等因素共同作用的結(jié)果。下丘腦是機(jī)體調(diào)控能量平衡和代謝的高級(jí)中樞，是導(dǎo)致肥胖患者脂肪組織聚集的關(guān)鍵區(qū)域，同時(shí)也是瘦素發(fā)揮作用的主要靶器官[20]。瘦素是防治肥胖的重要靶點(diǎn)，具有減少能量攝入、促進(jìn)能量消耗、抑制脂肪合成并促進(jìn)其分解的生理功能，同時(shí)作為“信使”，向中樞神經(jīng)系統(tǒng)反映機(jī)體能量?jī)?chǔ)存情況[21]。既往臨床研究[22]顯示，肥胖患者血清瘦素水平偏高，但不能抑制食欲，提示機(jī)體對(duì)瘦素的代謝性調(diào)節(jié)作用敏感性降低，這種現(xiàn)象稱為“瘦素抵抗”。出現(xiàn)“瘦素抵抗”的原因錯(cuò)綜復(fù)雜，JAK2/STAT3 通道活性降低是導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)“瘦素抵抗”重要原因之一[23]。下丘腦LepR介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路是目前已知的瘦素發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝的主要信號(hào)通路，瘦素正常生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮與JAK2/STAT3 通路活性呈正相關(guān)。瘦素經(jīng)血液循環(huán)穿過(guò)血腦屏障到達(dá)下丘腦，與長(zhǎng)型LepR 結(jié)合后通過(guò)激活JAK2，使LepR 上的酪氨酸殘基磷酸化，被磷酸化的酪氨酸殘基通過(guò)特異性的招募結(jié)合使STAT3活化并形成二聚體，STAT3二聚體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮瘦素作用[24]。

本研究結(jié)果顯示：穴位埋線后，DIO大鼠體質(zhì)量，瘦素，TG、TC、LDL-C 水平降低，LepR、JAK2、STAT3 mRNA 和蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明穴位埋線能夠激活LepR 介導(dǎo)的JAK2/STAT3 通路，糾正瘦素抵抗。AG490 可通過(guò)與受體酪氨酸酶競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)特異性阻斷JAK2/STAT3 通路[25]。穴位埋線的同時(shí)腹腔注射AG490，DIO大鼠各項(xiàng)指標(biāo)與模型組相當(dāng)，基本上抵消了穴位埋線的治療效應(yīng)。這一結(jié)果雙重證明：下丘腦LepR 介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路參與了穴位埋線降低DIO大鼠體質(zhì)量的調(diào)節(jié)過(guò)程。

綜上所述，穴位埋線對(duì)DIO 大鼠具有良好的減重降脂作用，其中樞作用機(jī)制可能與下調(diào)血清瘦素水平，激活下丘腦LepR 介導(dǎo)的JAK2/STAT3通路有關(guān)。本研究為臨床上采用穴位埋線治療肥胖癥提供了一定的科學(xué)依據(jù)，但也存在一些不足，如雖采用公認(rèn)的飲食誘導(dǎo)建立DIO 模型，但造模成功的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)較為單一，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，且觀察指標(biāo)中未納入下丘腦相關(guān)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析。研究中還發(fā)現(xiàn)，抑制JAK2/STAT3通路后，LepR、JAK2 mRNA水平也有所改善，推測(cè)穴位埋線可能同時(shí)通過(guò)其他中樞或外周途徑調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝，今后有待采用光遺傳等先進(jìn)科學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。