注射用奈達(dá)鉑的血管刺激性、溶血性和過敏性試驗(yàn)研究

余 慶，楊文祥*，吳 琳

（1.應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430079；2.湖北省疾病預(yù)防控制中心，湖北武漢 430079）

0 引言

奈達(dá)鉑又名順式-乙醇酸-二氨合鉑，是一種廣譜的抗腫瘤藥。奈達(dá)鉑適用于頭頸部癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、食管癌、膀胱癌、睪丸腫瘤、卵巢癌、宮頸癌等。奈達(dá)鉑在臨床上作為第三代鉑類抗腫瘤藥，具有水溶性好、毒副作用較小等優(yōu)勢(shì)，常用于臨床抗腫瘤化療[1-4]。本試驗(yàn)按照《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]的要求，對(duì)仿制藥注射用奈達(dá)鉑的安全性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為臨床安全用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

受試制劑：注射用奈達(dá)鉑（規(guī)格：50 mg/支，批號(hào)：202104S1，某藥業(yè)股份有限公司）；參比制劑：注射用奈達(dá)鉑（Aqulpa）（規(guī)格：50 mg/支，批號(hào)：HT0100，吉林恒金藥業(yè)股份有限公司）；溶媒：0.9%氯化鈉注射液（規(guī)格：100 ml：0.9 g，批號(hào)：210507521，武漢福星生物藥業(yè)有限公司）；雞蛋清白蛋白（規(guī)格：25 g/瓶，批號(hào)：KA0418BY14，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Hartley豚鼠，普通級(jí)，雌雄各半，體重范圍303～387 g，由湖北逸摯誠(chéng)生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2021-0020。日本大耳白兔，普通級(jí)，雌雄各半，體重范圍2.1～2.7 kg，由湖北逸摯誠(chéng)生物科技有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（鄂）2021-0020。

1.3 飼養(yǎng)管理?xiàng)l件

豚鼠飼養(yǎng)于本單位普通級(jí)豚鼠實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（鄂）2017-0065。日本大耳白兔飼養(yǎng)于本單位普通級(jí)家兔實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK（鄂）2017-0065。豚鼠和日本大耳白兔實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度控制范圍均在40%～70%，溫度控制范圍在18℃～28℃。飼養(yǎng)室每h換氣次數(shù)8次以上，12 h明/12 h暗循環(huán)交替至動(dòng)物飼養(yǎng)結(jié)束。每天喂全價(jià)顆粒飼料（武漢市萬千佳興生物科技有限公司），自由飲用自來水。

1.4 耳緣靜脈血管刺激性試驗(yàn)

選取日本大耳白兔1 2 只，隨機(jī)分為受試低劑量組、高劑量組，參比制劑組，每組4只，雌雄各半。注射用奈達(dá)鉑推薦的臨床給藥劑量最大值為100 mg/m2，成人體重按70 kg計(jì)算，按體表面積公式lgS=0.8762+0.698 lgW[6]，受試制劑低劑量換算成日本大耳白兔給藥劑量為2.6 mg/kg，臨床最大給藥濃度約為0.61 mg/ml，受試制劑高劑量組按照2倍臨床給藥濃度給藥，即1.22 mg/ml，給藥劑量為5.2 mg/kg。參比制劑組給予注射用奈達(dá)鉑（Aqulpa）溶液，劑量同受試制劑低劑量組。采用自身對(duì)照，右耳緣靜脈注射注射用奈達(dá)鉑溶液，給藥容積為4.3 ml/kg，左耳緣靜脈注射等容積0.9%氯化鈉注射液，靜脈注射速度為20滴/min，給藥1次。給藥前、給藥時(shí)、給藥后1～2 h和24 h、48 h、72 h、96 h分別對(duì)動(dòng)物和注射部位進(jìn)行肉眼觀察。給藥后96 h每組安樂死2只日本大耳白兔，雌雄各1只，剪取雙側(cè)兔耳，用4%甲醛溶液固定后，剪取耳緣靜脈進(jìn)針點(diǎn)即A點(diǎn)，進(jìn)針點(diǎn)靠近近心端方向約3.5 cm處，即B點(diǎn)，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，余下動(dòng)物繼續(xù)觀察到14天，剪取雙側(cè)兔耳作病理檢查，觀察注射部位兔耳緣靜脈血管擴(kuò)張充血、血栓形成、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等改變[6]。

1.5 體外溶血試驗(yàn)

日本大耳白兔紅細(xì)胞制備：取20 ml日本大耳白兔心臟血，放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10 min，制備成脫纖血液。隨后加入約10倍量的0.9%氯化鈉注射液搖勻，1 500 r/min離心15 min，除去上清液，再用0.9%氯化鈉注射液洗滌4次沉淀的紅細(xì)胞，至上清液不顯紅色終止洗滌，取紅細(xì)胞1 ml加入49 ml0.9%氯化鈉注射液，配成2%紅細(xì)胞懸液。操作步驟：取12支試管進(jìn)行編號(hào)，1～5號(hào)管為受試制劑管，6～10號(hào)管為參比制劑管，11號(hào)管為陰性對(duì)照管，12號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照管。按照表1依次加入2%紅細(xì)胞懸液、0.9%氯化鈉注射液或蒸餾水，混勻后立即放置在37℃±0.5℃的恒溫箱中進(jìn)行溫育，開始每隔15 min觀察1次；1 h后，每隔1 h觀察1次，觀察3 h。

表1 注射用奈達(dá)鉑體外溶血試驗(yàn)各個(gè)試管各溶液的加入量

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：溶液呈澄明紅色，管底無細(xì)胞殘留，可判定為全溶血；紅細(xì)胞全部下沉，上清液體無色澄明，可判定為無溶血。雖不溶血，但出現(xiàn)棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，振蕩后不分散，或顯微鏡下觀察凝聚紅細(xì)胞不能被生理鹽水沖散，可判定為凝聚[7]。

1.6 豚鼠主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)

普通級(jí)豚鼠40只，隨機(jī)分成5組，每組8只，雌雄各半，即受試制劑低劑量組（給藥濃度為0.61 mg/ml）和高劑量組（給藥濃度為1.22 mg/ml）、參比制劑組（劑量同受試制劑低劑量組）、陰性對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射液）和陽(yáng)性對(duì)照組（雞蛋清白蛋白）。隔日腹腔注射致敏，共3次，致敏給藥量0.5 ml/只，陽(yáng)性對(duì)照組為0.5 mg/只。末次致敏后14天，每組雌雄各取前2只經(jīng)靜脈注射進(jìn)行激發(fā)，激發(fā)給藥量為1.0 ml/只，陽(yáng)性對(duì)照組為1.0 mg/只。末次致敏后21天，剩余動(dòng)物，再激發(fā)。

觀察各組動(dòng)物靜脈注射后30 min內(nèi)的反應(yīng)及相關(guān)癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間，最長(zhǎng)觀察3 h，致敏期間每日觀察動(dòng)物的癥狀，首末次致敏和激發(fā)當(dāng)日測(cè)定動(dòng)物體質(zhì)量。按全身致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)（見表2），并計(jì)算過敏反應(yīng)發(fā)生率。若表現(xiàn)出陽(yáng)性反應(yīng)癥狀，可另取健康未致敏豚鼠2只，注射相同溶液，觀察是否出現(xiàn)相同癥狀，綜合考慮進(jìn)行評(píng)價(jià)[8]。

表2 過敏反應(yīng)癥狀及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 耳靜脈血管刺激性試驗(yàn)

整個(gè)試驗(yàn)過程中，各組試驗(yàn)動(dòng)物未見明顯異常；受試制劑組和參比制劑組兔左耳、右耳給藥前，給藥時(shí)及給藥后的各個(gè)觀察點(diǎn)均未觀察到明顯的耳緣靜脈充血、耳緣紅腫等反應(yīng)。觀察14天后也未見明顯異常反應(yīng)。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，注射給藥后96 h處死，在針頭經(jīng)過的試驗(yàn)兔耳靜脈的A點(diǎn)主要表現(xiàn)出輕度到中度的血管擴(kuò)張淤血、少量血栓形成等病理變化；而在注射針頭未到達(dá)的B點(diǎn)，受試制劑高劑量組3只和參比制劑組2只動(dòng)物主要表現(xiàn)為血管輕度擴(kuò)張淤血，其他試驗(yàn)兔靜脈未觀察到明顯異常，表明受試制劑注射用奈達(dá)鉑未表現(xiàn)出明顯刺激性反應(yīng)。注射后觀察14天，在針頭經(jīng)過的試驗(yàn)兔耳靜脈的A點(diǎn)主要表現(xiàn)為輕度的血管擴(kuò)張淤血、少量血栓形成；而在注射針頭未到達(dá)的部位B點(diǎn)，受試制劑高劑量組1只日本大耳白兔可見血管中度擴(kuò)張淤血，其他試驗(yàn)兔耳靜脈未表現(xiàn)出明顯異常，表明受試制劑注射用奈達(dá)鉑無明顯血管刺激性反應(yīng)。

2.2 體外溶血試驗(yàn)

受制試劑、參比制劑及陰性對(duì)照管在各時(shí)間點(diǎn)均無溶血，無紅細(xì)胞凝聚發(fā)生；陽(yáng)性對(duì)照管15 min時(shí)出現(xiàn)溶血。表明受試制劑注射用奈達(dá)鉑體外溶血試驗(yàn)對(duì)日本大耳白兔紅細(xì)胞未見溶血和紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。

2.3 豚鼠主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)

各組動(dòng)物體重及凈增重比較，采用單因素方差分析，結(jié)果顯示，各組雌雄豚鼠體質(zhì)量均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異（P＞0.05）。

受試制劑、參比制劑及陰性對(duì)照組均未見過敏反應(yīng)癥狀，致敏率為0。雞蛋清白蛋白陽(yáng)性對(duì)照組，激發(fā)后8只動(dòng)物，產(chǎn)生過敏反應(yīng)，全部死亡，致敏率達(dá)100%。表明受試制劑注射用奈達(dá)鉑未引起豚鼠主動(dòng)全身過敏反應(yīng)。

3 結(jié)論

奈達(dá)鉑是一種第二代鉑衍生物，其腎臟和胃腸道毒性比順鉑低。在臨床上，奈達(dá)鉑導(dǎo)致的過敏反應(yīng)主要發(fā)生在用藥24 h內(nèi)，主要累及血液系統(tǒng)，臨床上主要表現(xiàn)為白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板和血紅蛋白減少，其中血小板減少最常見。近年來，臨床上有過敏性休克發(fā)生的報(bào)道。其他常見的不良反應(yīng)包括骨髓抑制、惡心、嘔吐、食欲減退等[9-10]。惡性腫瘤患者化療后常表現(xiàn)出骨髓抑制的不良反應(yīng)，骨髓抑制的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)會(huì)隨著藥物的積累而增加，因而奈達(dá)鉑骨髓抑制的不良反應(yīng)具有劑量限制性毒性的特點(diǎn)[11-12]。

本次研究結(jié)果表明，注射用奈達(dá)鉑在日本大耳白兔血管刺激性試驗(yàn)中未觀察到明顯刺激性反應(yīng)，體外溶血試驗(yàn)結(jié)果為陰性，豚鼠主動(dòng)全身過敏試驗(yàn)未見陽(yáng)性反應(yīng)。本研究中，注射用奈達(dá)鉑無血管刺激性、溶血作用以及過敏性，表現(xiàn)出較好的安全性，但臨床上有過敏、消化道刺激等不良反應(yīng)的報(bào)道且骨髓抑制為劑量限制性毒性，提示動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果直接應(yīng)用到人類過程的具有不確定性，需要我們?cè)趧?dòng)物模型和研究方法等方面進(jìn)行不斷的改進(jìn)和完善，進(jìn)而提高動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用到臨床時(shí)的準(zhǔn)確性。