驢消化道3種線蟲的掃描電鏡觀察及其系統發育分析

菅 蕊,張文娜,張東紅,解立斌,宋素潔,馮笑顏,劇慧棟,4

(1.承德醫學院基礎醫學院,河北 承德 067000;2. 石家莊學院化工學院,河北 石家莊 050000;3. 河北資源環境職業技術學院,河北 石家莊 050000;4.河北省疑難細菌研究重點實驗室,河北 石家莊 050000)

驢消化道寄生蟲主要以圓線科線蟲(Strongylidae Baird,1853)為主,嚴重威脅宿主的生命和健康,不同種類的線蟲對宿主的致病機制有所不同,因此,準確迅速地識別寄生線蟲可以有效地降低其對宿主的危害[1-2]。圓線科線蟲在體前端的結構,尤其是頭部乳突、口囊、內葉冠和外葉冠等結構,以及雄蟲尾部生殖錐的形態是重要的形態學分類依據,掃描電子顯微鏡可以更準確地對驢寄生線蟲的形態特征進行觀察和描述[3-5]。

本試驗首次對采自我國新疆維吾爾自治區的驢消化道內的馬圓形線蟲、無齒圓形線蟲和杯狀彼得洛夫線蟲的體表形態進行詳細的觀察和描述,為上述3種線蟲的分類鑒定提供更精確的形態學依據,并在形態學鑒定的基礎上,基于線蟲核糖體DNA內轉錄間隔區(Internal transcribed spacer,ITS)基因對其進行系統發育分析,建立系統發育樹,結果表明,馬圓形線蟲、無齒圓形線蟲和杯狀彼得洛夫線蟲依據形態學鑒定結果與系統發育樹中該種的分類學地位一致。

1 材料與方法

1.1 主要材料 馬圓形線蟲、無齒圓形線蟲和杯狀彼得洛夫線蟲,采自我國新疆維吾爾自治區驢(Equusasinus)的腸道內容物,用80 ℃左右的熱水將蟲體燙直,將線蟲保存于70%酒精中并記錄宿主種名、寄生部位、采集時間和地點,利用光學顯微鏡觀察蟲體,通過形態學特征確定其種類分別是馬圓形線蟲、無齒圓形線蟲和杯狀彼得洛夫線蟲。透明液(乳酸∶苯酚∶蒸餾水∶甘油=1∶1∶1∶2),河北師范大學生命科學學院動物系統學與分子進化實驗室配制;DNA提取試劑盒,購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR試劑盒和蛋白酶K,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 掃描電子顯微鏡(HITACHI S-4800),日立公司產品;光學顯微鏡(Nikon E200MV),尼康公司產品。

1.3 線蟲掃描電子顯微鏡樣品的制備和觀察 取保存于70%酒精溶液中的線蟲標本用0.1 mol/L 的磷酸鹽溶液清洗3次,每次15 min;使用戊二醛(濃度2.5%)溶液固定3 h;使用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;鋨酸(濃度1%)溶液固定1 h;再用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次,每次15 min;再進行脫水,用乙醇作為脫水劑,按照70%、80%、90%和100%的梯度進行2次脫水,每次脫水時間為20 min;將脫水的樣品放入醋酸異戊酯中30 min。使用臨界點干燥法進行干燥:(1)樣品室預冷(注入液氮)→(2)樣品放入樣品室→(3)注入液態二氧化碳(樣品室體積的70%)→(4)用二氧化碳置換樣品中的醋酸異戊酯(溫度調到20 ℃,壓力應達到50～70 kg/cm2,保持20 min)→(5)臨界處理,溫度提高到40 ℃,壓力應達到80～100 kg/cm2,保持5 min→(6)放氣,速度在100～500 mL/min→(7)當壓力低于30 kg/cm2時,切斷加熱器→(8)壓力為0時,取出樣品,用雙面膠或導電膠將樣品固定在專用的樣品臺上,進行噴金,掃描電子顯微鏡觀察并拍照[6]。標本保存于河北師范大學生命科學學院。

1.4 線蟲ITS基因的PCR擴增和序列分析 從70%酒精中分別取出每種線蟲的1條雌蟲,分別置于不同的1.5 mL離心管內做好標記,用蒸餾水漂洗3～5次,按照DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA,分成兩段擴增ITS目的片段,之后再進行拼接。2對引物分別為NC5、NC1R和NC13、NC2[7-9],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其核酸序列分別為:NC5(5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′)(forward);NC1R(5′-AACAACCCTGAACCAGACGT-3′) (reverse);NC13(5′-ATCGATGAAGAACGCAGC-3′) (forward);NC2(5′-TTAGTT-TCTTTTCCTCCGCT-3′) (reverse)。預期PCR擴增片段每段長度約為500 bp,拼接后約為1 000 bp。

PCR 反應總體系(50 μL):DNA模板5 μL,上、下游引物各1 μL,2×TaqMasterMix 25 μL,ddH2O 18 μL。PCR擴增程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,35個循環;72 ℃ 10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測。陽性PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結果進行人工校對拼接,并在GenBank上進行BLAST比對分析。使用BioPerl 5.8軟件對本試驗測序結果與GenBank中圓線科線蟲的ITS序列(共11條)進行同源性分析。為了分析上述3種線蟲的分類學地位,分別用最大似然法(Maximum likelihood method)和貝葉斯法(Bayesian method),將Oesophagostomumdentatum(AJ619979)設置為外群,構建系統發育樹探討線蟲間的親緣關系[10],只標注支持度>50%(重復1 000次)。

2 結果

2.1 掃描電子顯微鏡觀察

2.1.1 馬圓形線蟲[Strongylusequinus(Mueller,1780)]

采集地點:中國新疆維吾爾自治區

宿主:驢(Equusasinus)

雄蟲和雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。光學顯微鏡觀察發現,蟲體兩端稍細,口領高0.22 mm(0.21～0.23 mm),寬0.7 mm(0.6～0.8 mm)。口囊呈橢圓形,深0.8 mm(0.6～0.9 mm),寬0.7 mm(0.6～0.8 mm)。在口囊基部有4個突出的齒,2個位于亞腹面,2 個位于亞背面。亞腹齒分開;亞背齒不分開,較粗大,并高于亞腹齒。背溝長。中部粗壯,紅褐色,體表具角質橫紋。掃描電子顯微鏡觀察發現,排泄孔位于口囊前1/3處(圖1 A和1 B),頸乳突1對,小刺狀,位于體側,長35 μm(30～39 μm)(圖1 C和1 D)。內葉冠短寬約80枚,外葉冠細長,約180枚,頭部直徑650 μm(635～670 μm),口孔直徑160 μm(150～175 μm)(圖1 E)。亞中乳突4個,基部膨大,直徑10 μm(7～13 μm),頂端細(圖1F),頭感器2個,有明顯橫溝狀凹陷,直徑24 μm(20～26 μm)(圖1G)。雄蟲交合傘具2個發達的側葉和1個不發達的背葉,邊緣平滑(圖1H)。生殖錐具有指狀附屬物,長85 μm(80～90 μm)(圖1I)。雌蟲陰門位于蟲體后1/4處,開口橢圓形,直徑60 μm(50～65 μm)(圖1J),尾部鈍圓,肛門半月形,長150 μm(120～180 μm),距尾200 μm(170～220 μm)(圖1K)。

圖1 馬圓形線蟲的掃描電子顯微鏡觀察

2.1.2 無齒圓形線蟲[Strongylusedentatus(Looss,1900)]

采集地點:中國新疆維吾爾自治區

宿主:驢(Equusasinus)

雄蟲和雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。光學顯微鏡觀察發現,口囊呈球形,寬1.0 mm(0.8～1.1 mm),在口囊的背壁上有1個背溝,深0.8 mm(0.7～0.9 mm),向前延伸開口于口囊的前緣。蟲體粗壯,兩端稍細,體表具角質橫紋。掃描電子顯微鏡觀察發現,口領高而明顯,頭部直徑750 μm(700～790 μm),口孔直徑150 μm(130～180 μm),外葉冠細長,約80枚(圖2 A)。亞中乳突4個,基部膨大,直徑8 μm(6～10 μm),頂端細(圖2 B),頭感器2個,無明顯凹陷,直徑14 μm(11～18 μm)(圖2 C)。頸乳突1對,小刺狀,位于食道中部后方。雄蟲交合傘具2個發達的側葉和1個不發達的背葉,邊緣平滑,背肋先分為2支,再分為3支(圖2 D和2 E)。生殖錐較長,具有2對附屬物,第1對寬,乳頭形,第2對細長,長60 μm(50～69 μm)(圖2 F)。雌蟲陰門位于蟲體后1/4處,開口橢圓形,直徑89 μm(80～99 μm)(圖2 G),尾部鈍圓,肛門半月形,長200 μm(180～210 μm),距尾250 μm(230～260 μm)(圖2H)。

圖2 無齒圓形線蟲的掃描電子顯微鏡觀察

2.1.3 杯狀彼得洛夫線蟲[Petrovinemapoculatum(Looss,1900)]

采集地點:中國新疆維吾爾自治區

宿主:驢(Equusasinus)

雄蟲和雌蟲各觀察3條,雄蟲和雌蟲在頭端無明顯差異。光學顯微鏡觀察發現,內葉冠起始于口囊前緣稍后方,數目多。口囊壁自前向后逐漸彎曲增厚,至后1/4左右最厚,后端又持續變薄。口囊側壁中部有1個橫脊伸向口囊內腔。口囊呈柱狀,深度稍大,寬度稍小,口囊的前后寬度大體相等,前端部稍窄,中央偏前方最寬。食道長。掃描電子顯微鏡觀察發現,口領低而平緩,與蟲體間無明顯分割,頭徑79 μm(70～85 μm),口孔直徑37 μm(30～45 μm),外葉冠細小,刺狀,為32枚(圖3A)。頸乳突刺狀,長30 μm(25～34 μm),與排泄孔大致在同一平面(圖3B和3 C)。亞中乳突突出,長18 μm(15～20 μm)(圖3D),頭感器丘狀凸起,寬10 μm(8～15 μm)(圖3E)。雄蟲交合傘背葉和側葉較明顯,邊緣鋸齒狀,生殖錐發達且伸長,幾乎與交合傘側葉等長300 μm(280～350 μm),具1對小囊狀附屬物,交合刺遠端有倒鉤(圖3F和3G)。雌蟲陰門開口圓形,寬17 μm(14～20 μm),距肛門115 μm(100～125 μm),肛門開口月牙形,長75 μm(60～80 μm),尾長320 μm(305～330 μm),末端平滑漸細(圖3H)。

圖3 杯狀彼得洛夫線蟲的掃描電子顯微鏡觀察

2.2 基于ITS序列的同源性分析和系統發育分析

2.2.1 同源性分析 將本試驗中經PCR擴增和測序獲得的馬圓形線蟲和無齒圓形線蟲的ITS序列與NCBI中普通圓形線蟲的ITS序列進行比對,結果顯示,馬圓形線蟲與無齒圓形線蟲的同源性分別為90.0%,兩者與普通圓形線蟲的同源性分別為78.4%和80.0%,表明馬圓形線蟲與無齒圓形線蟲有很近的親緣關系,而兩者與普通圓形線蟲的親緣關系稍遠,結合三者的形態學特征,三者應屬于同一屬。

本試驗測得的杯狀彼得洛夫線蟲的ITS序列與NCBI中冠環屬的冠狀冠環線蟲的ITS序列同源性較高,為99.5%,與盅口亞科其他屬的代表種類的相似度介于80.0%～99.5%,其形態特征也符合盅口亞科線蟲的鑒定特征,因此杯狀彼得洛夫線蟲應屬于盅口亞科,但是杯狀彼得洛夫線蟲的形態特征與冠狀冠環線蟲及其他盅口亞科線蟲的形態有較大差別,因此,雖然杯狀彼得洛夫線蟲與冠狀冠環線蟲具有相似度較高的ITS序列,但是兩者應該為不同屬。

2.2.2 系統發育分析 本試驗測得的線蟲的ITS序列和NCBI中圓線科線蟲的11條ITS序列,包括2亞科9屬11種,以最大似然法和貝葉斯法建立的系統發育樹結果顯示,馬圓形線蟲、無齒圓形線蟲和普通圓形線蟲聚為一支,杯狀彼得洛夫線蟲與盅口亞科其他種類聚為一支(圖4)。

圖4 基于ITS序列采用貝葉斯法(A)和最大似然法(B)構建的系統發育樹

3 討論

馬圓形線蟲、無齒圓形線蟲和杯狀彼得洛夫線蟲是驢消化道常見的大型寄生蟲,嚴重危害宿主健康,因此有必要對其進行詳細的研究。目前,對于上述3種線蟲的研究主要集中在分子鑒定、病理學研究、治療藥物研發和應用等,而對寄生蟲的準確鑒定,尤其是基于形態學的鑒定是分子鑒定和其他研究的基礎,本試驗首次使用掃描電子顯微鏡對上述3種線蟲進行觀察描述和測量。

本試驗掃描電子顯微鏡觀察結果顯示,馬圓形線蟲雄蟲生殖錐具有2對指狀突起,一長一短;無齒圓形線蟲具有2對附屬物,分別為乳頭狀和細長狀的形態特征,補充了前人的描述。張路平等(2014年)[5]通過光學顯微鏡觀測到馬圓形線蟲有內葉冠75～85枚,外葉冠172～189枚,無齒圓形線蟲外葉冠75～80枚;本試驗觀測到馬圓形線蟲有內葉冠80枚,外葉冠約180枚,無齒圓形線蟲外葉冠80枚;與張路平等(2014年)[5]結果相似。本試驗觀測到杯狀彼得洛夫線蟲的外葉冠呈刺狀,32枚,不同于張路平等(2014年)[5]的35枚,支持Lichtenfels 等(2008年)[11]的結果(30～36枚)。另外,本試驗首次利用掃描電子顯微鏡觀察到馬圓形線蟲雄蟲尾部的生殖錐具有指狀附屬物;無齒圓形線蟲雄蟲尾部生殖錐較長,具有2對附屬物,第1對寬,乳頭形,第2對細長;杯狀彼得洛夫線蟲雄蟲尾部具1對小囊狀附屬物。

本試驗基于圓線科ITS基因構建系統發育樹,結果顯示,馬圓形線蟲、無齒圓形線蟲和普通圓形線蟲聚為一支,說明三者具有較近的親緣關系,這與三者具有相似的形態特征,同屬于圓形亞科圓線屬有關;盅口亞科各屬的代表種類聚為一支,包含本試驗中的杯狀彼得洛夫線蟲,說明杯狀彼得洛夫線蟲應屬于盅口亞科,根據其形態特征將其歸于彼得洛夫屬是準確的;圓形亞科三齒屬中的鋸齒三齒線蟲[Triodontophorusserratus(Looss,1900)]與盅口亞科聚為一支,但是鋸齒三齒線蟲與盅口亞科線蟲的形態差距較大,說明系統發育分析在線蟲分類學鑒定中存在一定的局限性,針對這種形態學鑒定結果與系統發育分析結果不相符的現象需要進一步研究。

消化道寄生線蟲嚴重威脅驢的健康,人類誤食感染寄生蟲或寄生蟲卵的驢肉有潛在感染寄生蟲的風險。本試驗使用掃描電子顯微鏡更準確、形象、立體的展示了3種線蟲的體表形態特征,為準確鑒定線蟲種類提供了影像學依據;同時,本試驗還在形態學鑒定基礎上進行了系統發育分析,同源性和系統發育樹結果顯示,本試驗中的3種線蟲的分子分類結果與形態學特征一致。