山羊肺源腸外致病型大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌混合感染的病原分離鑒定、毒力因子基因檢測(cè)和耐藥性分析

徐海軍,張 磊,爨淑楠,張婭菲,賈 哲,張圣堯,王書(shū)明

(1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安 237012;2. 安徽金豐源畜牧科技有限公司,安徽 六安 237000)

大腸桿菌是一類重要的條件性病原菌。與以往主要引起腸道感染不同,近年來(lái),腸外致病型大腸桿菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)引起的畜禽腸外器官感染日漸增多,對(duì)畜牧生產(chǎn)的健康發(fā)展造成嚴(yán)重危脅。張召興等[1]從243份養(yǎng)殖場(chǎng)流產(chǎn)貉的陰道分泌物和死胎等病料組織中分離到87株ExPEC;蔣增海等[2]從河南省61家豬場(chǎng)送檢的病豬肺臟和肝臟等病料中分離到17株ExPEC,檢出率為27.86%;馬帥等[3]從黑龍江省和山東省不同養(yǎng)殖場(chǎng)患肺炎狐和貉的肺部分離到15株ExPEC;徐海軍等[4]從發(fā)病山羊的肺臟中分離到1株ExPEC。ExPEC攜帶多種毒力因子,致病機(jī)制復(fù)雜,引起的癥狀和病變多種多樣,給基層臨床準(zhǔn)確診斷其感染帶來(lái)了很大困難。粘質(zhì)沙雷氏菌是一種條件性致病菌。陳永林等曾報(bào)道1例山羊混合感染大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌的病例[5]。本試驗(yàn)報(bào)告了1例罕見(jiàn)的ExPEC和粘質(zhì)沙雷氏菌混合感染導(dǎo)致的成年山羊急性死亡,對(duì)分離菌進(jìn)行致病性試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn),并對(duì)分離到的ExPEC進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化群分析和毒力因子基因檢測(cè),以期為臨床診治該病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例來(lái)源 安徽省六安市東河口鎮(zhèn)某養(yǎng)羊戶發(fā)病死亡成年山羊。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠,雄性,4周齡,購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(皖)2017—001]。

1.3 主要試劑和藥品 胰大豆蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(Tryptic soybean peptone agar,TSA)、胰大豆蛋白胨肉湯和伊紅美蘭培養(yǎng)基,均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;藥敏紙片,購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司;Taq酶、dNTP Mix和DNA Marker等,均購(gòu)自 TaKaRa 公司;Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒,均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;頭孢噻呋鈉和恩諾沙星注射液,均購(gòu)自安徽金豐源畜牧科技有限公司。

1.4 主要儀器 SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);HGPN-II-270型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司);HC-2518R型冷凍高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);DYCP-31DN型DNA 電泳槽和DYY-5型穩(wěn)壓電泳儀(北京六一儀器廠);2720型PCR 儀(Applied Biosystems公司);FR980型凝膠成像儀(上海復(fù)日科技儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 病史調(diào)查 2021年7月7日,六安市東河口鎮(zhèn)某養(yǎng)羊戶送檢1只剛死亡不久的成年山羊。該養(yǎng)羊戶共飼養(yǎng)了6只山羊,其中3只為1年齡大羊,另3只為小羊。養(yǎng)羊戶7月6日14:00時(shí)將羊群帶到附近樹(shù)林放牧,大羊用繩子系住頸部,繩子另一端拴在樹(shù)干,防止其逃跑。小羊未用繩子拴住。16:00養(yǎng)羊戶去察看時(shí),發(fā)現(xiàn)有2只大羊已死亡,另1只大羊倒臥在地,大聲呻吟,15 min后也死亡;3只小羊表現(xiàn)正常。養(yǎng)羊戶遂帶剛死的1只大羊來(lái)就診。

1.5.2 病理剖檢觀察 對(duì)送檢的病死羊進(jìn)行病理剖檢,觀察病理變化。

1.5.3 細(xì)菌分離、純化和染色鏡檢 無(wú)菌采集病死羊的肺臟組織,涂布接種于TSA平板,37 ℃培養(yǎng) 18 h,將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接于TSA平板,37 ℃恒溫培養(yǎng) 18 h進(jìn)行純化。將純化菌落轉(zhuǎn)接于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,37 ℃恒溫培養(yǎng) 18 h,觀察分離菌生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)。對(duì)純化菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.5.4 分離菌16S rRNA 基因PCR擴(kuò)增 參照徐海軍等[4]的方法通過(guò)PCR擴(kuò)增分離菌16S rRNA 基因,并進(jìn)行測(cè)序和序列相似性比對(duì)鑒定。

1.5.5 致病性試驗(yàn) 參照徐海軍等[4]的方法,制備濃度為 1.0×108CFU/mL 的分離菌懸液,每種分離菌取10只小鼠腹腔注射0.5 mL菌液進(jìn)行攻毒,另取10只小鼠腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液,作為空白對(duì)照,測(cè)定分離菌對(duì)小鼠的致病性。

1.5.6 藥敏試驗(yàn) 參照徐海軍等[4]的方法,采用紙片法測(cè)定分離菌對(duì)常用抗菌藥的敏感性。

1.5.7 防治措施 對(duì)3只小羊用藥敏試驗(yàn)篩選到的敏感抗菌藥進(jìn)行預(yù)防性治療,同時(shí)對(duì)羊舍加強(qiáng)消毒,及時(shí)清理糞便。

1.5.8 分離菌系統(tǒng)進(jìn)化群分析和32個(gè)毒力因子基因檢測(cè) 參照參考文獻(xiàn)[6]合成系統(tǒng)進(jìn)化群分群基因(chuA、yjaA和TspE4.C2.)和ExPEC 32個(gè)毒力基因(papA、sfaS、focG、iutA、hlyD、afa、fyuA、ireA、vaT、irp2、irp1、tsh、ler、iss、papC、kpsMTII、focD、iroN、ompA、ompT、fimH、hylA、gafD、cnf1、bmaE、cvaC、ibeA、iucD、traT、iha、nfaE和malX)的引物。參照徐海軍等[4]的方法通過(guò)PCR擴(kuò)增上述基因,并進(jìn)行測(cè)序和相似性比對(duì)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢觀察 送檢病死山羊部分結(jié)腸腸段嚴(yán)重出血(圖1A),心內(nèi)膜有散在出血斑(圖1B),瘤胃黏膜局部充血(圖1C)。其他臟器未見(jiàn)明顯病變。

圖1 病死山羊部分臟器病變觀察

2.2 細(xì)菌分離、純化和染色鏡檢 從病死山羊肺臟分離到很厚的灰白色菌苔(圖2A),劃線接種至TSA平板培養(yǎng)后長(zhǎng)出灰白色和紅色2種菌落(圖2B)。純化培養(yǎng)后灰白色菌落形態(tài)特點(diǎn)為隆起、圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤(rùn)、不透明(命名為Grey0707,圖2C);紅色菌落形態(tài)特點(diǎn)為隆起、圓形、邊緣整齊、不透明(命名為Red0707,圖2D)。Grey0707和Red0707在伊紅美藍(lán)平板上均生長(zhǎng)良好,菌落顏色分別呈暗紅色和黑色,均有金屬光澤(圖2E)。革蘭染色鏡檢結(jié)果顯示,Grey0707和Red0707均為革蘭陰性桿菌(圖3)。

圖2 分離菌的培養(yǎng)特點(diǎn)

圖3 分離菌革蘭染色鏡檢(1 000×)

2.3 分離菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增 Grey0707菌株 16S rRNA 基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序,獲得長(zhǎng)為 1 447 bp 的核苷酸片段,相似性比對(duì)結(jié)果顯示,Grey0707菌株與Escherichiacoli(E.coli) strain Pk1 (KX354348.1)和E.colistrain 1018 (MK729002.1)的16S rRNA基因序列相似性均達(dá)到99.7%。因此,判定Grey0707為埃希氏菌屬的大腸桿菌(Escherichiacoli)。

Red0707菌株16S rRNA 基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后測(cè)序,獲得長(zhǎng)為 1 439 bp 的核苷酸片段,相似性比對(duì)結(jié)果顯示,Red0707菌株與Serratiamarcescensstrain WVU-006(CP041129.1)和Serratiamarcescensstrain S3 (MK411566.1)的相似度均達(dá)到100%。因此,判定Red0707為粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。

2.4 致病性試驗(yàn) 分離菌Grey0707攻毒后24 h,小鼠均表現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩等發(fā)病癥狀,攻毒后第2、3天分別死亡8 只和1只,之后未再死亡,致死率為 90%。剖檢死亡小鼠,可見(jiàn)其血液暗紅,肝脾腫大;從肝臟分離到的致病菌經(jīng)測(cè)序比對(duì),與Grey0707為同一細(xì)菌。對(duì)照組小鼠表現(xiàn)正常,肝臟中未分離到細(xì)菌。結(jié)果表明,菌株Grey0707對(duì)小鼠有很強(qiáng)的致病性。同法測(cè)定Red0707的致病性,結(jié)果顯示,Red0707對(duì)小鼠無(wú)致病性。

2.5 藥敏試驗(yàn) Grey0707和Red0707的藥敏試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表1和表2。由表1可知,Grey0707對(duì)頭孢曲松和丁胺卡那敏感,對(duì)磷霉素中度敏感,對(duì)粘桿菌素、多西環(huán)素、新霉素、慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、阿莫西林和紅霉素等藥物耐藥。由表2可知,Red0707對(duì)恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素和磷霉素中度敏感,對(duì)頭孢曲松、粘桿菌素、新霉素、阿莫西林、多西環(huán)素、氟苯尼考和紅霉素等藥物耐藥。結(jié)果表明,2種分離菌對(duì)常用抗菌藥的耐藥性均較嚴(yán)重。

表1 分離菌Grey0707的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 分離菌株Red0707的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 防治效果 養(yǎng)羊戶總共才飼養(yǎng)了6只山羊,3只大羊都已發(fā)病死亡。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,建議養(yǎng)羊戶用頭孢噻呋鈉和恩諾沙星注射液對(duì)剩下的3只小羊進(jìn)行肌肉注射預(yù)防,每天1次,連用3 d;清除羊舍中墊草和糞便,然后用消毒藥進(jìn)行消毒。1周后回訪得知,3只小羊未再發(fā)病。

2.7 Grey0707系統(tǒng)進(jìn)化群分析和毒力因子基因檢測(cè) 系統(tǒng)進(jìn)化群分群分析結(jié)果顯示,Grey0707攜帶yjaA基因,不攜帶chuA和TspE4.C2.基因(圖4)。參照大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化性組別檢索表[7],確定該菌為A群。

圖4 Grey0707系統(tǒng)進(jìn)化群分群基因和毒力因子基因的PCR擴(kuò)增

毒力因子基因檢測(cè)結(jié)果(圖4)顯示,Grey0707攜帶外膜蛋白相關(guān)毒力基因(ompA、ompT、traT和iss)、游離鐵攝取相關(guān)毒力基因(iutA、iroN和iucD)、粘附素相關(guān)毒力基因(fimH、afa和gafD)。Johnson等[8-9]認(rèn)為,ExPEC至少應(yīng)具備5種毒力標(biāo)記基因(papA/papc、sfa/foc、afa/dra、iutA和kpsMTII)中的2種毒力標(biāo)記基因。本試驗(yàn)分離到的大腸桿菌攜帶2種毒力標(biāo)記基因(afa和iutA),因此可判定為ExPEC;該菌還攜帶其他多種類型的毒力因子,這可能與其致病性較強(qiáng)有關(guān)。

3 討論

大腸桿菌根據(jù)其不同的分子特性和致病機(jī)制被分為共生型、腸道致病型和腸外致病型三類。近些年來(lái),ExPEC引起動(dòng)物感染的報(bào)道日益增多[10-13],已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的重要細(xì)菌性疾病之一[14]。本試驗(yàn)分離到1株致病力特別強(qiáng)的ExPEC,可引起成年山羊急性突然死亡。讓人費(fèi)解的是同群飼養(yǎng)的小羊卻未發(fā)病,實(shí)屬罕見(jiàn)。雖然本病例中死亡山羊肺部的眼觀病變并不明顯,但細(xì)菌分離時(shí)卻長(zhǎng)出非常厚的灰白色菌苔,表明肺部的細(xì)菌感染非常嚴(yán)重。ExPEC大量感染時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素,這可能會(huì)造成內(nèi)毒素性休克,甚至快速死亡。在急性敗血癥時(shí),由于致病因子毒力極強(qiáng),可能會(huì)出現(xiàn)臟器無(wú)明顯病變而突然出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象。本病例的結(jié)腸、心內(nèi)膜和瘤胃黏膜有明顯病變,但其他臟器未見(jiàn)明顯病變,這可能反映了不同臟器對(duì)分離菌的致病作用存在耐受性差異。本試驗(yàn)毒力因子檢測(cè)結(jié)果顯示,分離獲得的大腸桿菌攜帶了10種毒力因子,包括粘附素相關(guān)基因(fimH、gafD和afa)、游離鐵攝取相關(guān)基因(iroN、iucD和iutA)和外膜蛋白相關(guān)基因(ompA、ompT、traT和iss)。粘附是ExPEC感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Grey0707攜帶1種I型菌毛基因(fimH)和2種非菌毛粘附素基因(gafD和afa),可能有利于其結(jié)合腸上皮細(xì)胞,進(jìn)而進(jìn)入腸外組織并引起感染。動(dòng)物體內(nèi)游離鐵濃度很低。雖未檢測(cè)到Grey0707攜帶溶血相關(guān)基因,但其攜帶氣桿菌素鐵載體系統(tǒng)基因(iucD和iutA)和iroN基因,這可有效保障該菌在體內(nèi)獲得充足的鐵離子用于生長(zhǎng)。此外,Grey0707攜帶了4種外膜蛋白基因,其中ompA編碼的蛋白參與細(xì)菌的粘附、毒性、侵襲性和生物膜形成[15];traT編碼的蛋白是一種菌體外膜脂蛋白,與菌體的補(bǔ)體抗性和致病力關(guān)系密切[16];ompT編碼的蛋白對(duì)細(xì)菌的定植和粘附至關(guān)重要[17-18];iss編碼的蛋白與大腸桿菌的抗補(bǔ)體作用有關(guān),該蛋白表達(dá)水平越高,大腸桿菌對(duì)血清的抵抗能力越強(qiáng),致病力越強(qiáng)[19-20]。可見(jiàn),本試驗(yàn)分離到的ExPEC毒力因子豐富且類型多樣,這可能是其引起本病例成年山羊迅速發(fā)病死亡的內(nèi)在因素。

本病例在對(duì)分離菌進(jìn)行純化培養(yǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)有少量紅色菌落生長(zhǎng),該菌隨后被鑒定為粘質(zhì)沙雷氏菌。粘質(zhì)沙雷氏菌廣泛存在于環(huán)境中,在機(jī)體免疫功能下降時(shí)可引起肺部和尿道感染以及敗血癥[21-23]。在家畜上,陳永林等[5]曾報(bào)告山羊混合感染大腸桿菌和粘質(zhì)沙雷氏菌的病例[5]。金紅巖等[24]從健康牦牛牛乳中分離到粘質(zhì)沙雷氏菌,但對(duì)小鼠沒(méi)有致病性。本病例分離到的粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)健康小鼠亦未表現(xiàn)致病作用,與其屬于條件性致病菌的特點(diǎn)相一致。但在有ExPEC感染的情況下,粘質(zhì)沙雷氏菌可能會(huì)對(duì)大腸桿菌起到協(xié)同致病的作用,從而導(dǎo)致本病例中非常罕見(jiàn)的成年山羊突然急性死亡。

在耐藥性方面,本試驗(yàn)分離到的ExPEC除對(duì)頭孢曲松、丁胺卡那和磷霉素相對(duì)敏感外,對(duì)其他抗菌藥均表現(xiàn)明顯的耐藥性。大腸桿菌是一種非常容易產(chǎn)生耐藥性的細(xì)菌。臨床上用藥時(shí)應(yīng)務(wù)必根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇敏感的抗菌藥進(jìn)行治療。粘質(zhì)沙雷氏菌的耐藥情況表現(xiàn)較為復(fù)雜。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,粘質(zhì)沙雷氏菌(Red0707株)對(duì)恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素和磷霉素中度敏感,對(duì)頭孢曲松、粘桿菌素、新霉素、阿莫西林、多西環(huán)素、氟苯尼考和紅霉素等藥物耐藥。金紅巖等[24]從耗牛牛乳中分離到的粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)頭孢哌酮、頭孢他啶、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、丁胺卡那、新霉素和多西環(huán)素敏感,而對(duì)慶大霉素和哌拉西林中度敏感,對(duì)頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢氨芐、氨芐西林、苯唑西林、青霉素和卡那霉素等耐藥。蘇華田等[21]從重癥監(jiān)護(hù)(Intensive care unit,ICU)患者體內(nèi)分離到的粘質(zhì)沙雷菌對(duì)青霉素類和1、2、3代頭孢菌素類抗菌藥的耐藥率較高(>60%),對(duì)氨基糖苷類的耐藥率較高(>80%),對(duì)喹諾酮類的耐藥率較低(<30%),對(duì)頭孢吡肟和亞胺培南敏感。可見(jiàn),粘質(zhì)沙雷氏菌常出現(xiàn)對(duì)同一類別抗菌藥物中的不同抗菌藥物表現(xiàn)不一致的耐藥性,但總體上看對(duì)喹諾酮類藥物較敏感。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)報(bào)道了1例罕見(jiàn)的ExPEC和粘質(zhì)沙雷氏菌混合感染導(dǎo)致成年山羊突然急性死亡病例。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離獲得的大腸桿菌對(duì)小鼠致死率為90%,粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)小鼠無(wú)致病性。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離獲得的大腸桿菌對(duì)頭孢曲松和丁胺卡那敏感,粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)恩諾沙星、丁胺卡那、慶大霉素和磷霉素中度敏感。分離到的ExPEC屬于A群,并攜帶毒力因子基因ompA、ompT、traT、iss、iutA、iroN、iucD、fimH、afa和gafD。推測(cè)ExPEC與粘質(zhì)沙雷氏菌混合感染可能產(chǎn)生協(xié)同致病作用。家畜感染ExPEC的病例日益增多,需引起高度重視。