注射用泮托拉唑鈉中有關物質研究*

王 曄，劉 驊，王辰雯，馬 莉

（1. 安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051； 2. 海南衛康制藥有限公司，海南 海口 570100）

泮托拉唑鈉為質子泵抑制劑，通過特異性作用于胃黏膜細胞而抑制胃酸分泌，主要用于治療消化性潰瘍、反流性食管炎等［1-2］。2020年版《中國藥典（四部）》9102 藥品雜質分析指導原則中規定，雜質檢查分析方法應專屬、靈敏，主成分與雜質和降解產物均應能分開，檢測限應滿足限度檢查的要求［3］。2020年版《中國藥典（二部）》中，采用高效液相色譜法測定，以主成分自身對照法計算注射用泮托拉唑鈉中有關物質，且系統適用性試驗中僅規定了泮托拉唑鈉與氧化降解產物的分離度，不能有效區分、控制相關雜質［4］。《美國藥典》《歐洲藥典（11.0 版）》中對有關物質雜質D 和雜質F 均以混合物進行雜質控制，不利于產品質量控制［5-6］。為此，本研究中采用加校正因子的自身對照法測定注射用泮托拉唑鈉中有關物質，以提高雜質的質量控制水平。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司），配有二極管陣列檢測器（PDA）；XS105DR 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

泮托拉唑鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100575 - 201505）；雜質A 對照品（C16H15N3O5F2S，批號為CAS127780 - 16 - 9），雜質B 對照品（C16H15F2N3O3S，批號為CAS102625-64-9），雜質C對照品（C8H6F2N2OS，批號為CAS97963-62-7），雜質D+F對照品（《美國藥典》商品化對映異構體混合物對照品C17H17F2N3O4S，批號為CAS624742-53-6，雜質D 含量為58.5%，雜質F 含量為41.5%），雜質E 對照品（C32H28F4N6O8S2，批號為CAS2115779-15-0），均購于上海麥克林生化科技有限公司；雜質D 和雜質F色譜定位用對照品（自制，雜質D，批號為HX - PTL2 - D -2018，含量為99.95%；雜質F，批號為HX - PTL2 - F -2019，含量為98.31%）；磷酸氫二鉀、氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜純，默克美國Sigma 化學公司）；水為二次蒸餾純凈水；注射用泮托拉唑鈉（安徽某企業，編號為1-6，規格為每瓶40 mg）。

2 泮托拉唑鈉有關物質測定

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱Thermo Hypersil ODS C18柱（125 mm×4.0 mm，5 μm）；流動相：A 為0.01 mol/ L 磷酸二氫鉀緩沖液（用20%磷酸調pH 至7.0），B 為水-乙腈（1∶99，V/V），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：290 nm（雜質A，B，E，D + F）和305 nm（雜質C）；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，各雜質均能有效分離。色譜圖見圖1。

1. 雜質C 2. 雜質A 3. 泮托拉唑 4. 雜質D + F 5. 雜質E 6. 雜質B圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖1.Impurity C 2.Impurity A 3.Pantoprazole 4.Impurity D + F 5.Impurity E 6.Impurity BFig.1 HPLC chromatogram of the system suitability test

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

分別取有關物質雜質A，B，C，D+F，E 對照品各適量，精密稱定，加乙腈溶解并稀釋成每1 mL 含0.1 mg的溶液，搖勻，作為各雜質對照品貯備液。

取泮托拉唑鈉對照品適量，精密稱定，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解，并定量稀釋成每1 mL 含泮托拉唑2 mg 的溶液，搖勻，作為泮托拉唑鈉對照品貯備液。

精密量取各雜質對照品貯備液0.1 mL、泮托拉唑鈉對照品貯備液2 mL，置同一10 mL 容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）稀釋并定容，搖勻，作為系統適用性溶液。

取樣品，精密稱定，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg / L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解，并定量稀釋成每1 mL含泮托拉唑鈉0.4 mg的溶液，作為供試品溶液。

取輔料，按樣品工藝與處方制備空白輔料樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，作為空白輔料溶液。

參考國外藥典自身對照為0.1%的濃度，供試品溶液色譜圖任何小于對照品溶液主峰面積0.5 倍的峰忽略不計。精密量取供試品溶液0.1 mL，置100 mL容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）定容，搖勻，作為自身對照溶液。

2.3 各雜質校正因子計算

雜質A，B，D + F，E 的校正因子均在0.9～1.1 之間，于290 nm 波長處檢測含量時校正因子按1.0 計算；雜質C 的校正因子約為0.3，于305 nm 波長處檢測含量時校正因子按0.3計算。結果見表2。

表2 各雜質相對于泮托拉唑鈉主峰的校正因子Tab.2 Correction factors of various impurities relative to the main peak of pantoprazole sodium

2.4 方法學考察

專屬性試驗：空白輔料溶液及配伍溶劑（0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液）均不干擾注射用泮托拉唑鈉中有關物質檢測，且于290 nm 和305 nm 波長處雜質A - F 間，以及與泮托拉唑鈉間的分離度均理想，表明方法的專屬性良好。色譜圖見圖2。

a. 雜質A b. 雜質B c. 雜質C d. 雜質D + F e. 雜質E f. 泮托拉唑1. 系統適用性溶液 2. 空白溶劑 3. 空白輔料溶液 4. 葡萄糖注射液 5. 氯化鈉注射液A.290 nm B.305 nm圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖a.Impurity A b.Impurity B c.Impurity C d.Impurity D + F e.Impurity E f.Pantoprazole1.System suitability solution 2.Blank solvent 3.Blank excipient solution 4.Glucose Injection 5.Sodium Chloride InjectionA.290 nm B.305 nmFig.2 HPLC chromatograms of the specificity test

干擾試驗：1）酸破壞。取樣品1 瓶，加0.1 mol/L 鹽酸溶液1 mL 破壞1 h 后，加0.1 mol / L 氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg / L）mL 中和，置100 mL 容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/ L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。2）堿破壞。取樣品1 瓶，加1 mol/ L 氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/ L）mL破壞16 h后，加1 mol/L 鹽酸溶液1 mL中和，置100 mL容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。3）氧化破壞。取樣品1 瓶，置100 mL 容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解，加0.3%過氧化氫1 mL，破壞20 min 后，加溶劑稀釋并定容，搖勻，立即進樣。4）光照破壞。取樣品1瓶，光照5 000 lx破壞30 d，置100 mL 容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/L）- 乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。5）高溫破壞。取樣品1瓶，60 ℃高溫破壞30 d，置100 mL容量瓶中，加氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/L）-乙腈（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。對樣品及空白輔料進行酸、堿、高溫、光照、氧化強制降解試驗［7-8］。結果經酸、堿、高溫、光照、氧化破壞后檢測，主峰處均未檢出有關物質，主峰純度符合規定。各降解雜質均不干擾目標雜質的檢測，分離度良好。雜質C 在光照破壞條件下增加明顯；雜質D + F 在高溫破壞條件下增加明顯，在光照條件下呈增長趨勢；雜質A在氧化破壞條件下增加顯著。色譜圖見圖3。

1. 泮托拉唑 2. 雜質A 3. 雜質C 4. 雜質D + FA. 酸破壞 B. 堿破壞 C. 氧化破壞 D. 光照破壞 E. 高溫破壞圖3 破壞性試驗高效液相色譜圖1.Pantoprazole 2.Impurity A 3.Impurity C 4.Impurity D + FA.Acid damage B.Alkaline damage C.Oxidative damage D.Light damage E.High - temperature damageFig.3 HPLC chromatograms of the destructive test

檢測限確定：按色譜圖信噪比（S/N）為3∶1 計算各雜質及泮托拉唑鈉的檢測限。結果雜質A，B，C，D+F，E及泮托拉唑鈉的檢測限分別為0.24，0.29，0.80，0.71，0.30，0.30 ng，均遠低于擬訂的雜質限度，表明方法靈敏度良好。

穩定性試驗：24 h內供試品溶液中雜質C 含量及總雜含量明顯增長，供試品溶液臨用新配，自身對照溶液24 h內峰面積RSD變化較小，表明溶液穩定性良好。

加樣回收試驗：各雜質按雜質限度50%，100%，150%加標至供試品溶液中，每個濃度平行3份，扣除樣品基底，計算加樣回收率及RSD。各雜質的加樣回收率均在90%～110%范圍內，RSD均小于10.0%（n=9），表明方法準確度良好。

2.5 雜質D+F 檢測

2.5.1 色譜條件與系統適用性試驗

流動相：A 為0.01 mol/L 磷酸氫二鉀溶液（用磷酸調pH 至7.0），B為水-乙腈（1∶99，V/V），梯度洗脫（程序見表3）；檢測波長：290 nm；其余色譜條件同2.1 項下。取雜質D + F 對照品和泮托拉唑鈉對照品各適量，精密稱定，加乙腈適量使溶解，并用氫氧化鈉溶液（質量濃度為40 mg/ L）- 乙腈（1∶1，V/V）稀釋成每1 mL含泮托拉唑0.4 mg、雜質D+F 2.4 μg 的溶液，搖勻，作為系統適用性溶液。結果出峰順序依次為泮托拉唑、雜質D 和雜質F。雜質D 和F 的分離度為1.1，基本達到基線分離，空白溶劑、空白輔料及其他雜質峰對雜質D 和雜質F的檢測均無干擾。色譜圖見圖4。

1. 泮托拉唑 2. 雜質D 3. 雜質F圖4 雜質D和雜質F的系統適用性試驗高效液相色譜圖1.Pantoprazole 2.Impurity D 3.Impurity FFig.4 HPLC chromatogram of the system suitability test of impurities D and F

表3 調整后的流動相梯度洗脫程序（%）Tab.3 Gradient elution program of the mobile phase after the adjustment（%）

2.5.2 方法學考察

檢測限確定：按色譜圖S/N為3∶1 計算雜質D 和雜質F 的檢測限，結果雜質D 和雜質F 的檢測限均為0.01 μg/mL，供試品溶液主峰質量濃度為0.4 mg/mL（相當于主成分的0.002%），表明該色譜系統靈敏度適合檢測雜質D和雜質F。

加樣回收試驗：分別配制相當于雜質限度50%，100%，150%的加標供試品溶液，每個濃度平行3 份，扣除樣品基底，計算加樣回收率及RSD。結果雜質D 和雜質F 的加樣回收率均在90%～110%范圍內，RSD均小于10.0%（n=9），表明方法準確度良好。

2.6 注射用泮托拉唑鈉中有關物質標準制訂及樣品測定

由圖1 可知，泮托拉唑鈉主峰及雜質D +F 分離度達到3.0 以上，采用自身對照法，供試品溶液的色譜圖中如有雜質峰，各雜質的峰面積（雜質C 于305 nm 波長檢測）分別乘以相應的校正因子后與自身對照溶液主成分的峰面積比較，計算各雜質含量。結果見表4。擬訂雜質A - F 分別不得過0.2%，0.1%，0.2%，0.5%，0.1%，0.5%，其他單個雜質含量不得過0.2%，總雜質不得過1.0%。其中，雜質含量均相當于泮托拉唑標示量。

表4 6批樣品中有關物質含量測定結果（%）Tab.4 Results of the content determination of related substance in six batches of samples（%）

3 討論

注射用泮托拉唑鈉在國內臨床使用范圍很廣［9-10］，對有關物質進行嚴格合理控制，可保證藥品使用的安全性和可靠性［11-12］。2020年版《中國藥典（二部）》中收載的注射用泮托拉唑鈉采用主成分自身對照法配制了1%自身對照溶液［13］，規定“最大單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的0.5 倍（0.5%），總雜質峰不得大于對照溶液主峰面積（1%）”，但僅規定最大單個雜質限度在0.5%不夠合理和客觀。前期試驗發現，泮托拉唑鈉及雜質A，B，D + F 均于290 nm 波長附近有最大吸收，雜質C 和E 于305 nm 波長附近有最大吸收，參考《美國藥典》選擇雜質A，B，D+F，E及主峰泮托拉唑鈉均于290 nm 波長處檢測；雜質C 于290 nm 波長處斜率大，受波長影響較大，故選擇雜質C 的檢測波長為305 nm［14-16］。該品種使用常見的C18液相色譜柱及2.1 項下色譜條件的流動相梯度系統，檢出多個雜質，且系統適用性溶液中各雜質分離度符合要求。建議完善注射用泮托拉唑鈉的有關物質質量控制標準，并納入新版藥典。所制訂的雜質限度可滿足該品種的有關物質質量控制，且雜質D 和雜質F 得到有效分離，雜質D 和雜質F的含量計算較國外藥典用雜質D+F 混合物含量計算更合理。