吉蘭-巴雷綜合征患者外周血記憶性T 細(xì)胞和記憶性B 細(xì)胞亞群的變化及其臨床意義

劉壇，黃小雨，張勇

1.湖州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江湖州 313000；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇徐州 221000

吉蘭-巴雷綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）是一類免疫介導(dǎo)的急性炎性周圍神經(jīng)病，主要病理生理機(jī)制是外周神經(jīng)中抗體-抗原相互作用引起的補(bǔ)體介導(dǎo)的神經(jīng)損傷[1-2]。既往研究發(fā)現(xiàn)體液免疫及細(xì)胞免疫共同參與此病的發(fā)生，然而國內(nèi)外關(guān)于GBS 免疫細(xì)胞亞群的研究尚不充分，尤其是記憶性細(xì)胞亞群在GBS 患者外周血中的占比仍需進(jìn)一步探討。已有文獻(xiàn)報(bào)道記憶性B 細(xì)胞參與了GBS 的發(fā)病[3]；也有學(xué)者指出記憶性T 細(xì)胞可幫助記憶性B 細(xì)胞更快速地產(chǎn)生抗體反應(yīng)[4]。由此推測記憶性T 細(xì)胞及記憶性B 細(xì)胞均可能參與GBS 的發(fā)病。本研究通過分析GBS 患者記憶性T細(xì)胞及記憶性B 細(xì)胞亞群的改變，為探索GBS 的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2018 年6 月至2020 年12 月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的16 例GBS 患者作為研究組，其中男8 例、女8 例，年齡28～78歲，平均（54.38±15.24）歲。選取同期16 名來院的健康體檢者作為對照組，其中男7 例、女9 例，年齡29～69 歲，平均（46.56±11.18）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國吉蘭-巴雷綜合征診治指南2019》診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]；②年齡≥18 歲；③未接受靜脈注射免疫球蛋白治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他自身免疫性疾病，如白血病、類風(fēng)濕疾病、甲狀腺疾病、人類免疫缺陷病毒感染的患者；②器官移植的患者；③診斷不明確或臨床資料不全、資料丟失的患者。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過（倫理審批號：XYFY2020-JS019-01）。

1.2 方法

所有研究對象均于入組后空腹抽取6ml 靜脈血，其中2ml 靜脈血用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，余靜脈血不抗凝直接分離血清。采用人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊锕荆┓蛛x得到外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌離心后加入鼠抗人CD3-APC-Cy7 抗體、鼠抗人CD4-APC 抗體、鼠抗人CD8-Percp-Cy5-5 抗體、鼠抗人CD45RAV450 抗體、鼠抗人CCR7-BV510 抗體（美國BD 公司）；同時設(shè)同型對照管，室溫避光孵育15min 后，流式細(xì)胞儀檢測記憶性T 細(xì)胞亞群，其中CD4+初始T 細(xì)胞（naive T cells，TN）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA+、CCR7+，CD4+中央記憶性T 細(xì)胞（central memory T cells，TCM）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7+，CD4+效應(yīng)記憶性T 細(xì)胞（effector memory T cells，TEM）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-，CD4+終末分化效應(yīng)記憶性T細(xì)胞（terminally differentiated effector memory T cells，TEMRA）表型為CD3+、CD4+、CD8-CD45RA-、CCR7-；CD8+TN 細(xì)胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA+、CCR7+，CD8+TCM 細(xì)胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7+，CD8+TEM 細(xì)胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7-，CD8+TEMRA細(xì)胞表型為CD3+、CD4-、CD8+CD45RA-、CCR7-。在分離的PBMC 中加入鼠抗人CD45-Percp-Cy5-5 抗體、鼠抗人CD19-APC、鼠抗人CD27- BV510、鼠抗人CD38-FITC 抗體（美國BD 公司），同時設(shè)同型對照管。室溫避光孵育15min 后，流式細(xì)胞儀檢測記憶B 細(xì)胞亞群，其中記憶B 細(xì)胞表型為CD19+CD27+，漿母細(xì)胞表型為CD19+CD27+CD38+。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（Q1，Q3）]表示，組間比較采用秩檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用X2檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)性分析CD4+TEM及CD8+TEM 占比與Hughes 殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）及記憶性B 細(xì)胞的相關(guān)性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBS 患者的一般資料及外周血記憶性T 細(xì)胞亞群占比分析

GBS 患者的一般資料分析見表1。與對照組相比，研究組患者的CD4+TN 及CD8+TN 均明顯下降（P<0.05），CD4+TEM 及CD8+TEM 均明顯升高（P<0.05），TCM 及TEMRA 在CD4 和CD8 上的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

表1 GBS 患者的一般資料

表2 兩組患者的外周血記憶性T 細(xì)胞亞群占比比較（n=16）

2.2 兩組患者的外周血記憶性B 細(xì)胞占比比較

與對照組比較，研究組患者的記憶性B 細(xì)胞比例明顯升高（P<0.05），漿母細(xì)胞的比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 兩組患者的外周血記憶性B 細(xì)胞占比比較（n=16）

2.3 GBS 患者外周血CD4+TEM 和CD8+TEM 占比與GBS 患者臨床嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

GBS 患者外周血CD4+TEM 及CD8+TEM 占比與Hughes 殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液IgG 及記憶性B 細(xì)胞占比均呈正相關(guān)（P<0.05），見圖1。

圖1 GBS 患者外周血TEM 占比與GBS 臨床嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

3 討論

GBS 發(fā)病與自身免疫功能障礙相關(guān)，各種類型的活化的T 細(xì)胞被認(rèn)為是GBS 的發(fā)生和發(fā)展的協(xié)調(diào)者。研究表明記憶性T 細(xì)胞對B 細(xì)胞生發(fā)中心的形成及產(chǎn)生對抗髓鞘的抗體具有十分重要的作用，其中 TEM 細(xì)胞可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（interleukin-17，IL-17）和重組人干擾素（recombinant human interferon-r，IFN-γ）等炎癥因子參與B 細(xì)胞的分化[5]；同時記憶性B 細(xì)胞也與GBS 的發(fā)病相關(guān)[3]。因此，進(jìn)一步明確記憶性B 細(xì)胞亞群、記憶性T 細(xì)胞亞群尤其是TEM 細(xì)胞在GBS 患者外周血中的占比，對解釋GBS 的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

有學(xué)者根據(jù)是否表達(dá)CD45RA 區(qū)別初始T 細(xì)胞和記憶性T 細(xì)胞，并進(jìn)一步依據(jù)趨化因子受體CCR7的表達(dá)將記憶性T 細(xì)胞分為TCM 和TEM[6]。與初始T 細(xì)胞和TCM 細(xì)胞相比，TEM 細(xì)胞更能快速被抗原識別，迅速激活免疫反應(yīng)，且可立刻到達(dá)炎癥部位并發(fā)揮作用[7]。既往多項(xiàng)研究表明，TEM 細(xì)胞與一些自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡 、結(jié)腸炎、1 型糖尿病等的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及嚴(yán)重程度密切相關(guān)[8-12]。本研究結(jié)果也顯示，與對照組相比，研究組患者外周血 CD4+TEM 細(xì)胞和CD8+TEM 細(xì)胞占比更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。初始B 細(xì)胞成熟后，與抗原相遇被其激活，隨后分化為CD19+CD27+記憶性B 細(xì)胞；當(dāng)記憶性B 細(xì)胞再次與相同抗原相遇時就會增殖，分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體，從而發(fā)揮介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的作用。據(jù)報(bào)道，記憶性B 細(xì)胞在一些自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血等疾病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[13-15]。Wang 等[3]發(fā)現(xiàn)記憶B 細(xì)胞在GBS 急性期顯著增加，并隨著病情的恢復(fù)而減少，進(jìn)一步的Spearman 相關(guān)分析顯示GBS 的臨床嚴(yán)重程度與患者外周血中記憶B 細(xì)胞的占比呈正相關(guān)。本研究結(jié)果與之一致，研究組患者記憶性B 細(xì)胞比例高于對照組；此外，進(jìn)一步Pearson相關(guān)性分析顯示CD4+TEM 及CD8+TEM 細(xì)胞占比與Hughes 殘疾評分、腦脊液蛋白、腦脊液IgG 及記憶性B 細(xì)胞占比均呈正相關(guān)，CD4+TEM 及CD8+TEM細(xì)胞與疾病臨床嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。在GBS 發(fā)病中發(fā)揮重要作用，并可能通過自身效應(yīng)功能調(diào)節(jié)B 細(xì)胞的分化參與GBS 的發(fā)病。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)GBS 患者存在記憶性T 細(xì)胞和記憶性B 細(xì)胞亞群免疫紊亂，外周血中CD4+TEM細(xì)胞、CD8+TEM 細(xì)胞及記憶性B 細(xì)胞占比升高可能是GBS 發(fā)病過程中的一個外周免疫機(jī)制。進(jìn)一步深入探討TEM 細(xì)胞參與GBS 發(fā)病的機(jī)制有望成為治療GBS 的新靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。