精液品質(zhì)相關(guān)基因在公牦牛血液中的表達(dá)研究

王耀梅，楊博璇，趙彥玲

（西藏農(nóng)牧學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

牦牛被稱為“高原之舟”，是西藏特有的動(dòng)物品種，促進(jìn)著當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)現(xiàn)有1 600余萬(wàn)頭牦牛[2]，是世界上擁有牦牛數(shù)量和品種類群最多的國(guó)家。娘亞牦牛是西藏自治區(qū)嘉黎縣的優(yōu)良牦牛品種，體型大、毛發(fā)多，其肉質(zhì)富含多種礦物質(zhì)、氨基酸和蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。近年來(lái)，牦牛獨(dú)特的遺傳資源已成為研究熱點(diǎn)。血液生理生化指標(biāo)可以快速客觀地反映牦牛機(jī)體的代謝水平和生理健康狀況，是判斷牦牛飼養(yǎng)管理水平的重要依據(jù)。大多數(shù)基因組生物的標(biāo)記物是從侵入性程序里獲得的組織中鑒定，如肝臟、乳腺、腎臟等。但在臨床試驗(yàn)或臨床篩選中，采取組織活檢往往是不現(xiàn)實(shí)的。因此，通過(guò)采用相對(duì)較易獲得的、具有代表性的一些組織，如血液、尿液、唾液等相關(guān)的分子標(biāo)記。這意味著血液有利于對(duì)生物機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)分析，逐步成為普遍使用的生物研究系統(tǒng)[3]。但還未見(jiàn)娘亞牦牛的相關(guān)報(bào)道，因此，本研究選取精液品質(zhì)有顯著差異的娘亞公牦牛為試驗(yàn)對(duì)象，研究相關(guān)基因在娘亞牦牛血液中的表達(dá)差異，旨在為娘亞牦牛的分子育種、早期選育和開(kāi)發(fā)血液DNA標(biāo)志物的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)對(duì)象為飼養(yǎng)在拉薩市當(dāng)雄縣當(dāng)雄牦牛凍精站的健康成年娘亞公牦牛。

1.2 試驗(yàn)材料

Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PBS溶液、Trans Start Eco Green qPCR SuperMix試劑盒、2×PCR Mix。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用假陰道法采集精液，采精后立即進(jìn)行精液品質(zhì)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果（表1）選取精液品質(zhì)有顯著差異的娘亞公牦牛，分為高品質(zhì)組（3頭）和低品質(zhì)組（3頭）。分別采集2組娘亞牦牛頸靜脈全血各1份，將采集到的血液樣本置于-80 ℃冰箱備用。

表1 娘亞牦牛精液品質(zhì)分析

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 研究表明，GAPDH是哺乳動(dòng)物中最好的管家基因之一[4]，用于研究多種哺乳動(dòng)物的基因表達(dá)。本試驗(yàn)選擇GAPDH基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中牦牛HSPB1、PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1和GAPDH基因的mRNA序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行熒光定量PCR的引物設(shè)計(jì)，南京擎科生物技術(shù)有限公司合成引物序列，引物信息詳見(jiàn)表2。

表2 引物信息

1.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) 采用Trizol方法提取血液樣品的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。先對(duì)cDNA樣品進(jìn)行5倍梯度稀釋，再對(duì)基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系（20 μL）：cDNA模板1 μL，2×TransStart Eco Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，激活熒光信號(hào)；95 ℃預(yù)變性10 min；95℃變性20 s，56 ℃退火20s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃、60 ℃、95 ℃各15 s做熔解曲線。每個(gè)樣品重復(fù)3次，最后采用2-△△CT方法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析數(shù)據(jù)，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。使用Sigmaplot 10.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行柱狀圖制作。

2 結(jié)果

通過(guò)對(duì)高品質(zhì)組、低品質(zhì)組娘亞公牦牛全血中6個(gè)精液品質(zhì)相關(guān)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這6個(gè)目的基因及內(nèi)參基因（GAPDH）的擴(kuò)增曲線均能依次起跳，熔解曲線為單一峰，可見(jiàn)沒(méi)有特異性擴(kuò)增，且擴(kuò)增效率在90%以上，符合試驗(yàn)質(zhì)量控制要求，可以用2-△△CT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

如圖1所示，HSPB1基因在高品質(zhì)組娘亞公牦牛血液中的mRNA表達(dá)量顯著低于低品質(zhì)組，而PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1這5個(gè)基因在高品質(zhì)組娘亞公牦牛血液中的表達(dá)量顯著高于低品質(zhì)組。

注：H代表高品質(zhì)組，L代表低品質(zhì)組，*表示差異顯著（P＜0.05）。圖1 精液品質(zhì)相關(guān)基因在高、低品質(zhì)組娘亞公牦牛血液中的mRNA表達(dá)

3 討論

血液能把分散在全身的組織調(diào)節(jié)連接起來(lái)，有研究表明，在一些組織中會(huì)表達(dá)的基因，有80%的可能性會(huì)在血細(xì)胞中表達(dá)[5]，因此血液具備更直接、更全面的代表各個(gè)性能特征的潛力。

HSPB1蛋白又稱HSP27（或HSP25）[6]，目前有大量研究證實(shí)，HSPB1在細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮著一定保護(hù)作用[7-8]。HSPB1可以通過(guò)增加谷胱甘肽還原酶的活性和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶使谷胱甘肽保持還原狀態(tài)，從而減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生[9]。機(jī)體在低氧刺激下會(huì)出現(xiàn)血管增生等生理反應(yīng)，以此增加血液氧氣運(yùn)輸能力，而HSPB1對(duì)血管生成平衡具有重要調(diào)控作用[10]，以上研究提示，HSPB1在調(diào)控氧化應(yīng)激水平中具有重要作用。PSMC5是泛素化蛋白識(shí)別和蛋白酶體轉(zhuǎn)移的調(diào)控成分之一[11]。除了調(diào)節(jié)蛋白酶體功能外，越來(lái)越多的證據(jù)表明PSMC5通過(guò)與轉(zhuǎn)錄活性啟動(dòng)子的相互作用和共激活子的招募直接參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控[12]。如有研究者發(fā)現(xiàn)在腺病毒感染過(guò)程中，PSMC5可以被招募到病毒轉(zhuǎn)錄因子E1A中，并能增強(qiáng)下游靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄[13]。PSMC5可能與p53轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，并以一種與p53招募相關(guān)的方式被招募到p53響應(yīng)性p21啟動(dòng)子中。然而，PSMC5在腫瘤尤其是CRC中的作用和功能尚未得到充分研究，而在本研究中，娘亞牦牛精子中PSMC5主要參與蛋白質(zhì)的分解代謝過(guò)程，對(duì)其精液品質(zhì)有一定影響，在血液中表達(dá)量不顯著且關(guān)于這一方面的研究報(bào)道也少有研究。PSMB3是蛋白酶體20S核心微粒的重要組成部分，被發(fā)現(xiàn)與癌癥有關(guān)，目前在牦牛中的相關(guān)研究較少。Blijlevens[14]等研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體β3亞基在非小細(xì)胞肺癌的臨床樣品中過(guò)表達(dá)。李天然[15]的研究表明，PSMB3基因在雌性橘小實(shí)蠅性成熟時(shí)卵巢組織表達(dá)較高，利用RNAi沉默PSMB3之后，卵巢發(fā)育受阻導(dǎo)致繁殖力下降。Yi等[16]發(fā)現(xiàn)，由于免疫阻斷PSMD8亞基可增加豬受精過(guò)程中的多精分化率，因此19S復(fù)合物的活性可能是豬受精過(guò)程中抗多精分化防御的速率限制因子。PSMD8亞基的確切功能尚不清楚。除了多泛素鏈識(shí)別，PSMD8可能通過(guò)與蛋白酶體相關(guān)的去泛素化酶相互作用參與底物去泛素化[17]或與具有去泛素化活性的19S非atpase亞基PSMD14相互作用。抑制去泛素化實(shí)際上可以通過(guò)促進(jìn)底物蛋白質(zhì)和共價(jià)連接的泛素標(biāo)簽的整體降解來(lái)增加蛋白酶體蛋白水解的速率[18-19]。Mitsuhiro等[20]的研究表明，PSMD8的部分缺失可以損害蛋白酶體的功能。因此，PSMD8是影響精子受精過(guò)程中的一個(gè)重要蛋白，但在本研究中PSMD8在血液中的表達(dá)量不顯著，且關(guān)于這方面的研究報(bào)道也少有研究。UGP2是核苷酸糖代謝中必不可少的八聚體酶[21]。Perenthaler等[22]的研究表明，UGP2蛋白較短亞型的缺失，可以導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞中功能性UGP酶減少，從而使糖原代謝改變、未折疊蛋白反應(yīng)上調(diào)以及神經(jīng)元過(guò)早分化。UGP2產(chǎn)物UDP-Glc是糖綴合物生物合成和半乳糖代謝所必需的，所以UGP2在細(xì)胞中占有核心地位[23]。有研究者[24]證明UGP2在腫瘤生長(zhǎng)及其調(diào)控細(xì)胞代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用。而本研究中發(fā)現(xiàn)UGP2在高品質(zhì)組的血液中表達(dá)量上調(diào)但不顯著，主要參與代謝過(guò)程，可能通過(guò)代謝過(guò)程影響精子活力，對(duì)牦牛精子的繁殖繁育能力產(chǎn)生一定影響。HSP90AA1基因定位于染色體14q32.2，編碼熱休克蛋白90a(HSP90a)[25]。HSP90AA1參與其客戶蛋白的操作、折疊、組裝和降解，對(duì)其內(nèi)部平衡至關(guān)重要，更重要的是許多HSP90AA1的客戶蛋白參與腫瘤發(fā)病過(guò)程，因此HSP90AA1在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存中發(fā)揮著重要作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)HSP90AA1表達(dá)水平在高品質(zhì)組顯著高于低品質(zhì)組。

4 結(jié)論

本研究條件下，HSPB1基因在高品質(zhì)組精液娘亞公牦牛血液中的mRNA表達(dá)量顯著低于低品質(zhì)組，而PSMC5、PSMD8、UGP2、PSMB3、HSP90AA1這5個(gè)基因在高品質(zhì)組娘亞牦牛血液中的表達(dá)量顯著高于低品質(zhì)組。本研究結(jié)果可為研究娘亞牦牛血液中基因表達(dá)與精液質(zhì)量的相關(guān)性提供基礎(chǔ)資料，也為娘亞牦牛的分子育種、早期選育和開(kāi)發(fā)血液DNA標(biāo)志物的相關(guān)研究提供參考。