心肌梗死中淋巴管新生關鍵差異基因的生物信息學分析及防治中藥的篩選*

齊育麟，白立鼎，邱先哲，司雨萌，李琳，王炎炎，陳璐，李玉紅，

（1.天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 301617；2.天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617）

心肌梗死（MI，以下簡稱心梗），是一種嚴重的冠心病類型，其主要特點是心肌因缺血而無法獲得足夠的氧氣而導致的心肌壞死[1]。心肌梗死會造成多種并發癥，包括心力衰竭、休克、心臟破裂等[2]。據《中國心血管健康與疾病報告2021》顯示，心梗死亡率仍處于高位，每年有16.7%的心梗患者由于心力衰竭而再次入院，現已成為危害人類健康的重大衛生問題[3]。

淋巴管新生是心臟健康的重要組成部分，在修復心肌梗死造成的心肌水腫、炎癥、纖維化中發揮著重要作用[4]。有研究表明，MI 后增強淋巴管內皮細胞中血管內皮生長因子受體3（VEGFR3）的表達能夠促進淋巴管新生，并通過引流梗死區域的組織間液來減輕心臟水腫，進而改善心功能[5]。此外，盡管中藥在治療MI 方面顯示出潛在的優勢，但是關于中藥通過促進淋巴管新生有益于MI 后心臟功能恢復的研究報道仍然較少。因此，本研究擬通過生物信息學分析，鑒定MI 患者中與淋巴管新生相關的關鍵基因，分析這些基因參與的生物途徑，并利用機器學習方法篩選出核心基因。通過對核心基因和相關中藥的關聯分析，旨在為基于淋巴管新生治療MI 的中藥研究及臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 數據篩選與預處理 在GEO 數據庫（http：//www.ncbi.nim.nih.gov/geo/）中以“myocardial infarction”為關鍵詞檢索相關數據集，根據數據集提供的相關信息，獲得所需芯片GSE66360 作為訓練集。GSE66360 共有99 個樣品，其中包括了49 個MI 患者與50 個健康人樣品。選取GSE48060 作為驗證集，GSE48060 共有52 個樣品，其中包括了31 個MI患者與21 個健康人樣品。注釋數據后通過“limma”包對GSE66360 與GSE48060 中的表達譜基因進行差異化分析，同時根據|log2FC|＞1&FDR＜0.05 對于基因進行差異化篩選，得到差異表達譜文件diffGeneExp。使用在線生物信息學分析工具HIPLOT 網站（http：//hiplot.com.cn）對diffGeneExp進行基因聚類可視化分析。

1.2 淋巴管新生相關基因的篩選 在GeneCards 數據庫（http：//www.genecards.org）中以“lymphangiogenesis”為關鍵詞檢索相關基因構建淋巴管新生基因庫，利用“tidyverse”包將diffGeneExp 與淋巴管新生數據庫取交集，得到心梗-淋巴管新生DEGs 集。

1.3 Metascape 分析 利用Metascape 基因功能分析數據庫（http：//www.metascape.org）將心梗-淋巴管新生DEGs 進行初步的功能與通路分析。

1.4 功能富集分析 對于心梗-淋巴管新生DEGs進行GO 與KEGG 富集分析，使用“org.Hs.eg.db”包對于DEGs 進行GO 與KEGG 注釋，使用在線生物信息學分析工具HIPLOT 網站對注釋信息進行富集分析。

1.5 GSEA 富集分析 利用“limma”“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”與“enrichPlot”包對GSE66360 數據集進行GSEA 富集分析，以FDR＜0.05 篩選在正常人與MI 患者中表達最顯著的前5 條通路。

1.6 Lasso 回歸篩選特征基因 利用“glmnet”包進行Lasso 回歸分析，選擇交叉誤差最小的點篩選心梗-淋巴管新生DEGs 中的特征基因。

1.7 SVM-RFE 機器學習篩選特征基因 利用“e1701”，“kernlab”與“caret”包對心梗-淋巴管新生DEGs 進行機器學習，使用“svmRadial”方法選擇交叉驗證誤差最小的點篩選特征基因。

1.8 交集特征基因的提取 分別提取Lasso 回歸分析與SVM-RFE 機器學習中的特征基因，利用在線生物信息學分析平臺微生信（http：//www.bioinformatics.com）取二者交集構建特征基因集并進行可視化。

1.9 繪制受試者工作特征（ROC）曲線 利用“pROC”包繪制每個特征基因的ROC 曲線，判斷特征基因在MI 中的預測診斷能力，以ROC 曲線下面積（AUC）＞0.8 進行篩選，得到預測診斷效果較好的基因。

1.10 二次驗證與相關性分析 利用“limma”包與“ggpubr”包對MI 相關的驗證集GSE48060 中基因表達譜進行差異化分析并與預測診斷效果較好的基因進行二次驗證，構建核心基因集。此外，利用“corrplot”與“circlize”包對核心基因集進行相關性分析。

1.11 免疫細胞浸潤分析 基于CIBERSORT 算法，按照P＜0.05 的標準計算22 種免疫細胞在GSE66360數據集樣本中的占比情況，對MI 患者及健康人血液樣本中的免疫細胞進行差異分析，并用“reshape2”，“ggpubr”與“ggplot2”包對結果進行可視化。

1.12 驗證核心基因與免疫細胞的相關性分析 利用“limma”，“reshape2”，“tidyverse”與“ggplot2”包將核心基因與免疫細胞進行相關性分析。

1.13 心梗-淋巴管新生DEGs 的中藥篩選 將核心基因作為預測靶標，在醫學本體信息檢索數據庫（https：//coremine.com）中篩選對各預測靶標具有生物學效應的前5 位中藥，并進行四氣五味、歸經分析。

2 結果

2.1 心梗-淋巴管新生DEGs 的篩選 研究設計如圖1 所示，從GEO 數據庫中下載GSE66360 作為訓練集，GSE48060 作為驗證集開展實驗。用“limma”包篩選訓練集中心梗患者血液樣品中的差異基因，共得到390 個差異基因，其中80 個上調基因與310個下調基因（圖2A）。從GeneCards 數據庫下載與淋巴管新生相關的數據集，并與訓練集中的差異基因取交集，共得到26 個在心梗患者血液中與淋巴管新生存在聯系的差異基因，構建心梗-淋巴管新生DEGs 集（圖2B）。并對心梗-淋巴管新生DEGs 集進行基因相關性分析，結果顯示除XIST 外，其他基因均表現出不同程度的協同作用（圖2C）。

圖1 研究設計示意圖

圖2 差異基因篩選

2.2 Metascape 分析 如圖3 所示，將26 個心梗-淋巴管新生DEGs 輸入Metasacpe，對基因的生物學功能進行初步分析，發現差異基因主要參與了白介素信號通路、脂多糖反應、細胞運動、肺纖維化與一氧化氮合成等生物學過程。

圖3 Metascape 分析

2.3 功能富集分析 為進一步探究心梗-淋巴管新生DEGs 的生物學功能，對26 個差異基因進行GO與KEGG 富集分析。GO 結果顯示，在生物過程中這些基因主要參與一氧化氮生物合成、脂多糖反應等方面。在細胞組分中與三級顆粒腔、血小板a 顆粒腔、內質網腔顯著相關。在分子功能中與細胞因子活性、配體結合活性、黏多糖結合等生物學功能相關（圖4A）。KEGG 富集分析結果，DEGs 參與了瘧疾（Malaria）、白細胞介素-17（IL-17）、核因子κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子（TNF）、脂質與動脈粥狀硬化（Lipid and atherosclerosis）等信號通路（圖4B）。

2.4 GSEA 分析 如圖5A、5B 所示，為探究MI 患者與健康人的差異生物學功能，對GSE66360 進行GSEA 分析，結果顯示正常人的基因集涉及分子功能與生物學過程主要包括了趨化因子信號通路、補體與凝血信號通路、細胞因子-受體相互作用通路，而MI 患者基因集涉及分子功能與生物學過程主要包括了N 聚糖生物合成信號通路、核苷酸切割修復信號通路、免疫缺陷等信號通路。

圖5 GSEA 分析

2.5 機器學習模型與關鍵基因篩選 為了評價心梗-淋巴管新生DEGs 的診斷潛力，分別用Lasso 回歸與SVM-REF 機器學習的方法對心梗-淋巴管新生DEGs 進行篩選，以均方誤差最小時為最佳診斷模型，可見Lasso 回歸分析篩選得到15 個基因構成的診斷模型（圖6A）。SVM-RFE 算法共篩選出了28 個特征基因（圖6B），將Lasso 與SVM-RFE 算法得到的特征基因取交集，共鑒定出15 種特征基因（ADM、AREG、CEBPD、EDN1、EPAS1、IL1B、IL1RN、PELI1、PFKFB3、PLAU、SULF2、THBS1、TNF、TNFAIP6、XIST）用于后續分析（圖6C）。

圖6 機器學習模型與關鍵基因篩選

2.6 二次驗證與相關性分析 如圖7A 所示，對上述的15 個特征基因繪制ROC 曲線，以ROC 曲線下面積＞0.8 進行篩選共得到了11 個預測診斷基因（ADM、AREG、EDN1、EPAS1、IL1B、IL1RN、PELI1、PFKFB3、PLAU、SULF2、THBS1）。此外，對驗證集GSE48060 表達譜進行基因差異化分析，與11 個預測診斷基因進行對比，最終得到了4 個在兩個數據集中均具有預測診斷價值的核心基因（ADM、IL1B、IL1RN、PFKFB3）（圖7B）。并對這4 個核心基因進行基因間相關性分析，結果顯示4 個基因均呈正相關（圖7C）。

圖7 二次驗證與相關性分析

2.7 免疫浸潤分析 如圖8 所示，對GSE66360 數據集進行免疫浸潤分析，結果顯示與健康人相比，MI 患者血液樣品中含更高的濾泡輔助性T 細胞、調節性T 細胞、靜息NK 細胞、活化的NK 細胞、單核細胞、M2 型巨噬細胞、活化的樹突狀細胞、活化的肥大細胞、嗜酸性粒細胞與中性粒細胞，與此同時，MI 患者的CD8T 細胞、CD4 記憶T 細胞、γδT 細胞與M0 巨噬細胞的數量顯著下降。

圖8 心梗的免疫浸潤分析

2.8 核心基因與免疫細胞的相關性分析 如圖9所示，通過對免疫細胞與核心基因進行相關性分析，結果顯示PFKFB3 與調節性T 細胞呈負相關；IL1RN、IL1B 與活化肥大細胞、中性粒細胞、活化NK 細胞等免疫細胞呈正相關，而與CD4 記憶T 細胞、靜息肥大細胞呈負相關。此外，ADM 基因高表達時，活化肥大細胞、中性粒細胞與嗜酸性粒細胞的數量也會同時增多。

圖9 淋巴管新生與免疫細胞的相關性分析

2.9 核心基因的中藥篩選 經過篩選共得到了18味中藥（圖10A）。四氣五味、歸經分析結果顯示，藥物四氣多為寒、溫，五味多屬苦、甘、辛，歸經主要集中于肺、腎、脾經（圖10 B、10C、10D）。

圖10 中藥篩選與分類分析

3 討論

MI 是由動脈斑塊引起進入心臟的攜氧血液減少而導致的缺氧性心肌損傷，常伴隨著炎癥、水腫與心肌纖維化，其臨床表現為胸痛、呼吸急促、出汗、心臟跳動異常等[6]。盡管近年來在MI 治療方面取得了進展，如連續藥物治療、經皮冠狀動脈介入手術治療等，但MI 發病率和死亡率仍處于高位。因此尋找新的治療方式，特別是治療靶點，對預防疾病的進一步發展具有重要意義[7]。

淋巴管系統幾乎滲透到所有組織與器官，在維持間質體液穩態與免疫監控中發揮著重要作用[8]。近年來，越來越多的證據表明淋巴管新生在修復心肌梗死造成的心臟損傷中發揮著重要的作用。心肌梗死后滲出的炎性細胞會產生血管內皮生長因子VEGF-C 與VEGF-D，使附近淋巴管中的VEGFR表達增多，促進梗死邊緣區與梗死區的淋巴管新生，引流梗死區的組織間液，排出缺氧后的組織代謝產物，緩解心臟水腫，改善心臟功能[9]。在本研究中，GO富集分析顯示交集基因主要與一氧化氮合成、脂多糖反應等生物學功能相關。KEGG 富集分析結果顯示基于淋巴管新生治療MI 可能與瘧疾、IL-17、NFKB、TNF 等信號通路有關。IL-17 信號通路可刺激VEGF-C 的產生促進淋巴管新生[10]，而是否能夠通過干預該通路治療MI 還有待進一步的研究。

基于機器學習算法，本研究中共篩選4 個具有診斷意義的核心基因。PFKFB3 是一種將果糖-6-二磷酸轉化為果糖-2，6-二磷酸的代謝酶，是限速酶磷酸果糖激酶-1 最有效的變構激活劑[11]，其生物學活性主要是通過激活磷酸果糖激酶-1 參與糖酵解反應。有研究表明靶向抑制PFKFB3 被證實與淋巴管新生相關，其作用機制可能是通過抑制巨噬細胞中PFKFB3 的表達，刺激該免疫細胞中VEGF-C的產生，進而促進了淋巴管新生[12-13]。然而本研究僅發現PFKFB3 與適應性T 細胞呈負相關，并未發現PFKFB3 與巨噬細胞之間的相關性，是否適應性T細胞中的分泌的某種信號因子影響了巨噬細胞中PFKFB3 的表達還有待進一步研究。IL1RN 具有編碼IL-1Ra 的功能，有證據表明上調IL-1a 可以減少IL-1 引起的炎癥反應[14]。本研究發現IL1RN 在MI患者為上調基因，目前尚未有關于IL1RN 基因與淋巴管新生和MI 的文獻報道。IL1B 又稱分解代謝素，是白細胞介素-1 細胞因子家族的成員。IL1B 參與多種自身免疫性炎癥反應和多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡[15]。越來越多的證據表明IL1B與MI 的治療相關。在MI 大鼠模型中，microRNA-132 通過下調IL-1B 抑制心肌梗死后的大鼠心肌細胞凋亡改善心臟功能[16]。ADM 是一種在心臟、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞中均有所表達的血管擴張肽[17]，有研究發現ADM 與淋巴管新生相關，在ADM 過表達小鼠心梗模型中發現ADM 可以通過Cx43 驅動淋巴管新生與心臟功能恢復[18]。

中醫將MI 歸屬于“心痛”“胸痹”范疇[19]，其發病因素復雜，主要有寒邪內侵、飲食不節、情志失調、年老體弱等，其病機屬本虛標實，虛為陰陽氣血虧虛，實為陰寒、痰濁、瘀血。本研究對心梗-淋巴管新生核心基因進行中藥預測與篩選，發現預測的藥物四氣或溫或寒，針對陰陽氣血虧虛，多用溫藥以補陽虛，寒藥以補陰虛；五味多屬苦、甘、辛，針對MI的陰寒、瘀血的病因病機，用辛味中藥溫通、散寒、活血；針對致病因素痰濁，辛苦類中藥多溫燥化寒痰，甘苦咸涼類中藥化熱痰。歸經主要集中于肺、腎、脾經，與眾多學者從肺、腎、脾論治胸痹的觀點一致[20]。

綜上，本研究以生物信息學、Lasso 回歸、SVMRFE 機器學習等方法對于MI 患者血液中與淋巴管新生相關的差異基因進行篩選，共得到了4 個具有潛在治療意義的基因靶點（PFKFB3、IL1B、IL1RN、ADM），同時基于這4 個靶點預測了相關防治中藥，為后續基于淋巴管新生研究治療MI 的中藥奠定了堅實的基礎[21-22]。