山東省規(guī)模化牛場(chǎng)藍(lán)舌病血清學(xué)調(diào)查

陳偉，斯張國(guó)，祝夕超，藺曉月，李法凱，孫圣福*

1.山東省濟(jì)南市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，濟(jì)南 250099；

2.山東省萊州市程郭畜牧獸醫(yī)站，山東煙臺(tái) 261437；

3.山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，濟(jì)南 250100

藍(lán)舌?。╞luetongue，BT）是由藍(lán)舌病病毒（blue‐tongue virus，BTV）引起的1 種傳染性疫病，主要感染牛羊等反芻動(dòng)物，尤其是綿羊，感染后主要表現(xiàn)為病羊精神沉郁，食欲喪失，血樣下痢，頰黏膜和胃腸道黏膜呈嚴(yán)重的卡他性炎癥，常因蹄冠上皮脫落而跛行，被毛斷裂，甚至全部脫落[1]。牛感染后癥狀較輕，主要表現(xiàn)為高熱和舌頭變藍(lán)，鼻黏膜和口腔黏膜嚴(yán)重充血等癥狀[2]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）將藍(lán)舌病列為須通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。藍(lán)舌病最早于18 世紀(jì)發(fā)現(xiàn)于南非的綿羊，近年來(lái)，在亞洲、歐洲和非洲的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生綿羊或牛藍(lán)舌病疫情，我國(guó)于1979年首次在云南師宗發(fā)現(xiàn)該病并分離到藍(lán)舌病病毒。目前，全國(guó)已有云南、新疆、甘肅、陜西、四川等29個(gè)省（市）區(qū)檢出羊BTV抗體，許多省份的牛群中也發(fā)現(xiàn)BTV 抗體陽(yáng)性[3-6]。目前，BTV 有29 個(gè)血清型[7]，不同血清型之間交叉保護(hù)性較低，該病主要通過(guò)生物安全控制進(jìn)行防控。本研究采集2022 年山東省規(guī)?；?chǎng)血清樣品，采用ELISA 方法進(jìn)行抗體檢測(cè)，了解山東省牛藍(lán)舌病的帶毒狀況，為后續(xù)該病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2022 年6 月，全省范圍內(nèi)抽檢養(yǎng)牛密集地市（濟(jì)南、泰安、日照、東營(yíng)、德州和聊城等市），群體內(nèi)按照發(fā)現(xiàn)疫病的策略進(jìn)行抽樣，置信區(qū)間95%，試驗(yàn)敏感性100%，預(yù)期流行率為10%進(jìn)行抽樣，抽樣場(chǎng)點(diǎn)存欄量50～500 頭，每個(gè)場(chǎng)點(diǎn)抽檢血清樣品30份左右，共采集25 個(gè)牛場(chǎng)，采集樣品750 份。去除不合格血清12 份，合格血清樣品共738 份，其中，奶牛場(chǎng)13個(gè)，采集血清樣品383份，肉牛場(chǎng)12個(gè)，采集血清樣品355份。

牛藍(lán)舌病抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司，酶標(biāo)儀為T(mén)hermo-MK3（美國(guó)），移液器為Eppendorf（德國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

試劑使用前需要恢復(fù)室溫（18～26 ℃），待檢血清樣品、陰陽(yáng)性對(duì)照用稀釋液做5倍稀釋，混勻。將100 μL 預(yù)孵育的樣品加入至包被有抗原的微量反應(yīng)板，封板在18～26 ℃條件下孵育45 min，每孔用300 μL洗滌溶液洗滌3次，加入100 μL稀釋好的酶標(biāo)抗體，封板在18～26 ℃條件下孵育30 min，再次洗滌，加入100 μL TMB 底物液避光在18～26 ℃條件下孵育10 min，加入100 μL 終止液，450 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定

計(jì)算樣品的S/N值：

若樣品的S/N≥0.8，判定為BTV抗體陰性；

若樣品的S/N＜0.7，判定為BTV抗體陽(yáng)性；

若樣品 的0.7≤S/N＜0.8，判定為BTV 抗 體可疑。

待檢樣品BTV抗體檢測(cè)為陽(yáng)性，判定該樣品為陽(yáng)性；場(chǎng)群內(nèi)有1份及以上樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，則該場(chǎng)群判定為陽(yáng)性場(chǎng)。個(gè)體陽(yáng)性率為該場(chǎng)陽(yáng)性樣品數(shù)量占抽樣數(shù)量的百分比；群體陽(yáng)性率為陽(yáng)性場(chǎng)點(diǎn)數(shù)量占抽樣場(chǎng)點(diǎn)數(shù)量的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛場(chǎng)藍(lán)舌病抗體檢測(cè)情況

共采集13 個(gè)奶牛場(chǎng)，血清樣品383 份，采用ELISA 方法進(jìn)行藍(lán)舌病抗體檢測(cè)（表1），其中，2 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)檢測(cè)到陽(yáng)性樣品，群體陽(yáng)性率15.38%；383份樣品中2 份樣品為陽(yáng)性，個(gè)體表觀陽(yáng)性率為0.52%（95%CI：0.06%～1.87%）。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，個(gè)別奶牛場(chǎng)檢測(cè)到藍(lán)舌病抗體陽(yáng)性樣品，群體陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率均不高。

表1 奶牛場(chǎng)藍(lán)舌病抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 肉牛場(chǎng)藍(lán)舌病抗體檢測(cè)情況

共采集12 個(gè)肉牛場(chǎng)，血清樣品355 份，采用ELISA 方法進(jìn)行藍(lán)舌病抗體檢測(cè)（表2），其中，1 個(gè)場(chǎng)點(diǎn)檢測(cè)到陽(yáng)性樣品，群體陽(yáng)性率8.33%；355 份樣品中1 份樣品為陽(yáng)性，個(gè)體表觀陽(yáng)性率為0.28%（95%CI：0.01%～1.56%）。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，僅1個(gè)肉牛場(chǎng)檢測(cè)到藍(lán)舌病抗體陽(yáng)性樣品，群體陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率均不高。

表2 肉牛場(chǎng)藍(lán)舌病抗體檢測(cè)結(jié)果

3 討論

采用IDEXX 藍(lán)舌病抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)待檢的25 個(gè)牛場(chǎng)738 份樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)，群體陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率分別為12.00% 和0.41%（95%CI：0.08%～1.18%），由于待檢的牛均未進(jìn)行藍(lán)舌病的免疫，抗體陽(yáng)性表明牛感染過(guò)藍(lán)舌病，說(shuō)明在山東省部分規(guī)?；?chǎng)存在藍(lán)舌病感染的風(fēng)險(xiǎn)。

奶牛場(chǎng)的群體陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率分別為15.38%和0.52%，肉牛場(chǎng)的群體陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率分別為8.33%和0.28%。從牛的不同品種來(lái)看，奶牛的群體陽(yáng)性率和個(gè)體陽(yáng)性率均高于肉牛場(chǎng)，可能與奶牛對(duì)藍(lán)舌病的易感性較肉牛高有關(guān)。由于采樣場(chǎng)點(diǎn)和采樣數(shù)量的局限性，本研究不能完全反映2022年山東省規(guī)?；?chǎng)藍(lán)舌病的流行情況，但是也能反映部分牛場(chǎng)藍(lán)舌病的感染狀況。

牛感染藍(lán)舌病癥狀較輕，主要表現(xiàn)為口腔黏膜充血、潰瘍、流涎、口鼻分泌物增加，乳房淺表性壞死、滲出等，小?？杀憩F(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀[8]。該病呈全球性分布，主要疫區(qū)分布在歐洲，2015—2020年，歐洲累計(jì)因藍(lán)舌病疫情死亡的牛羊2.5 萬(wàn)頭（只），亞洲、非洲和美洲累計(jì)病死的牛羊1.8 萬(wàn)頭（只）[9]。我國(guó)目前已經(jīng)分離到16 個(gè)血清型，其中BTV-1、BTV-8和BIT-16已經(jīng)在我國(guó)廣泛流行，尤其是云南等蚊蟲(chóng)密集的省份以及新疆、內(nèi)蒙等與蒙古國(guó)、中亞國(guó)家陸地連接的地域，由于其氣候特點(diǎn)或養(yǎng)殖模式的原因，BTV的流行較為嚴(yán)重。

由于血清型較多，不同血清型之間交叉保護(hù)力較差，雖然目前已經(jīng)有弱毒苗和滅活疫苗供臨床應(yīng)用，但是防控效果不佳，而且BTV 的傳播方式多元化，除了通過(guò)帶毒牛、器具的傳播外，還可以通過(guò)精液、胎盤(pán)、初乳等感染犢牛，也可以通過(guò)庫(kù)蠓、蜱、蚊蟲(chóng)等節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)行傳播，因此，該病的防控也需要采取綜合的防控措施。①做好引種檢測(cè)，避免從疫區(qū)或者感染藍(lán)舌病的牛場(chǎng)引種，引種后做好疫病或抗體的檢測(cè)，檢測(cè)合格后隔離45 d 才可混群飼養(yǎng)；②強(qiáng)化疫病檢測(cè)，牛感染BTV 多呈隱性感染，一旦出現(xiàn)癥狀，BTV 已經(jīng)在牛群中流行，因此，需要定期或不定期地對(duì)牛群進(jìn)行血清學(xué)或病原學(xué)檢測(cè)，一旦檢測(cè)到陽(yáng)性牛，立即采取措施；③避免不同畜種混養(yǎng)，BTV 可以感染羊、牛、駱駝等在內(nèi)的多種反芻動(dòng)物，如同時(shí)飼養(yǎng)其他反芻動(dòng)物，一旦發(fā)生藍(lán)舌病，BTV 容易在場(chǎng)群中不斷復(fù)制，難以消除；④做好消毒滅源工作，牛場(chǎng)內(nèi)勤消毒，將病毒及時(shí)殺滅，夏秋雨水季節(jié)，做好蚊蟲(chóng)等蟲(chóng)媒的防范工作，避免蚊蟲(chóng)攜帶病毒傳播給健康牛。