維胺酯原料藥的有關(guān)物質(zhì)分析

李鈺鑫，蘭文*，劉雁鳴（1.湖南省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，長(zhǎng)沙 410001；2.國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410001）

維胺酯，化學(xué)名為N-（4-乙氧碳基苯基）維甲酰胺，因結(jié)構(gòu)與全反式維A 酸類似，其作用機(jī)制與13-順維A 酸及芳香維A 酸較相似，但刺激性低于維A酸，不良反應(yīng)比維A酸少，治療指數(shù)為維A酸的10倍[1-2]。維胺酯能夠調(diào)節(jié)和控制上皮細(xì)胞分化與生長(zhǎng)，減少皮脂分泌，抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的角化過程，使角化異常恢復(fù)正常，發(fā)揮抗雄激素、抗炎、調(diào)節(jié)免疫及預(yù)防瘢痕形成等作用，用于治療各種痤瘡、角化異常性皮膚病等，同時(shí)對(duì)魚鱗病、銀屑病（牛皮癬）、苔蘚類皮膚病、黏膜病及結(jié)締組織等疾病也有一定療效[3-5]。維胺酯為我國(guó)自行研制的維A酸類藥物，維A酸作為起始原料與三氯化磷反應(yīng)轉(zhuǎn)化為維A酰氯，再與苯佐卡因反應(yīng)生成維胺酯，反應(yīng)路線如圖1所示。目前國(guó)內(nèi)僅3家維胺酯原料生產(chǎn)企業(yè)，國(guó)內(nèi)外藥典均未收載該品種[6-7]，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品地標(biāo)升國(guó)標(biāo)第二冊(cè)[WS-10001-（HD-0164）-2002]和原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局標(biāo)準(zhǔn)YBH14602008，與《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品地標(biāo)升國(guó)標(biāo)第二冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)比較，原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局標(biāo)準(zhǔn)YBH14602008增訂了有關(guān)物質(zhì)及殘留溶劑檢查，有關(guān)物質(zhì)方法僅對(duì)雜質(zhì)總量進(jìn)行控制。本文在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020年版四部指導(dǎo)原則[8]，首次建立了同時(shí)測(cè)定維胺酯中維A酸和其他雜質(zhì)的HPLC方法；并采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[9-10]結(jié)合強(qiáng)制降解試驗(yàn)，對(duì)主要未知雜質(zhì)峰進(jìn)行定性分析并推測(cè)雜質(zhì)來源。采用ADMET Predictor 軟件[11]對(duì)維胺酯及其主要雜質(zhì)進(jìn)行毒性預(yù)測(cè)，為制訂維胺酯原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

Ultimate3000型高效液相色譜儀（美國(guó)戴安公司）；十萬(wàn)分之一MS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；1290-6550型高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國(guó)安捷倫公司）。

維胺酯對(duì)照品（純度：99.03%，批號(hào)：190303，C公司，湖南省藥品檢驗(yàn)研究院標(biāo)定）；維A酸對(duì)照品（純度：99.4%，批號(hào)：100307-200902，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，Burdick ＆Jackson）；水為純化水；其他試劑均為分析純；15批維胺酯原料藥（A公司，批號(hào)分別為170101、170102、170103、181002；B公司，批號(hào)分別為161205、161206、190303、190304、190305；C公司，批號(hào)分別為V2A20160501、V2A20160502、V2A20160503、VIA-20190401、VIA-20190402、VIA-20190403）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（93∶7）；流速：1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 取維胺酯約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量超聲使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取維A酸對(duì)照品約12.5 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇適量超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 對(duì)照溶液的制備 精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液的制備 取維胺酯對(duì)照品適量，加甲醇超聲溶解并稀釋成每1 mL中約0.5 mg的溶液，取溶液適量，于（2500±500）lx光照強(qiáng)度下照射30 min，即得。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 專屬性 取“2.2”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液及稀釋劑（甲醇）各20 μL進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示維胺酯的出峰時(shí)間約15.6 min，維A酸的出峰時(shí)間約6.363 min，峰形對(duì)稱性較好，維A酸理論塔板數(shù)在11 000以上，主峰與已知雜質(zhì)維A酸及其他未知雜質(zhì)峰均有效分離。空白溶劑對(duì)測(cè)定無干擾，結(jié)果見圖2。

2.3.2 強(qiáng)制降解試驗(yàn) 采用光照、酸、堿、氧化、高溫等劇烈條件對(duì)本品（批號(hào)：170101）進(jìn)行破壞性降解處理。取本品25 mg，平行5份，分置50 mL量瓶中，經(jīng)以下條件進(jìn)行破壞處理：① 光照破壞[于照度（2500±500）lx下放置5 d]；② 酸破壞（1 mol·L－1鹽酸溶液0.5 mL，放置4 h，加5 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性）；③ 堿破壞（1 mol·L－1氫氧化鈉溶液0.5 mL，放置4 h，加5 mol·L－1鹽酸溶液調(diào)至中性）；④ 氧化破壞（3%過氧化氫溶液1 mL，放置4 h）；⑤ 高溫破壞（置150℃烤箱中放置4 h，放冷）。結(jié)果表明：光照破壞試驗(yàn)中，在主峰相對(duì)保留時(shí)間0.9處的未知雜質(zhì)峰面積明顯增加，命名該雜質(zhì)為雜質(zhì)A，說明本品易被光破壞，后期試驗(yàn)均采用避光操作；其他破壞試驗(yàn)產(chǎn)生了少量雜質(zhì)，各雜質(zhì)均能與主峰完全分離，表明本色譜系統(tǒng)專屬性良好。在各破壞試驗(yàn)記錄的色譜圖中，主峰保留時(shí)間2倍以后的基線平穩(wěn)且沒有檢測(cè)出其他雜質(zhì)峰，故供試品溶液的采集時(shí)間擬定為主峰保留時(shí)間的2倍，見圖3。

圖3 維胺酯強(qiáng)制降解試驗(yàn)色譜圖Fig 3 HPLC chormatogram for forced degradation test of viaminate

2.3.3 維A酸的線性關(guān)系考察 取維A酸對(duì)照品20.43 mg，置100 mL棕色量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取維A酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇依次稀釋配成質(zhì)量濃度約為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、50.0 μg·mL－1的系列對(duì)照品溶液。精密量取上述溶液各20 μL，依法測(cè)定，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y＝136.34X－15.255，r＝1.000，結(jié)果表明，維A酸在0.1015～50.76 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.4 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下第4份溶液，精密量取20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果RSD為0.67%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 回收試驗(yàn) 精密稱取已知維A酸雜質(zhì)量（0.052%）的樣品（批號(hào)：170101）約25 mg 6份，分別置50 mL棕色量瓶中，各精密加入維A酸對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為0.1244 mg·mL－1）1 mL，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算回收率，平均回收率為98.12%，RSD為0.53%。

2.3.6 定量限及檢測(cè)限考察 取維胺酯和維A酸對(duì)照品各適量，逐級(jí)稀釋，各取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。設(shè)定量限S/N＝10，檢測(cè)限S/N＝3，得維胺酯和維A酸的定量限依次為0.058 μg·mL－1和0.074 μg·mL－1，檢測(cè)限依次為0.020 μg·mL－1和0.039 μg·mL－1，

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.3.5”項(xiàng)下6份供試品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得維A酸的量為0.59%，RSD為1.0%；其他單個(gè)雜質(zhì)量為0.28%，RSD為1.0%；各雜質(zhì)總量為1.0%，RSD為1.2%。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h后，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果供試品溶液中維A酸、其他單個(gè)雜質(zhì)及各雜質(zhì)的總峰面積的RSD分別為1.3%、0.88%及0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 耐用性試驗(yàn) 使用3個(gè)品牌色譜柱[Agilent Eclipse XDB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Welch Ultimate X C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、CAPCELL TYPE MGⅡ（4.6 mm×250 mm，5 μm）]調(diào)整柱溫、流速、流動(dòng)相比例等色譜條件進(jìn)行耐用性考察，結(jié)果峰形和分離均較好，精密稱取維胺酯（批號(hào)：170101）約25 mg 依法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果見表1。

表1 維A酸的耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Durability of retinoic acid

2.4 樣品含量的測(cè)定

取3家公司的15批樣品依法測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，維A酸含量以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算，其他雜質(zhì)含量采用主成分自身對(duì)照法計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果(%)Tab 2 Related substances of samples (%)

2.5 未知雜質(zhì)質(zhì)譜分析

樣品的測(cè)定結(jié)果表明，3家公司的15批樣品均檢出降解雜質(zhì)A，且含量達(dá)0.1%，可能存在安全隱患，有必要對(duì)未知雜質(zhì)進(jìn)行歸屬。本文采用高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀[10]，在ESI負(fù)離子模式下，得到該未知雜質(zhì)的一、二級(jí)質(zhì)譜信息，結(jié)果顯示雜質(zhì)A與維胺酯的分子離子峰和離子碎片幾乎相同，結(jié)果見圖4。

2.6 雜質(zhì)毒性預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)

使用Chemdraw軟件畫出維胺酯及雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式并保存為“.mol”格式，導(dǎo)入ADMET Predictor軟件，對(duì)維胺酯及維A酸、雜質(zhì)A的毒理性質(zhì)參數(shù)進(jìn)行全面預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示三者主要毒性為肝臟毒性，另外還有潛在致敏性和生殖毒性，維A酸的預(yù)測(cè)毒性低于維胺酯，雜質(zhì)A與維胺酯的毒性預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，結(jié)果見表3。

表3 ADMET Predictor 軟件預(yù)測(cè)結(jié)果Tab 3 Predict outcomes by ADMET Predictor software

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

維胺酯脂溶性較強(qiáng)，且遇光易變質(zhì)，產(chǎn)生的降解雜質(zhì)與主峰較難達(dá)到基線分離，故選擇光破壞溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)YBH14602008有關(guān)物質(zhì)檢查方法采用C18柱，采用不同品牌、不同型號(hào)的C18柱，適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相比例，均能將維胺酯與光降解雜質(zhì)有效分離。

3.2 溶劑的選擇

分別考察用流動(dòng)相、甲醇及水作為溶劑時(shí)對(duì)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的影響，結(jié)果顯示當(dāng)使用水為溶劑時(shí)，樣品幾乎不溶解；當(dāng)使用流動(dòng)相為溶劑時(shí)，樣品很難溶解。最終選擇甲醇作為稀釋劑，供試品溶解完全，且稀釋劑與主成分維胺酯對(duì)待測(cè)組分無干擾。

3.3 波長(zhǎng)的選擇

截取系統(tǒng)適用性溶液DAD圖中維胺酯的紫外光譜圖、對(duì)照品溶液DAD圖中維A酸的紫外光譜圖、供試品溶液DAD圖中主要雜質(zhì)的紫外光譜圖及破壞試驗(yàn)DAD圖中主要降解雜質(zhì)的紫外光譜圖，結(jié)果顯示：維胺酯在370 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，特殊雜質(zhì)維A酸、雜質(zhì)A及其他主要雜質(zhì)在該波長(zhǎng)處都有一定的吸收，故選擇370 nm作為有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 雜質(zhì)A的來源分析

強(qiáng)制降解試驗(yàn)表明，維胺酯光照敏感，在強(qiáng)光條件下降解產(chǎn)物雜質(zhì)A的峰面積明顯增加，進(jìn)一步對(duì)該雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜圖與維胺酯質(zhì)譜圖一致，經(jīng)企業(yè)調(diào)研和文獻(xiàn)查閱，維胺酯為全反式維A酸的衍生物，其為全反式維A酸的酸根經(jīng)酰化后，與氨基反應(yīng)生成的衍生物，因此也為全反式結(jié)構(gòu)，且維A酸見光易轉(zhuǎn)化為其順式異構(gòu)體異維A酸，推斷其為維胺酯的同分異構(gòu)體（或順式維胺酯）。雜質(zhì)A來源分析見圖5。

圖5 雜質(zhì)A可能來源Fig 5 Formation mechanism of impurity A

3.5 限度擬訂

維A酸為維胺酯合成的起始原料，直接反映維胺酯生產(chǎn)工藝的優(yōu)劣；雜質(zhì)A為維胺酯的主要降解雜質(zhì)，反映其儲(chǔ)存條件下質(zhì)量的優(yōu)劣，故對(duì)雜質(zhì)維A酸及雜質(zhì)A進(jìn)行質(zhì)量控制。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)中僅對(duì)總雜質(zhì)量進(jìn)行控制，限度為2.0%；參考ADMET Predictor軟件毒性分析結(jié)果：維A酸、雜質(zhì)A同維胺酯的毒性相當(dāng)；同時(shí)考慮維胺酯相關(guān)制劑的治療周期為4～6周，非長(zhǎng)期用藥；結(jié)合各企業(yè)近效期樣品的試驗(yàn)考察結(jié)果以及工藝控制情況，暫擬訂限度為維A酸不得過0.5%，雜質(zhì)A不得過0.5%，其他單雜不得過0.5%，各雜質(zhì)總和不得過2.0%。

3.6 維胺酯的質(zhì)量現(xiàn)狀

根據(jù)對(duì)國(guó)產(chǎn)3家主要生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)檢查結(jié)果，工藝雜質(zhì)維A酸含量均小于0.1%，說明國(guó)內(nèi)企業(yè)對(duì)該雜質(zhì)控制均較好；各企業(yè)均檢出光降解雜質(zhì)A，說明在樣品儲(chǔ)存過程中，企業(yè)應(yīng)嚴(yán)格控制儲(chǔ)存條件，避免其光照降解。

4 結(jié)論

本文建立了一種有效檢測(cè)維胺酯原料藥中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法。基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果以及維胺酯的處方和生產(chǎn)工藝，推測(cè)維胺酯中主要雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)與來源，并用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)雜質(zhì)的毒性，為維胺酯的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)，為該品種的處方和生產(chǎn)工藝、質(zhì)量控制及儲(chǔ)存條件提供了參考依據(jù)。