基于UPLC-Q-TOF-MS/MS聯合網絡藥理學及分子對接研究五味清濁顆粒治療腹瀉藥效物質基礎和作用機制

李偉，孫佳，李思雨，余秋香，王添敏，宋慧鵬，張慧（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

五味清濁顆粒又名當瑪-5、通拉嘎-5，為蒙古族驗方，始載于《后序醫典》，1985年版《中國藥典》首次將其載入[1]，由石榴、紅花、肉桂、蓽茇、豆蔻五味藥材組成，具有開郁消食、暖胃的功效[2]。方中石榴為君藥，以溫胃增火，清肝熱為主；紅花為臣藥，以清熱、增強體質為輔；蓽茇、肉桂、豆蔻均為佐使藥，蓽茇溫中散寒、止瀉化腐；肉桂散寒止痛，益胃火；豆蔻溫胃腎[3]。臨床上常用于治療腹瀉[4-6]且效果較好，寒證、熱證均可使用，但迄今為止，處方藥效物質潛在的有效成分及作用機制尚不明確。

網絡藥理學和分子對接技術是目前預測復方有效成分的有效手段，但目前多以文獻報道或TCMSP數據庫中收錄的化學成分為對象，對五味清濁顆粒進行活性成分的預測，目標性不強，導致預測的活性成分在中藥中檢測不到，預測的結果沒有意義，為此需要在五味清濁顆粒成分確定存在的基礎上，進行網絡藥理學和分子對接的預測。

本論文采用質譜分析技術，對五味清濁顆粒進行分析，以檢測到的成分為對象，進行網絡藥理學和分子對接分析，篩選活性成分，揭示作用機制，為五味清濁顆粒研究奠定基礎，指導臨床用藥。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290型UPLC儀、Agilent 6550型三重四極桿高分辨質譜儀（配置Dual AJS ESI 離子源）[安捷倫科技（中國）有限公司]、KQ250DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、十萬分之一天平（梅特勒 ME55C137550880，精度：0.01 mg）。

1.2 試藥

五味清濁顆粒（批號：20211010，規格：3 g/袋，祈蒙股份有限公司），對照品沒食子酸（純度≥98.0%，批號：B20851）、胡椒堿（純度≥98.0%，批號：B20516）、羥基紅花黃色素A（純度≥98.0%，批號：B20968）、木犀草素（純度≥98.0%，批號：B20888）、山柰酚（純度≥98.0%，批號：B21126）、肉桂醛（純度≥98.0%，批號：B21081）（上海源葉生物科技有限公司）；鞣花酸（純度≥98.0%，批號：BP0529，成都普瑞法科技開發有限公司）。乙腈、甲酸、甲醇均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜和質譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Eclipsepius C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫：0～13.3 min，7%～22%B；13.3～14.6 min，22%～31%B；14.6～22 min，31%～40%B；22～29 min，40%～60%B；29～35 min，60%～80%B；35～39 min，80%～90%B。檢測波長為310 nm；進樣體積為3 μL；柱溫為30℃；流速為0.4 mL·min－1；分析時間為39 min；柱色譜洗脫液不經分流直接導入質譜系統檢測。

2.1.2 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），在正、負離子模式下檢測，二級質譜采集采用Auto MS/MS模式；干燥氣體溫度為250℃，干燥氣體流速為14 L·min－1；毛細管電壓為3500 V，碎裂電壓為3500 V，霧化器壓力為35 psi，二級質譜碰撞電壓為20 eV；質譜采集范圍為（m/z）50～2000。

2.2 供試品溶液的制備

取五味清濁顆粒0.75 g置10 mL的量瓶中，加70%甲醇定容，超聲（頻率40 kHz，功率100 W）30 min，冷卻后用70%甲醇補足體積，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別稱取沒食子酸、胡椒堿、羥基紅花黃色素A、木犀草素、山柰酚、肉桂醛、鞣花酸適量，加甲醇制成各對照品質量濃度均為50 μg·mL－1的混合對照品溶液，即得。

2.4 結果

2.4.1 化學成分的鑒定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，按“2.1”項下方法對五味清濁顆粒進行正、負離子全掃描，獲得總離子流圖，見圖1。結合化學對照品，共鑒定和推測出86個化學成分，見表1[7-14]。

圖1 五味清濁顆粒的HPLC-Q-TOF-MS/MS負離子模式（A）和正離子模式（B）總離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms of HPLC-Q-TOF-MS/MS by negative ion mode（A）and positive ion mode（B）for Wuwei Qingzhuo granules

續表1

2.4.2 生物堿類化合物 生物堿類化合物主要來源于蓽茇，如胡椒堿、蓽茇寧、蓽茇酰胺等，質譜裂解規律為胺部分容易失去一個中性哌啶或甲酰基哌啶，末端結構易產生丙烯基亞甲二氧基苯和甲基亞甲二氧基苯[12]。在五味清濁顆粒中鑒別出生物堿類化合物共25個，分別是4、24、58、60、62～65、68～81、84～86。

以65為例，闡述酰胺類生物堿的裂解規律和結構鑒定的解析過程。在正離子模式下，其保留時間為19.416 min，準分子離子峰m/z286.1448[M＋H]＋，根據元素組成綜合分析預測可能的分子式為C17H19NO3。母離子在質譜高能碰撞下，丟失C5H11N形成m/z201.0550的碎片離子，再丟失CO形成m/z173.0594的離子碎片，脂肪酸末端產生m/z161.0593[C10H8O2＋H]＋的丙烯基亞甲二氧基苯和m/z135.0441[C8H6O2＋H]＋的甲基亞甲二氧基苯。結合化合物的分子式、裂解規律、碎片信息及與文獻對照[12]，確認該化合物為胡椒堿。可能的裂解途徑見圖2。

圖2 胡椒堿的質譜圖（A）及裂解規律（B）Fig 2 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of piperine

2.4.3 黃酮類化合物 黃酮類化合物主要來源于紅花，如山柰酚、槲皮素、羥基紅花黃色素A等。質譜裂解規律為逆狄爾斯-阿德爾（RDA）裂解和丟失中性碎片，在ESI多級質譜中，CO、CO2、C2H2O等中性碎片的丟失首先發生在C環，然后發生在A環上，B環上沒有中性碎片的丟失[13]。在五味清濁顆粒中鑒別出黃酮類化合物共23個，分別是15、16、20、22、23、26、28、31、34～36、39～45、47、48、52、53、59。

以53為例，闡述黃酮類化合物的裂解規律和結構鑒定的解析過程。在負離子模式下，保留時間為12.418 min，準分子離子峰m/z285.0405 [MH]－，根據元素組成綜合分析預測可能的分子式為C15H10O6，母離子在質譜高能碰撞下丟失CO形成m/z257.0446的離子碎片，再丟失CO形成m/z229.0500的離子碎片。RDA裂解產生m/z153.0181的離子碎片。結合化合物的分子式、裂解規律、碎片信息及與文獻對照[13]，確認該化合物為山柰酚。可能的裂解途徑見圖3。

2.4.4 有機酸類化合物 有機酸類化合物來源于石榴、紅花，如綠原酸、沒食子酸、蘋果酸等。質譜裂解規律為一般丟失CO2和H2O的特征碎片[13]，在五味清濁顆粒中鑒別出有機酸類化合物共12個，分別是1、2、5、8、9、19、32、49、57、67、82、83。

以19為例，闡述有機酸類化合物的裂解規律和結構鑒定的解析過程。在負離子模式下，保留時間為1.889 min，準分子離子峰m/z353.0882[MH]－，根據元素組成綜合分析預測可能的分子式為C16H18O9，母離子在質譜高能碰撞下丟失C7H11O5-H2O、C7H11O5-CO2，形成m/z161.0244、m/z135.0453的離子碎片。結合化合物的分子式、裂解規律、碎片信息及與文獻對照[13]，確認該化合物為綠原酸。可能的裂解途徑見圖4。

圖4 綠原酸的質譜圖（A）及裂解規律（B）Fig 4 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of chlorogenic acid

2.4.5 鞣質類化合物 鞣質類化合物主要來源于石榴，如原花青素B、安石榴林、石榴皮亭B等。質譜裂解規律為通常發生RDA裂解、失去H2O而產生碎片離子峰[9]，在五味清濁顆粒中鑒別出鞣質類化合物共16個，分別是6、7、10～14、18、21、25、27、29、30、33、37、55。

以21為例，闡述縮合鞣質類化合物的裂解規律和結構鑒定的解析過程。在負離子模式下，保留時間為2.662 min，準分子離子峰m/z577.1364[MH]－，根據元素組成綜合分析預測可能的分子式為C30H26O12，母離子在質譜高能碰撞下脫去C8H8O3，發生RDA裂解重排得到m/z425.0861離子碎片，接著脫去一個H2O，得到m/z407.0773離子碎片，兩個兒茶素斷裂，形成m/z289.0719離子碎片，再脫去C9H8O3，經重排裂解得到m/z125.0248離子碎片。結合化合物的分子式、裂解規律、碎片信息及與文獻對照[9]，確認該化合物為原花青素B。可能的裂解途徑見圖5。

2.4.6 苯丙素類化合物 苯丙素類化合物主要來源于肉桂，如桂皮醛、香豆素。質譜裂解規律為內酯環容易丟失CO、CO2產生質量損失28和44的碎片離子[16]。在五味清濁顆粒中鑒別出苯丙素類化合物共2個，分別是38、51。

以38為例，闡述苯丙素類化合物的裂解規律和結構鑒定的解析過程。在正離子模式下，保留時間為6.581 min，準分子離子峰m/z147.0437[M＋H]＋，根據元素組成綜合分析預測可能的分子式為C9H6O2，母離子在質譜高能碰撞下失去1分子CO，產生m/z119.0486的離子碎片，再失去1分子CO，得到m/z91.0547的離子碎片。結合化合物的分子式、裂解規律、碎片信息及與文獻對照[16]，確認該化合物為香豆素。可能的裂解途徑見圖6。

圖6 香豆素的質譜圖（A）及裂解規律（B）Fig 6 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of coumarin

2.5 治療腹瀉的網絡藥理學分析

2.5.1 活性成分和疾病的靶點篩選 將UPLC-QTOF-MS/MS鑒別獲得的86個化學成分代入TCMSP中，根據藥代動力學特征（ADME）篩選得到活性成分。利用TCMSP 和 Swiss Target Prediction得到候選靶點1014個。以“Diarrhea”為關鍵詞，在GeneCards、OMIM等數據庫篩選得到腹瀉相關靶點320個。最終篩選出五味清濁顆粒治療腹瀉疾病潛在靶點57個。利用Cytoscape 3.7.1軟件構建“活性成分-作用靶點”網絡，將活性成分按度值（Degree）排序，篩選排名靠前的6個成分，分別為槲皮素、木犀草素、鞣花酸、胡椒堿、山柰酚、蓽茇寧。

2.5.2 蛋白質互作網絡（PPI）構建與分析 將“活性成分-疾病”交集靶點導入String數據庫，繪制PPI。利用Cytoscape 3.7.1軟件進行可視化，見圖7。利用Network Analyzer工具進行拓撲分析，以Degree為基準排序，最終篩選排名靠前的6個靶點，分別為IL-6、TNF、EGFR、IFNG、IL-10、IL-8。

圖7 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病PPI網絡Fig 7 PPI network of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.3 GO功能及KEGG通路富集分析 應用Metascape數據庫，對GO功能排名前10的條目及KEGG排名前20的通路進行可視化。GO分析得到生物過程（BP）條目3251個，細胞組分（CC）條目287個，分子功能（MF）條目478個。KEGG通路富集分析得到107條通路，富集的主要信號通路包括PI3K-Akt、JAK-STAT、HIF-1等信號通路，見圖8。

圖8 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病靶點基因的GO及KEGG富集分析Fig 8 GO and KEGG enrichment analysis of target genes of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.4 “核心成分-作用靶點-通路”網絡構建與分析 利用Cytoscape 3.7.1 軟件構建五味清濁顆粒核心成分-作用靶點-通路相互作用網絡圖，見圖9。由圖9可知，五味清濁顆粒活性成分通過作用于多個靶點、多條通路發揮作用，且成分、靶點、通路間存在錯綜復雜的關系。

圖9 五味清濁顆粒治療腹瀉疾病 “核心成分-作用靶點-通路”圖Fig 9 “Core ingredient-target-pathway” diagram of Wuwei Qingzhuo granules in treating diarrhea

2.5.5 分子對接驗證 利用AutoDock Vina進行分子對接驗證，見表2。對接結合能均小于－20 kJ·mol－1，表明核心成分與核心靶點結合穩定，部分對接構象見圖10。

表2 五味清濁顆粒核心成分和核心靶點的結合能Tab 2 Binding energy of core components and core targets of Wuwei Qingzhuo granules

4 討論

腹瀉是一種臨床常見的消化道疾病，主要表現為排便次數增加和大便流動性增加[17]。腹瀉會導致機體丟失大量體液，引起脫水和電解質平衡紊亂，引起腹瀉的病因較多，發病機制較復雜，可能是由于腸道吸收減少、滲透性活性電解質分泌增加、胃腸道快速轉運引起的[18-19]。五味清濁顆粒是蒙醫臨床治療腹瀉的經驗方，本文以其作為研究對象，采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術聯合網絡藥理學及分子對接探討治療腹瀉的藥效物質基礎和作用機制。

通過網絡藥理學篩選出6個核心成分，分別為槲皮素、木犀草素、鞣花酸、胡椒堿、山柰酚、蓽茇寧。相關藥理研究表明，槲皮素、山柰酚可抑制腸道運動，降低腹腔毛細血管的通透性、抑制腸內水分和電解質的分泌以及修復上皮黏膜治療腹瀉[20-21]，鞣花酸對腸道上皮細胞具有顯著的保護作用，能夠促進腸道內容物中營養物質的吸收，防止腸道中的致病菌在腸道上皮細胞中定植[22]。木犀草素具有抗炎作用，在調節腸道免疫系統和治療慢性炎癥性腸病中發揮重要作用，可以減少小腸內容物的體積和重量，從而發揮止瀉作用[23]。胡椒堿、蓽茇寧具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抑菌等多重藥理功效，在止瀉和調節腸道免疫系統起著重要作用[22-23]。

五味清濁顆粒治療腹瀉共51個相關靶點，根據PPI網絡預測結果最終篩選出6個核心靶點，主要包括IL-6、TNF、EGFR、IFNG、IL-10、IL-8等，體現中藥治療疾病的多靶點特點。其中IL-6作為關鍵促炎因子[24]，通過刺激趨化因子的產生并激活腸道黏膜局部免疫反應，導致腸道動力改變以及腸道敏感度增高，炎癥細胞也隨之增多，激活腸道免疫系統，導致腸道通透性的增高，進而引起腹痛、腹瀉[19]。動物實驗表明，TNF-α抗體或基因的缺失可有效減輕炎癥性腸病[25]。EGFR通過與其受體結合激活多個信號通路來刺激上皮細胞的生長、增殖和分化，在調節腸黏膜屏障功能方面發揮重要作用[21]。IFNG在免疫反應中起重要的調節作用，T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞以及單核巨噬細胞能產生大量的IFNG，其能誘導NF-κB等炎癥因子釋放[26]。KEGG通路富集分析結果顯示，51個交集靶點顯著富集于PI3KAkt、JAK-STAT、HIF-1信號通路等關鍵信號通路。JAK-STAT信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡，可通過調控其來抑制炎性細胞因子的產生，減輕腸黏膜損傷。HIF-1為腸道炎癥的關鍵調節因子，腹瀉會導致腸道菌群失調并會造成機體局部缺氧，使得HIF-1信號通路激活[19]，可通過抑制其激活，減輕腸道炎癥反應。PI3K-Akt信號通路與腹瀉的發生最為密切，可通過抑制其活化，促進細胞自噬與細胞凋亡，降低促炎癥因子 IL-6釋放，減輕腸道炎癥反應，達到保護腸道黏膜的作用[22，27]。分子對接結果顯示，核心成分與核心靶點間均具有良好的結合性能。

綜上，本研究基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技術聯合網絡藥理學和分子對接技術充分表明五味清濁顆粒可通過多成分、多靶點、多途徑協同發揮治療腹瀉作用，可為后期五味清濁顆粒的藥效物質基礎研究提供參考依據。