UPLC-Q-TOF-MS/MS法快速鑒定加味八珍益母膏化學成分

王英力，楊欣欣，2，3，李天嬌，2，3，王帥，2，3*，包永睿，2，3*，孟憲生，2，3（.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 6600；2.遼寧省中藥多維分析專業技術創新中心，遼寧 大連 6600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連 6600）

加味八珍益母膏來自滿藥“加味八珍益母湯”，由滿族的益母草膏和清宮秘方八珍湯再結合桃仁、丹參、紅花等幾味活血藥組成[1]。具有補氣養血、祛瘀調經的功效，能夠較好地改善患者盆腔循環功能，調節卵巢功能，增加子宮內膜厚度，且無肝腎毒性[2-3]，臨床上常被用于治療宮寒、痛經等疾病[4]。目前關于加味八珍益母研究的相關文獻多為臨床治療、癥候分型等方面，關于化學成分分析及質量控制的文獻較少，且《中國藥典》中相關質量控制為采用高效液相色譜法測定其中1個成分。加味八珍益母膏由15味藥材加工而成，僅對其中的1～2個成分進行含量測定的質量控制具有一定片面性，所以本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術對加味八珍益母膏的化學成分進行快速識別，擬結合后續藥效實驗及質量控制方法學驗證實驗，確定加味八珍益母膏潛在的質量標志物，以期為加味八珍益母膏更加全面的質量控制研究提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1290 UPLC-6500 Q-TOF 色譜-質譜聯用儀（配置 MassHunter 質譜工作站和 Mass analysis質譜數據處理系統）；T-124/85S型電子天平（美國康州HZ電子科技有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸益母草堿（批號：111823-201202）、鹽酸水蘇堿（批號：110754-201111）、人參皂苷Re（批號：110754-200320）、人參皂苷Rg1（批號：110703-201530）、金絲桃苷（批號：111521-201507）、阿魏酸（批號：1107773-201915）（中國食品藥品檢定研究院）；異甘草苷（批號：wkq21021906）、芹菜素（批號：wkq18010301）、洋川芎內酯H（批號：wkq21012907）、咖啡酸（批號：WP22101809）、肉豆蔻酸（批號：wkq19040812）、L-苯丙氨酸（批號：wkq18070501）、丹參素（批號：WP22120203）、毛蕊花糖苷（批號：WP22101809）、美迪紫檀素（批號：wkq20070203）、綠原酸（批號：wkq23022707）（成都維克奇生物科技有限公司）；芍藥苷（批號：151120，成都普菲德生物技術有限公司）。所有對照品純度均＞98%。

加味八珍益母膏（批號：20220904，丹東藥業集團有限公司，規格：150 mL/瓶）；LC-MS級甲醇、LC-MS級乙腈（德國Darmstadt公司）；LC-MS級甲酸（美國Fisher公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

Agilent Poroshell SB-C18（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）色譜柱，正離子模式：流動相0.2%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～30 min，5%～100%B；30～35 min，100%B），流速0.4 mL·min－1，柱溫30℃，進樣量0.5 μL。負離子模式下流動相為純水（A）-甲醇（B），其他條件同正離子模式。

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離離子源，干燥氣體溫度：250℃，干燥氣體流速：11 mL·min－1，霧化器：45 psi，鞘氣溫度：350℃，鞘氣流量：11 mL·min－1，碎裂電壓：125 V，正、負離子模式下的毛細管電壓分別為4000 V、3500 V，噴嘴電壓：500 V，質量范圍50～1200m/z，采樣頻率為1 spentra/s。二級質譜碰撞電壓為20 eV和40 eV。

2.3 供試品溶液的制備

量取加味八珍益母膏10 mL，置100 mL具塞錐形瓶中，加入40 mL 50%甲醇，稱定質量，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），放冷后稱重，用50%甲醇補足減失的重量，混勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液于進樣瓶中。分別稱取益母草、甘草、茯苓、人參、澤蘭、桃仁（制）、紅花、當歸、熟地黃、川芎、赤芍、丹參、香附（制）、（炒）白術、炮姜粉末約2 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL 50%甲醇，稱定質量，超聲30 min（功率200 W，頻率40 kHz），放冷后稱重，用50%甲醇補足減失的重量，混勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸益母草堿3.23 mg、鹽酸水蘇堿2.12 mg、金絲桃苷2.56 mg、阿魏酸2.44 mg、異甘草苷2.06 mg、人參皂苷Re 2.36 mg、人參皂苷Rg12.08 mg、芹菜素3.34 mg、洋川芎內酯H 2.64 mg、芍藥苷2.64 mg、咖啡酸3.36 mg、肉豆蔻酸2.62 mg、L-苯丙氨酸2.58 mg、丹參素2.68 mg、毛蕊花糖苷2.88 mg、美迪紫檀素2.52 mg、綠原酸2.32 mg，分別置于10 mL量瓶中，甲醇定容。分別吸取各對照品溶液500 μL于10 mL量瓶中，甲醇定容，配制成質量濃度分別為16.15、10.60、12.80、12.20、10.30、11.80、10.40、16.70、13.20、13.20、16.80、13.10、12.90、13.40、14.40、12.60、11.60 μg·mL－1的混合對照品溶液。

2.5 數據處理

通過TCMSP、PubChem等數據庫以及文獻查找的方式收集已知的加味八珍益母膏中15味藥材的化學成分信息，以化合物名稱、化學式以及化合物相對分子質量為基本信息通過PCDL建立加味八珍益母膏化學成分數據庫。根據一級質譜信息中的保留時間，采用Target模式對加味八珍益母膏提取液成分信息進行掃描。使用MassHunter和PCDL進行了質譜數據處理，包括提取離子色譜圖和計算元素組成，質量誤差在10 ppm以內，根據質譜信息、保留時間結合對照品與相關文獻對加味八珍益母膏中的化學成分進行鑒定。

3 結果

3.1 加味八珍益母膏中化學成分的鑒定

將加味八珍益母膏供試品溶液進行UPLC-QTOF-MS/MS分析，得到正、負離子模式下的總離子流圖見圖1?；旌蠈φ掌氛⒇撾x子模式下的總離子流圖見圖2、3。通過MassHunter 質譜工作站和Mass analysis質譜數據處理系統分析各化合物可能產生的碎片信息，結合相關文獻及對照品進行比對分析從而對化合物進行鑒定；同法對15味藥材的供試品溶液進行分析，根據各成分的來源進行藥材歸屬。結果共鑒定和推測出140個化學成分，正離子模式下鑒定出65個化學成分，其中益母草11個，白術（炒）2個，赤芍3個，川芎11個，丹參5個，當歸7個，甘草7個，紅花4個，炮姜8個，人參3個，熟地黃9個，澤蘭2個，見表1[5-24]。負離子模式下鑒定出83個化學成分，其中益母草16個，白術（炒）4個，赤芍10個，川芎10個，丹參9個，當歸7個，茯苓2個，甘草4個，紅花14個，炮姜3個，人參5個，熟地黃14個，桃仁（制）3個，香附（制）3個，澤蘭9個，見表2[5-8，10-20，24-32]。其中正、負離子模式下鑒定出的共有化學成分有8個，分別為3，4，5-三甲氧基苯甲酰胺、焦谷氨酸、梓醇、鳥苷、馬錢素、煙花苷、芹菜素、脫咖啡酰基毛蕊花糖苷，且一些成分同時存在于不同藥材中。

圖1 加味八珍益母膏正離子（A）及負離子（B）模式下的總離子流圖Fig 1 Total ion flow diagram of Jiawei Bazhen Yimu ointment in positive ion（A）and negative ion（B）mode

圖2 混合對照品正離子模式下的總離子流圖Fig 2 Total ion flow diagram of mixed reference in positive ion mode

圖3 混合對照品負離子模式下的總離子流圖Fig 3 Total ion flow diagram of mixed reference in negative ion mode

表1 正離子模式下加味八珍益母膏的化學成分解析Tab 1 Chemical components of Jiawei Bazhen Yimu ointment in the positive ion mode

續表1

表2 負離子模式下加味八珍益母膏的化學成分解析Tab 2 Chemical components of Jiawei Bazhen Yimu ointment in negative ion mode

續表2

3.2 化合物的裂解規律分析

3.2.1 有機酸及其衍生物類 有機酸類是一類具有酸性的有機化合物，在MS裂解過程中主要產生H2O、CO2、CO等碎片離子[32]，如沒食子酸、苯甲酸、香莢蘭酸、阿魏酸、油酸、L-苯丙氨酸、丹參素、6-姜二酮。以沒食子酸為例，準分子離子峰為m/z169.0141 [M-H]－，其脫羧基后生成二級碎片離子m/z125.0214 [M-H-CO2]－。結合文獻[8]報道，該碎片與沒食子酸的理論裂解碎片相似度較高，推測該化合物可能為沒食子酸，其可能的裂解途徑見圖4。

圖4 沒食子酸可能的質譜裂解途徑Fig 4 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of gallic acid

3.2.2 黃酮類 黃酮類化合物本身具有2-苯基色原酮母核結構，在MS裂解過程中主要丟失中性的CO和H2O，或是發生RDA裂解，其中黃酮苷類化合物則更多脫掉糖基，如果化合物中存在甲氧基，則首先發生甲基丟失，然后可能會發生碳環丟失CO碎片等[33]。如7-羥基香豆素、10-姜酚、芒柄花苷、芹菜素、羥基紅花黃色素A、甘草苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、金絲桃苷、異槲皮苷、山柰酚-3-O-槐糖苷、木犀草苷，以甘草苷為例，準分子離子峰為m/z417.1186[M-H]－，其產生的特征二級離子碎片m/z255.0666，135.0079分別為m/z417.1186脫掉一分子Glu后繼續脫掉一分子C7H6O2產生的，即m/z255.0666[M-H-Glu]－，和m/z135.0079[M-H-Glu-C7H6O2]－，結合文獻[5]報道，該碎片與甘草苷理論裂解碎片相似度較高，推測該化合物為甘草苷，其可能的裂解途徑見圖5。

圖5 甘草苷可能的質譜裂解途徑Fig 5 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of liquiritin

3.2.3 生物堿類 生物堿類化合物是一種含氮有機物，生理活性較強，主要由芳香體系組成，具有較多環系，分子結構緊密，不易裂解，在MS裂解過程一般發生在側鏈或者取代基上[34]。如鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿、葫蘆巴堿，以鹽酸水蘇堿為例，準分子離子峰為m/z144.1027[M＋H]＋，其失去一分子C3H10N后生成二級碎片離子m/z84.9597[M＋H-C3H10N]＋。結合文獻[6]報道及對照品比對，該碎片與鹽酸水蘇堿對照品的裂解規律一致，推測該化合物為鹽酸水蘇堿，其可能的裂解途徑見圖6。

圖6 鹽酸水蘇堿可能的質譜裂解途徑Fig 6 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of stachydrine hydrochloride

3.2.4 糖及糖苷類 糖及糖苷類化合物通常為羰基糖的衍生物通過糖的半縮醛（酮）羥基脫水縮合與另一種非糖物質結合的產物。C-糖苷類化合物在MS裂解過程中首先在糖元內部進行裂解，O-糖苷類化合物則通常在糖苷鍵位置發生裂解。如毛蕊花糖苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹糖甘草苷、6-羥基山柰酚-3-O-β-蕓香糖-6-Oβ-D-葡萄糖苷，以毛蕊花糖苷為例，準分子離子峰為m/z623.1978[M-H]－，其產生m/z461.1397、315.1088、179.0325、161.0239的二級碎片離子，m/z461.1397為m/z623.1978[M-H]－失去一分子咖啡酰生成的，即m/z461.1397[M-H-C9H6O3]－，m/z315.1088為m/z461.1397脫掉一分子鼠李糖生成的，即m/z315.1088[M-H-C9H6O3-Rha]－，m/z179.0325為產生的咖啡酸碎片離子，m/z161.0239為咖啡酸脫一分子水生成的。結合文獻[7]報道及對照品比對，該碎片與毛蕊花糖苷對照品的裂解規律一致，推測該化合物為毛蕊花糖苷，其可能的裂解途徑見圖7。

圖7 毛蕊花糖苷可能的質譜裂解途徑Fig 7 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of acteoside

3.2.5 萜類 萜類化合物由甲戊二羥酸衍生而來，其基本結構單元為異戊二烯[35]。在MS裂解過程中主要表現為脫掉取代基、糖苷鍵斷裂、羥基脫落等。如梓醇、芍藥內酯苷、馬錢素、地黃苷、丹參新酮、白術內酯Ⅲ、隱丹參酮、白術內酯Ⅱ。以白術內酯Ⅲ為例，準分子離子峰為m/z247.1339 [MH]－，脫掉一分子H2O后繼續脫掉一分子C4H8生成二級碎片離子分別為m/z229.0993 [M-H-H2O]－與m/z173.0233[M-H-H2O-C4H8]－，結合文獻[23]報道及對照品比對，該碎片與白術內酯Ⅲ對照品的裂解規律一致，推測該化合物可能為白術內酯Ⅲ，其可能的裂解途徑見圖8。

圖8 白術內酯Ⅲ可能的質譜裂解途徑Fig 8 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of atractylolactone Ⅲ

3.2.6 其他類 加味八珍益母膏中還含有苯乙醇（苷）類、酰胺類、苯和取代衍生物等其他類化合物。以洋川芎內酯H為例，準分子離子峰為m/z247.0938[M＋Na]＋，其產生的二級碎片離子m/z201.9285為m/z247.0938[M＋Na]＋脫掉一分子H2O和一分子CO生成的，即m/z201.9285 [M＋Na-H2O-CO]＋，二級碎片離子m/z141.9709為m/z201.9285 [M＋Na-H2O-CO]＋脫掉一分子H2O和一分子C3H6生成的，即m/z141.9709[M＋Na-H2OCO-H2O-C3H6]＋，結合文獻[7]報道及對照品比對，該碎片與洋川芎內酯H對照品的裂解規律一致，推測該化合物可能為洋川芎內酯H，其可能的裂解途徑見圖9。

圖9 洋川芎內酯H可能的質譜裂解途徑Fig 9 Possible mass spectrometry fragmentation pathway of senkyunolide H

4 討論

本試驗通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，建立加味八珍益母膏正、負離子模式下的化學輪廓譜，對其化學成分進行系統分析，共鑒定出140個化學成分，其中鹽酸益母草堿、鹽酸水蘇堿、金絲桃苷、阿魏酸、異甘草苷、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、芹菜素、洋川芎內酯H、芍藥苷、咖啡酸、肉豆蔻酸、L-苯丙氨酸、丹參素、毛蕊花糖苷、美迪紫檀素、綠原酸17種化學成分經過對照品比對，其他成分為結合相關文獻分析得到。140個成分包括有機酸及其衍生物類成分48個，黃酮類成分32個，生物堿類成分4個，糖及糖苷類成分10個，萜類成分19個，其他類成分27個。有機酸及其衍生物類成分在MS裂解過程中主要脫掉H2O、CO2、CO等碎片離子。黃酮類成分在MS裂解過程中主要丟失中性的CO和H2O，其中黃酮苷類化合物則更多的是脫掉糖基。生物堿類成分分子結構緊密，不易裂解，在MS裂解過程一般發生在側鏈或者取代基上。糖及糖苷類成分在MS裂解過程中首先在糖元內部進行裂解，O-糖苷類化合物則通常在糖苷鍵位置發生裂解。萜類成分在MS裂解過程中主要表現為脫掉取代基、糖苷鍵斷裂、羥基脫落。

加味八珍益母膏的主要功效為補氣養血、祛瘀調經，臨床上常用于治療女性經期前后及經期疾病，如氣血不足或氣滯血瘀引起的經期后移、痛經、頭痛等疾病[3]。加味八珍益母膏中阿魏酸、丹參素、山柰酚-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、異甘草素、毛蕊花糖苷、苦杏仁苷、蒼術酮可以調節體內環氧化酶（COX-2）、一氧化氮合成酶、白細胞介素（IL）-12、IL-6等蛋白與炎癥因子的表達，從而發揮抗炎、鎮痛的作用[36-46]；阿魏酸能夠調節子宮催產素水平[36]，鹽酸益母草堿、鹽酸水蘇堿具有抗炎的功效，能夠調節子宮收縮的頻率和張力，調節子宮雌二醇水平[47-48]；芍藥苷對急性盆腔炎大鼠有明顯抗炎作用，可減輕其子宮組織病變[45]；蒼術酮能夠降低醋酸致小鼠扭體反應[46]，從而發揮治療痛經的功效；丹參素、毛蕊花糖苷、梓醇、洋川芎內酯H具有抗凝、抗血小板聚集的作用[37-38，49-50]，從而發揮活血補血的作用；丹參素、甘草苷、鹽酸益母草堿、鹽酸水蘇堿、異甘草苷、阿魏酸、洋川芎內酯H、毛蕊花糖苷、蒼術酮、梓醇具有抗炎鎮痛、活血補血等功效。以上成分與加味八珍益母膏補氣養血、祛瘀調經、治療痛經的作用關系緊密，可作為其潛在的質量標志物。

本次研究對加味八珍益母膏的化學成分進行解析，共鑒定出140個化合物，其中益母草27個，白術（炒）6個，赤芍13個，川芎21個，丹參14個，當歸14個，茯苓2個，甘草11個，紅花18個，炮姜11個，人參8個，熟地黃23個，桃仁（制）3個，香附（制）3個。鑒定出與補氣養血、祛瘀調經、治療痛經功效相關性較大的成分，可能是加味八珍益母膏質量控制的潛在質量標志物，可為后續加味八珍益母膏的質量控制研究奠定基礎。