基于5-LOX/LTB4信號通路探討黃芩苷/梔子苷對PM2.5暴露致血管內(nèi)皮功能障礙的干預(yù)作用及其機(jī)制

孫欠欠，張行行，趙麓，趙安東，史永恒，王川，劉繼平，王斌*（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.中醫(yī)藥腦健康產(chǎn)業(yè)陜西省高校工程研究中心，陜西 咸陽 712046；3.陜西省中醫(yī)藥管理局中藥藥效機(jī)制與物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)研究室，陜西 咸陽 712046）

大氣PM2.5可經(jīng)呼吸直達(dá)肺泡，沉積于肺泡表面；其可溶性組分或PM0.1還可透過肺泡壁的生理屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，隨血流而作用于全身的靶器官[1-2]。據(jù)大量流行病學(xué)及《中國心血管病報(bào)告2018》最新研究數(shù)據(jù)顯示，大氣PM2.5污染是引起我國居民心血管疾病發(fā)病率和死亡率持續(xù)增加的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[3-5]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷是導(dǎo)致許多心血管疾病的起始環(huán)節(jié)和重要指標(biāo)[6]，而進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)的PM2.5顆粒可通過多種途徑損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，薛盼盼等[7]將PM2.5與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，PM2.5可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并致其鐵死亡；張一凡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可觸發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，并激活P38MAPK信號通路促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露可活化心肌組織NLRP3炎性小體，促進(jìn)炎性反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡[9]，可以通過調(diào)節(jié)MAPK通路、AMPK通路、NF-κB通路與Sirt1通路，影響內(nèi)皮舒張因子一氧化氮（NO）以及活性氧（ROS）的釋放，引發(fā)血管內(nèi)皮損傷[10-11]。課題組一直致力于黃芩苷（baicalin，BC）、梔子苷（geniposide，GD）抗腦血管損傷藥效及機(jī)制研究，黃芩苷、梔子苷以最佳比例7∶3配伍，在30、60 mg·kg－1劑量應(yīng)用時(shí)可有效抑制5-LOX/CysLTs/CysLTsR通路表達(dá)[12]、抗炎[13]、降低興奮性氨基酸毒性[14]、調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)[15]等。課題組最新的研究表明，黃芩苷、梔子苷配伍可呈部分內(nèi)皮依賴性地舒張由U46619預(yù)收縮的腦基底血管，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)NO表達(dá)有關(guān)；可通過調(diào)節(jié)HIF-1α/eNOS信號通路表達(dá)，保護(hù)由缺血缺氧誘導(dǎo)損傷的血管內(nèi)皮損傷。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討黃芩苷聯(lián)合梔子苷在30（低）、60 mg·kg－1（高）劑量對改善PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級SD大鼠32只，雄性，（220±20）g [成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證編號：SCXK（川）2020-030]。飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房內(nèi)，溫度 23～25℃，相對濕度 45%～55%，自由攝食與飲水，晝夜各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合3R原則，本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查（倫理批件號：SUCMDL20220301001）。

1.2 試藥

一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME）、環(huán)氧合酶抑制劑（INDO）、乙酰膽堿（ACh）、5-羥色胺（5-HT）、硝普鈉二水合物（SNP，批號分別為67791、84227、133975、HY-B1473、HY-A0119，MCE公司）；黃芩苷（批號：B20570，含量≥98%）、梔子苷（批號：B21661，含量≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗體（批號：ab215717，Abcam公司）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）抗體（批號：BS-0162R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；5-LOX抗體（批號：GB111330-100，武漢賽維爾生物科技有限公司）；白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：0047R2、0190R2、0180R2，江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）ELISA試劑盒（批號：EK0514，武漢博士德生物科技有限公司）；白三烯B4（LTB4）ELISA試劑盒（批號：U96-3681E，YOBIBIO）。

1.3 儀器

DMT 630M 離體微血管張力測定系統(tǒng)（丹麥DMT 公司）；Powerlab 生物信號采集處理系統(tǒng)（澳大利亞 ADI 公司）；TH-1000CⅡ智能大流量空氣顆粒采樣器（武漢市天虹有限責(zé)任公司）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國 Bio-rad 公司）；Scientz-10N型真空冷凍干燥機(jī)（寧波新藝生物科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 血管肌張力測定

腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg·kg－1）麻醉大鼠后，腹主動(dòng)脈采血處死，剝離腸系膜組織，浸于預(yù)冷的Na＋-PSS溶液中，顯微鏡下分離腸系膜動(dòng)脈，切成4段，每段2～3 mm，穿入 2 根40 μm 的金屬絲，迅速移至盛有37℃、氧飽和的Na＋-PSS溶液的浴槽中，利用兩端金屬絲固定血管環(huán)，平衡 30 min 后，分3次施加1 mN 的預(yù)張力，每次間隔10 min；更換5 mL 60 mmol·L－1K＋-PSS 收縮血管，重復(fù)兩次，當(dāng)兩次刺激收縮力均大于5 mN，且無明顯差異時(shí)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[16]。即分別測定BC/GD對正常基礎(chǔ)狀態(tài)，5-HT預(yù)收縮，以及一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME）、環(huán)氧合酶抑制劑（INDO）、L-NAME＋I(xiàn)NDO 孵育血管后的腸系膜動(dòng)脈血管的舒張作用。

2.2 PM2.5顆粒采集及混懸液的制備

將 PM2.5顆粒采集器固定于陜西中醫(yī)藥大學(xué)四號教學(xué)樓樓頂，樓高約 20 m。通過采集器將PM2.5顆粒附著于玻璃纖維膜上，將膜裁剪為1 cm×1 cm方塊，置于燒杯中，加入純水沒過，低溫超聲 60 min，洗脫濾膜，1800 目尼龍濾網(wǎng)過篩除去不溶性大顆粒，濾液真空冷凍干燥 3 d，轉(zhuǎn)移至 60℃ 烘箱繼續(xù)干燥 24 h 后，潔凈臺分裝至無菌離心管，－20℃保存。使用前，稱取適量溶于生理鹽水，超聲震蕩15 min，注意現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

32只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、PM2.5組（15 mg·kg－1）、BC/GD低劑量組（30 mg·kg－1）、BC/GD高劑量組（60 mg·kg－1），每組 8 只，采用非暴露式氣管滴注PM2.5混懸液進(jìn)行染毒[17]，對照組氣管滴注等量生理鹽水，每6日1次，共10次[18]，滴注體積為 1 mL·kg－1。BC/GD為灌胃給藥，給藥周期為1個(gè)月，從染毒1個(gè)月后開始給藥。染毒期間觀察各組大鼠毛發(fā)、精神、飲食、活動(dòng)狀況。給藥結(jié)束后，禁食12 h，1%戊巴比妥鈉（50 mg·kg－1）麻醉，腹主動(dòng)脈取血處死，取腸系膜動(dòng)脈進(jìn)行指標(biāo)檢測。

2.4 HE染色觀察血管內(nèi)皮狀態(tài)

取出大鼠腸系膜動(dòng)脈，用預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈，吸水紙吸干表面多余水分，4%多聚甲醛固定72 h后，經(jīng)脫水、包埋、切片、脫蠟、染色、制片，光鏡下不同倍數(shù)觀察腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮組織病理學(xué)狀態(tài)，選取固定位置拍照。

2.5 ELISA檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、LTB4水平

腹主動(dòng)脈血液樣本常溫靜置30 min，3000 r·min－1離心15 min，分裝血清，－80℃凍存，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、LTB4水平。

2.6 化學(xué)發(fā)光法檢測腸系膜動(dòng)脈組織ROS水平

取適量腸系膜動(dòng)脈血管組織，冰上消解后剪碎，用預(yù)冷的PBS沖洗，除去細(xì)胞碎片，與適量的酶消化液一起，37℃水浴30 min，孵育過程中，使用移液槍吹打細(xì)胞，孵育結(jié)束后，PBS清洗，300目的尼龍網(wǎng)過篩，收集濾過的細(xì)胞，500 r·min－1離心10 min，吸棄上清液，并用 PBS洗 1～2 次沉淀。利用DCFH-DA對細(xì)胞沉淀重新懸浮（1×106～2×107個(gè)·mL－1），在37℃下培養(yǎng)30 min，每3～5 min反轉(zhuǎn)混合一次，以保證探頭和細(xì)胞的完全接觸，收集孵育（探針標(biāo)記）后的單細(xì)胞懸液，1000 r·min－1離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，PBS再次沖洗1～2次，再次懸浮，并在最佳激發(fā)波長 488 nm，最佳發(fā)射波長 525 nm處測定熒光度值。

2.7 硝酸還原酶法檢測腸系膜動(dòng)脈組織NO水平

取適量腸系膜動(dòng)脈組織與9倍量生理鹽水在冰上機(jī)械勻漿，制成10%的勻漿液，3000 r·min－1離心10 min，取上清液進(jìn)行NO水平檢測。

2.8 Western blot法檢測腸系膜動(dòng)脈5-LOX、eNOS、iNOS蛋白表達(dá)

取腸系膜動(dòng)脈組織，加入RIPA裂解液提取蛋白并測定蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入抗體（1∶1000），4℃孵育過夜；洗滌后加入二抗（1∶5000）孵育，洗滌后加入ECL超敏發(fā)光液顯影，采用成像儀攝像、測量，利用Image Pro Plus 5.0軟件分析計(jì)算條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BC/GD對基礎(chǔ)狀態(tài)血管張力的影響

與二甲基亞砜（DMSO）組比較，BC/GD對內(nèi)皮完整的基礎(chǔ)狀態(tài)的腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)無明顯影響（P＞0.05），提示BC/GD對正常基礎(chǔ)狀態(tài)的腸系膜動(dòng)脈無舒張作用（見圖1）。

圖1 BC/GD對基礎(chǔ)狀態(tài)的血管環(huán)張力的影響Fig 1 Effect of BC/GD on vascular ring tension in the base state

3.2 BC/GD對5-HT預(yù)收縮的腸系膜動(dòng)脈血管張力的影響

結(jié)果顯示，BC/GD能明顯舒張血管環(huán)。提示BC/GD能舒張5-HT預(yù)收縮的腸系膜動(dòng)脈血管（見圖2）。

圖2 BC/GD對5-HT預(yù)收縮的腸系膜動(dòng)脈血管張力的影響Fig 2 Effect of BC/GD on the tension of the mesenteric artery precontracted with 5-HT

3.3 BC/GD舒張血管作用的內(nèi)皮機(jī)制

L-NAME、INDO、L-NAME＋I(xiàn)NDO孵育血管30 min后，5-HT預(yù)收縮血管，加入BC/GD后監(jiān)測血管環(huán)張力變化，結(jié)果顯示，L-NAME、INDO、L-NAME＋I(xiàn)NDO均能抑制BC/GD的舒張血管作用，但L-NAME對BC/GD舒張血管的抑制作用較INDO強(qiáng)。提示BC/GD對血管的舒張作用與調(diào)節(jié)NO表達(dá)有關(guān)（見圖3）。

圖3 BC/GD舒張血管作用的內(nèi)皮機(jī)制Fig 3 Endothelial mechanism of BC/GD on the vasodilation

3.4 PM2.5對血管內(nèi)皮功能的影響

ACh是一種內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張劑，通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO；SNP是一種非內(nèi)皮依賴的血管擴(kuò)張劑，直接釋放NO來舒張血管[19-20]。為了研究PM2.5對腸系膜動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能的影響，將內(nèi)皮完整的腸系膜動(dòng)脈分別與DMSO、25 mg·mL－1PM2.5、50 mg·mL－1PM2.5、100 mg·mL－1PM2.5共孵育2 h后，加入1×10－5mol·L－15-HT預(yù)收縮血管環(huán)，穩(wěn)定后加入ACh舒張血管。結(jié)果顯示，與DMSO組比較，50、100 mg·mL－1BC/GD組對ACh的血管舒張效應(yīng)明顯減弱（P＜0.01）；而各個(gè)濃度的PM2.5對SNP的血管舒張效應(yīng)無明顯影響。提示50 mg·mL－1以上的PM2.5可引起血管內(nèi)皮損傷，血管舒張效應(yīng)減弱（見圖4）。

圖4 不同濃度PM2.5對ACh、SNP血管舒張效應(yīng)的影響Fig 4 Effect of different concentrations of PM2.5 on the vasodilation of ACh and SNP

3.5 BC/GD對PM2.5誘發(fā)血管內(nèi)皮損傷的影響

為了研究BC/GD對PM2.5引起的血管內(nèi)皮損傷的影響，將BC/GD（1×10－3mol·L－1）與PM2.5共同孵育2 h后，加入1×10－5mol·L－15-HT預(yù)收縮血管環(huán)，穩(wěn)定后累加濃度加入ACh舒張血管，觀察對血管舒張的影響。結(jié)果顯示，PM2.5組血管舒張效應(yīng)明顯減弱，加入BC/GD共同孵育后，血管舒張作用明顯增強(qiáng)。提示BC/GD能增強(qiáng)血管舒張效應(yīng)，對PM2.5造成的血管內(nèi)皮損傷有保護(hù)作用（見圖5）。

圖5 BC/GD對PM2.5誘發(fā)血管內(nèi)皮損傷的影響Fig 5 Effect of BC/GD on vascular endothelial injury induced by PM2.5

3.6 大鼠一般情況

滴注過程中，對照組大鼠毛色有光澤，飲食、行動(dòng)正常，呼吸順暢平穩(wěn)，無其他明顯異常狀態(tài)，滴注組大鼠在滴注4次后毛色變暗、呼吸急促、變得暴躁，且隨著染毒次數(shù)的增多，上述癥狀逐漸加重；飲食未見明顯異常，體重增長情況良好，無明顯異常。而開始灌胃后，上述異常體征得到有效改善，但體重增長相較于未給藥前減緩（見表1）。

表1 大鼠體重變化(g)Tab 1 Changes in body weight of rats (g)

3.7 各組大鼠腸系膜動(dòng)脈病理學(xué)觀察

對照組大鼠腸系膜動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)、完整，無明顯病理損傷；PM2.5組大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮完整性嚴(yán)重受損、出現(xiàn)缺失，內(nèi)皮皺縮，BC/GD能不同程度改善大鼠內(nèi)皮損傷程度和完整性（見圖6）。提示BC/GD對PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷具有保護(hù)作用。

圖6 BC/GD對各組大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮完整性的影響（HE染色，×200）Fig 6 Effect of BC/GD on the endothelial integrity of the mesenteric arteries in rats of each group（HE染色，×200）

3.8 ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平

與對照組比較，PM2.5組IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高（P＜0.01），TGF-β1水平顯著降低（P＜0.01）；與PM2.5組比較，BC/GD高劑量組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯降低（P＜0.01），TGF-β1水平顯著升高（P＜0.01）；BC/GD低劑量組大鼠TNF-α水平明顯降低（P＜0.01），IL-1β、IL-6、TGF-β1水平無明顯差異（見圖7）。

圖7 BC/GD對各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1水平的影響Fig 7 Effect of BC/GD on the serum IL-1β，IL-6，TNF-α，and TGF-β1 levels of rats in each group

3.9 化學(xué)發(fā)光法檢測腸系膜動(dòng)脈中ROS水平

與對照組比較，PM2.5組大鼠腸系膜動(dòng)脈中ROS水平顯著升高（P＜0.01）；與PM2.5組比較，BC/GD高劑量組大鼠腸系膜動(dòng)脈中ROS水平顯著降低（P＜0.01）；BC/GD低劑量組大鼠腸系膜動(dòng)脈中ROS水平與PM2.5組無明顯差別（見圖8）。

圖8 BC/GD對各組大鼠腸系膜動(dòng)脈ROS水平的影響Fig 8 Effect of BC/GD on the ROS levels in mesenteric arteries of rats in each group

3.10 硝酸還原酶法檢測腸系膜動(dòng)脈中NO水平

與對照組比較，PM2.5組大鼠腸系膜動(dòng)脈中NO水平顯著降低（P＜0.01）；與PM2.5組比較，BC/GD高劑量組大鼠腸系膜動(dòng)脈中NO水平顯著升高（P＜0.01）；BC/GD低劑量組大鼠腸系膜動(dòng)脈中NO水平與PM2.5組無明顯差別（見圖9）。

圖9 BC/GD對各組大鼠腸系膜動(dòng)脈NO水平的影響Fig 9 Effect of BC/GD on the NO levels in mesenteric arteries of rats in each group

3.11 腸系膜動(dòng)脈中5-LOX、eNOS、iNOS蛋白表達(dá)和血清中LTB4水平

與對照組比較，PM2.5組5-LOX、iNOS、LTB4水平明顯升高，eNOS蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與PM2.5組比較，BC/GD低、高劑量組大鼠5-LOX、iNOS蛋白表達(dá)顯著降低，eNOS蛋白表達(dá)顯著上升（P＜0.05）；BC/GD高劑量組LTB4水平降低（P＜0.05）（見圖10）。

圖10 BC/GD對各組大鼠腸系膜動(dòng)脈中5-LOX、eNOS、iNOS蛋白表達(dá)和血清中LTB4水平的影響Fig 10 Effect of BC/GD on the expression of 5-LOX，eNOS，and iNOS protein in the mesenteric artery and the level of LTB4 in the serum of rats in each group

4 討論

PM2.5具有粒徑小、成分復(fù)雜、危害大等特點(diǎn)，易通過上呼吸道黏膜到達(dá)并堆積在肺部，再通過肺循環(huán)進(jìn)入全身血液循環(huán)[21]。多項(xiàng)研究表明，PM2.5已經(jīng)成為誘發(fā)心肌細(xì)胞炎性細(xì)胞因子水平增加、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮凋亡、凝血功能異常、自主神經(jīng)功能失衡等心血管疾病不可忽視的重要因素[22]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞是附著于血管內(nèi)皮生長的單層鱗狀細(xì)胞，與血液直接接觸，對血液中的異物刺激具有直接反應(yīng)[23]，正常生理情況下，內(nèi)皮細(xì)胞可感知內(nèi)外環(huán)境的變化并分泌多種血管活性物質(zhì)來維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[24]。黃芩苷為唇形科植物黃芩干燥根中提取的黃酮類物質(zhì)，具有保肝、利膽、降壓、鎮(zhèn)靜、消炎等藥理活性。梔子苷為茜草科植物梔子干燥成熟果實(shí)中提取的環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，具有保肝利膽、解熱鎮(zhèn)靜、降壓、抗炎、止血等藥理作用。研究表明，黃芩苷具有濃度依賴性血管舒張作用[25]，但鮮見梔子苷舒張血管的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中，BC/GD對基礎(chǔ)狀態(tài)的腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)張力無明顯影響，但能明顯舒張由5-HT預(yù)收縮的血管環(huán)，加入一氧化氮合酶抑制劑L-NAME、環(huán)氧合酶抑制劑INDO或兩者合用孵育血管環(huán)后，均能明顯抑制BC/GD的血管舒張作用，但L-NAME的抑制作用更為明顯，提示BC/GD舒張血管作用與內(nèi)皮舒張因子NO有關(guān)。體內(nèi)外研究表明，進(jìn)入血液循環(huán)的PM2.5顆粒可通過多種途徑引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起血管舒張功能障礙[26]。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度PM2.5與血管環(huán)共孵育2 h后，發(fā)現(xiàn)50 mg·mL－1的PM2.5能明顯減弱ACh引發(fā)的血管舒張，而對SNP引發(fā)的血管舒張效應(yīng)無明顯影響，提示PM2.5引起的血管舒張效應(yīng)減弱與內(nèi)皮有關(guān)。將BC/GD和PM2.5共孵育血管環(huán)2 h后，BC/GD能明顯改善由PM2.5誘導(dǎo)的舒張效應(yīng)減弱的作用。提示PM2.5與腸系膜動(dòng)脈血管環(huán)共孵育后能通過多種途徑損傷血管內(nèi)皮，誘發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙，而BC/GD對PM2.5造成的血管損傷具有保護(hù)作用。

NO是一種具有內(nèi)皮功能的多效性功能分子，也是機(jī)體最強(qiáng)的血管舒張物質(zhì)，由內(nèi)皮細(xì)胞中的L-精氨酸在鈣-鈣調(diào)蛋白依賴性的NOS催化下合成釋放[27]。而NOS具有三種不同的亞型，即在正常狀態(tài)下表達(dá)的神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）和eNOS以及在損傷后誘導(dǎo)表達(dá)的iNOS[28]。內(nèi)皮細(xì)胞受到PM2.5刺激后，會(huì)引起血管通透性增加、NO生成減少，促進(jìn)血管緊張素Ⅱ等血管收縮介質(zhì)的表達(dá)與釋放，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[29]。而PM2.5由于其復(fù)雜的化學(xué)組成和粒徑大小，表面通常吸附重金屬（如鉛、鋅、鐵、鎘、鎳、砷和鉻等）和毒害有機(jī)物，其中過渡金屬離子可以催化氧化還原反應(yīng)，在PM2.5表面產(chǎn)生ROS或活性氮[30]。ROS可以直接滅活NO，也可通過耗竭四氫生物蝶呤（BH4），使eNOS的合成受到抑制，NO含量減少，加速內(nèi)皮功能障礙[31]。為進(jìn)一步探討B(tài)C/GD抗PM2.5暴露致使的血管內(nèi)皮功能障礙作用及其機(jī)制，本研究利用氣管滴注法構(gòu)建PM2.5染毒模型。在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中選擇7.5、15、30 mg·kg－1三個(gè)PM2.5濃度分別滴注1個(gè)月、2個(gè)月、3個(gè)月進(jìn)行造模濃度和時(shí)間的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15 mg·kg－1PM2.5滴注2個(gè)月能明顯激活NLRP3炎性小體，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、促進(jìn)炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡[9]；致使腦組織炎性損傷和激活小膠質(zhì)細(xì)胞并向M1型極化，因此，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)采用該造模方法。對各組大鼠血管功能性指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，PM2.5組大鼠腸系膜動(dòng)脈內(nèi)皮嚴(yán)重受損，血管中ROS升高，NO降低，而BC/GD組大鼠內(nèi)皮損傷得到改善；60 mg·kg－1能明顯降低ROS水平、升高NO水平，促進(jìn)eNOS、抑制iNOS表達(dá)。

課題組一直致力于研究5-脂氧酶（5-LOX）/白三烯B4（LTB4）信號通路介導(dǎo)的機(jī)體損傷，5-LOX可以催化花生四烯酸（AA）生成白三烯A4（LTA4），LTA4在一系列酶催化反應(yīng)下可生成半胱氨酰白三烯（CysLTs）和LTB4[32]。LTB4是重要的促炎脂質(zhì)介質(zhì)和炎癥趨化因子，主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞、血小板、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞中[33]，LTB4可激活LTB1和LTB2兩個(gè)受體，從而激活并招募B細(xì)胞和T細(xì)胞，促進(jìn)核因子-κB（NF-κB）產(chǎn)生和IL-6、TNF-α等炎癥因子表達(dá)，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[34]。有研究表明，5-LOX、FLAP和LTA4H在動(dòng)脈粥樣硬化病變處均處于高表達(dá)狀態(tài)，因此，本研究繼續(xù)選擇該通路對BC/GD改善PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果顯示，PM2.5組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、LTB4水平顯著升高，TGF-β1水平顯著降低，大鼠腸系膜動(dòng)脈中5-LOX蛋白表達(dá)明顯增加，而60 mg·kg－1BC/GD能明顯下調(diào)5-LOX、LTB4、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)，上調(diào)TGF-β1表達(dá)。提示BC/GD可通過抑制5-LOX/LTB4信號通路活化，抑制下游炎性介質(zhì)釋放，降低炎性損傷。

綜上所述，BC/GD可通過抑制5-LOX/LTB4信號通路表達(dá)，下調(diào)ROS水平，上調(diào)eNOS表達(dá)，下調(diào)iNOS表達(dá)，升高血管中NO水平，改善PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙。