不同產地茯磚茶的品質、抗氧化性比較及“金花”菌形態特征分析

馬榮蓉，冉莉莎，屈麗池，謝念祠，丁夢梅，朱洺志,3,4, ，王坤波,3,4,5,

（1.湖南農業大學園藝學院茶學教育部重點實驗室，湖南長沙 410128；2.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建協同創新中心，湖南長沙 410128；4.農業農村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，湖南長沙 410128；5.湖南農業大學黃埔創新研究院，湖南長沙 410128）

茯磚茶作為后發酵黑茶的代表，具有降脂減肥、降血糖、緩解代謝綜合征等功效[1-3]，同時因其在發酵過程中會產生大量金黃色的“金花”菌而聞名，主要以黑毛茶為原料經篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發花、干燥和陳化等工序加工制作而成。茯磚茶品質特征形成的關鍵在于“發花”，其實質是在適宜的溫度、濕度下，以冠突散囊菌為主的多菌群協同作用的固態發酵過程[4-5]。微生物的發酵作用不僅賦予了茯磚茶金花茂盛、菌香濃郁的特征，而且使得其內含活性成分發生了明顯的變化[6]。

“發花”是茯磚茶加工過程中微生物作用最活躍的階段，此過程改變了茯磚中茶多酚及兒茶素、黃酮和氨基酸等主要代謝物的組成，促進了茯磚茶滋味和湯色的形成[7]。已有研究證明真菌群落在茯磚茶代謝產物的形成中具有潛在作用，不同產地的茯磚茶其真菌群落的多樣性和豐富度存在差異[8]。目前對茯磚茶中“金花”菌的分離鑒定技術已較為成熟，大多數學者將其鑒定為冠突散囊菌[5,9-10]，也有學者將涇陽茯茶中的“金花”菌鑒定為赤散囊菌[11]，不同茯磚茶中的“金花”菌在種屬水平上存在差異。彭曉赟等[12]對分離自茯磚茶的冠突散囊菌進行發酵培養，揭示了冠突散囊菌的次級代謝產物具有多種生物活性，賦予了茯磚茶抗菌、抗氧化等生理功能?！敖鸹ā本鳛檐虼u茶發酵過程中的優勢微生物，人們往往通過判斷其質量和數量來衡量茯磚茶品質的優劣。不同地區生產的茯磚茶因生產過程中所使用的原料和加工條件的不同對其微生物組成以及化學成分有所影響，可能導致不同地區茯磚茶的品質特征的形成。

因此，比較分析不同地區茯磚茶的主要化學成分，利用電子舌系統檢測5 種茯磚茶的滋味屬性，用不同方法檢測其抗氧化活性，觀察對比不同地區茯磚茶的“金花”菌形態特征，對了解不同產地茯磚茶品質及功能等方面的差異性，以及后續研究茯磚茶具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯磚茶 湖南省益陽茶廠、湖北省力沃茶業股份有限公司、陜西省涇渭茯茶有限公司、浙江省武義駱駝九龍磚茶有限公司和貴州省過江龍生態黑茶有限公司；沒食子酸、咖啡堿、可可堿、茶葉堿、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）等標準品 純度≥99%，美國Sigma 公司；總抗氧化力（FRAP 法）、（DPPH 法）、（ABTS 法）試劑盒 蘇州科銘生物技術有限公司；麥芽膏、酵母膏、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、氯化鉀、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵等 純度≥99%，國藥集團化學試劑有限公司。

Scope.A1 顯微鏡 德國卡爾·蔡司股份有限公司；UV-2550 紫外分光光度計 日本島津公司；SA 402B 電子舌（配備AAE，CTO，CAO，COO，AE1 傳感器）日本Insent 公司；Waters 高效液相色譜儀e2695-2998 沃特世科技（上海）有限公司；VARIOSKAN FLASH 多功能酶標儀 美國Thermo Scientific 公司；YS6003 色差儀 深圳三時恩公司；SWCJ-2FD 超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；GR85DA 高壓滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶湯色差檢測 參照GB/T 23776-2018，茶葉感官審評方法[13]沖泡茶湯，趁熱過濾并迅速冷卻，對茶湯進行拍照；以蒸餾水為對照，用色差儀對茶湯進行色差檢測[14]。

1.2.2 主要品質成分測定 游離氨基酸參照GB/T 8314-2013，茶游離氨基酸總量的測定[15]、水浸出物參照GB/T 8305-2013，茶水浸出物測定[16]，茶多酚參照GB/T 8313-2018，茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[17]進行測定，并用UV-2550 紫外分光光度計進行吸光度檢測。游離氨基酸準曲線y=3.915x+0.0234，R2=0.9962，茶多酚標準曲線：y=0.01x+0.0222，R2=0.9993。黃酮類化合物總量的測定采用三氯化鋁比色法[18]，稱取3 g（準確至0.001 g）磨碎試樣于500 mL 錐形瓶中，加沸蒸餾水450 ml，立即移入沸水浴中，浸提45 min（每隔10 min 搖動一次），浸提完畢后立即趁熱減壓過濾，殘渣用少量熱蒸餾水洗滌2～3 次。將濾液轉入500 mL 容量瓶中，冷卻后用水定容至刻度，搖勻作為供試樣液。

1.2.3 兒茶素組分及生物堿檢測方法 采用本實驗室的高效液相色譜法進行檢測，參照GB/T 8314-2013，茶游離氨基酸總量的測定[15]進行樣品提取，色譜條件：色譜柱為C18（4.6 mm×150 mm），檢測波長278 nm，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，流速1.0 mL·min-1。流動相A 為超純水，B 相為N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和冰乙酸以39.5:2:1.5 為比例的混合液；B 相以9%的初始比例進行梯度洗脫，10 min 內上升至14%，27 min 內至36%并持續4 min，32 min 下降至9%并持續到37 min 結束。

1.2.4 電子舌檢測茶葉的滋味屬性 參照1.2.1 方法進行茶湯處理，進行傳感器的活化和系統自檢，室溫維持在20 ℃進行檢測，味覺傳感器和陶瓷參比電極共清洗210 s，平衡30 s 后開始樣品測試，每個樣品測量30 s，回味測量30 s。每個樣測試4 次平行，取后三次的平均值作為測試結果進行分析。

1.2.5 抗氧化活性測定 參照1.2.2 提取試液，采用蘇州科銘生物技術有限公司DPPH、ABTS 及FRAP檢測試劑盒對樣品DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力及FRAP 抗氧化力進行檢測。正式檢測之前將試液稀釋為干茶浸出物6、3、1.5、1.2 mg/mL 進行預實驗，當濃度為1.2 mg/mL 時ABTS、FRAP 試劑盒檢測效果最好，1.5 mg/mL 時DPPH 試劑盒檢測效果最好，每個指標按照最佳濃度稀釋試液后嚴格按照試劑盒方法進行，使用酶標儀分別在波長515 nm（DPPH）、734 nm（ABTS）、593 nm（FRAP）處檢測各樣品吸光值。樣品清除DPPH 自由基能力、ABTS+自由基能力以及總抗氧化能力用從標準曲線上獲得的抗氧化劑的量（μmol Trolox/mL）來表示。相關標準曲線如下：

式中，y 表示吸光差值ΔA；x 表示Trolox 濃度（μmol/mL）。

1.2.6 “金花”菌形態觀察 “金花”菌的形態觀察參照王磊等[19]的方法進行。參照趙仁亮等[4]、Visagie等[20]的方法配制察氏培養基（CZ）、察氏酵母瓊脂培養基（CYA）、察氏酵母膏瓊脂改良培養基（CYAS）、麥芽汁瓊脂培養基（MEA）、麥芽汁酵母瓊脂培養基（M40Y）。將分離自不同產地茯磚茶的菌株分別接種于上述5 種培養基于28 ℃培養7 d，記錄菌落特征并拍照，挑取CZ 培養基上少量菌落用乳酸酚棉藍染液對5 個菌株孢子進行染色，在光學顯微鏡下觀察其形態結構及生長狀況。

1.3 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2016 進行記錄整理，實驗重復3 次，結果使用平均值±標準差的形式表示。IBM SPSS Statistics 25.0 軟件對數據進行差異顯著性分析，P＜0.05 表示顯著性差異，GraphPad Prism 8、Cytoscape 進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 茶葉色澤分析

由表1 和圖1 可知，5 個茯磚茶色澤存在明顯差異，湖南茯磚干茶色澤青褐，金花茂盛，茶湯橙黃尚亮；湖北茯磚黃褐帶金花，淺橙紅尚亮；陜西茯磚棕褐帶金花，橙黃明亮；浙江茯磚棕褐帶金花，橙紅尚亮；貴州茯磚棕褐帶金花，茶湯紅橙明亮。對茶湯進行色差檢測發現其色差值存在顯著差異（P＜0.05），其中湖南茯磚亮度最高（86.60），浙江茯磚紅度和黃度最高分別為（8.52、57.73）。茶湯顏色的不同主要是由于茶葉中茶黃素、茶紅素和茶褐素的含量存在差異，黃亞輝等[21]的研究表明，茯磚茶中的茶黃素含量均偏低，而茶褐素作為茶黃素和茶紅素的氧化產物在茯磚茶中偏高，茶褐素是茶湯顏色“烏褐”的主要成分，浙江茯磚較深可能是由于其茶褐素較高的原因。在茯磚茶加工過程中，由于“金花”菌本身具備合成色素的能力，因此茯磚茶的湯色差異還可能受到微生物的影響。

圖1 不同產地茯磚茶茶湯及干茶Fig.1 Soup and shape of Fu brick tea in different origins

表1 不同茯磚茶樣品茶湯色差結果Table 1 Results of color difference in tea broth of different Fu brick tea samples

2.2 不同產地茯磚茶品質成分分析

水浸出物、游離氨基酸、茶多酚、黃酮等成分是茶葉滋味的主要貢獻物。由圖2 可知，湖北茯磚水浸出物含量顯著低于其他地區茯磚茶，水浸出物是一切可溶性物質的總和，其含量的高低對茶葉品質的優劣有重要作用。5 個茯磚茶游離氨基酸含量均在10 mg/g 以內，貴州茯磚含量最高（9.03 mg/g）。游離氨基酸是茶葉中鮮味的主要來源，但由于茯磚茶選用原料本身較粗老，其游離氨基酸含量較低。在茯磚茶渥堆過程中，由于濕熱作用的影響，發生脫氨、脫羧等反應進一步轉化為香氣等成分[22]，在發花過程中，微生物又將氨基酸類物質作為氮源以維持自身生長繁殖，而導致其含量進一步降低[7]。茶多酚包括兒茶素、花青素、黃酮等化合物，其含量與原料有關，在茯磚茶加工過程中也受到濕熱作用和微生物作用的影響。5 個茯磚茶樣品茶多酚含量存在顯著差異（P＜0.05），其中湖北茯磚含量最低（90.8 mg/g），浙江茯磚最高（132.93 mg/g）。黃酮類化合物是茶葉中重要的功能成分，但在自然狀態下不穩定，茶葉加工和儲藏過程中容易發生轉化，因此在茶葉中含量較低[23]，5 個不同產地茯磚茶黃酮含量均低于9 mg/g。

圖2 不同產地茯磚茶主要品質成分含量Fig.2 Contents of main quality components of Fu brick tea in different origins

茶葉中的生物堿主要有咖啡堿、可可堿和茶葉堿。可可堿和茶葉堿呈苦味，含量較低，互為同分異構體?？Х葔A呈苦味，可以和兒茶素、氨基酸等絡合，使茶湯具有苦后回甘的特色[24]。因其本身較為穩定，所以在茯磚茶加工過程中含量變化不大。從表2可知湖南茯磚咖啡堿含量最高（31.513 mg/g），湖北茯磚最低（14.52 mg/g），導致這一差異可能是由于原料的不同。沒食子酸屬酚酸類物質，其形成是由于茯磚茶發酵早期的濕熱作用[25]，沒食子酸兒茶素在濕熱作用下通過水解逐漸分解，然后產生相應的非沒食子酸兒茶素和沒食子酸[26]，而EGCG 是沒食子酸生物合成的主要途徑[27]。湖南茯磚、浙江茯磚及貴州茯磚之間沒食子酸含量存在顯著差異（P＜0.05），可能是由于加工過程中不同的水分和溫度條件導致。兒茶素作為茶多酚的主要組成部分，可分為簡單兒茶素（DL-C、EC、EGC）和酯型兒茶素（ECG、EGCG、GCG）[28]。酯型兒茶素是強苦味和澀味的重要供體，簡單兒茶素則收斂性較弱[29-30]。湖南、湖北茯磚兒茶素總量較低，陜西、浙江、貴州茯磚含量較高；浙江茯磚含有更多的簡單兒茶素，陜西茯磚含有更多的酯型兒茶素。有研究表明渥堆及發花程度的不同都會造成茯磚茶兒茶素不同程度的降低[31]。因此，不同產地茯磚茶中兒茶素的差異一方面可能是由于發花過程中大量微生物的繁殖，釋放胞外酶使兒茶素各組分進行酶促氧化而大幅下降；另一方也可能是由于原料的不同導致。

表2 不同產地茯磚茶兒茶素組分及咖啡堿含量（mg/g）Table 2 Content of catechin fraction and caffeine in Fu brick tea from different origin (mg/g)

2.3 不同地區茯磚茶滋味特征分析

通過電子舌研究了茯磚茶的滋味屬性，由雷達圖（圖3a）可知，湖南茯磚茶具有最強的苦味，但其苦味回味值低于浙江茯磚茶。浙江茯磚茶具有最強的咸味，陜西茯磚茶具有最強的澀味，其澀味回味值也較高；貴州茯磚茶具有最強的鮮味和豐富度。從聚類分析圖（圖3b）來看，茯磚茶樣品的滋味屬性被分為三組：湖南-湖北、貴州、陜西-浙江；這表明湖南和湖北茯磚茶的聚類表現出相似的滋味特征，陜西和浙江茯磚茶的聚類表現出相似的滋味特征。

圖3 不同地區茯磚茶滋味特征及聚類分析Fig.3 Taste characteristics and clustering analysis of Fu brick tea from different origins

2.4 不同地區茯磚茶抗氧化活性分析

不同地區的茯磚茶有不同的抗氧化活性，采用三種不同的方法來評估5 個不同地區茯磚茶的抗氧化活性見圖4。結果顯示，5 種茯磚茶樣的DPPH 自由基清除率無顯著差異；湖北茯磚與其余4 個地區茯磚之間FRAP 總抗氧化能力存在顯著差異（P＜0.05）；湖北茯磚和浙江茯磚之間ABTS+自由基清除能力存在顯著差異（P＜0.05）。其中，湖北茯磚茶的FRAP 總抗氧化活性最高（0.18 μmol Trolox/mL），湖南、浙江茯磚茶最低（0.12 μmol Trolox/mL）。浙江茯磚茶的ABTS+抗氧化活性最高（0.4 μmol Trolox/mL），湖北茯磚茶最低（0.31 μmol Trolox/mL）。

圖4 不同地區茯磚茶DPPH、FRAP、ABTS抗氧化活性比較Fig.4 Comparison of the antioxidant activity DPPH,FRAP and ABTS of Fu brick tea from different origins

2.5 不同地區茯磚茶主要化學成分與抗氧化活性及滋味特征的關系

對不同地區茯磚茶主要化學成分、滋味特征與抗氧化活性進行相關性分析，以探究其相互之間的內在聯系?？寡趸芰Φ牟町愂腔诓煌虼u茶中多酚類物質的存在，如茶多酚、類黃酮、兒茶素等[32]，由圖5 可知，FRAP 與咖啡堿、可可堿、水浸出物含量呈顯著負相關（P＜0.05）；而ABTS 抗氧化活性與茶多酚、EC、EGC 等含量存在顯著正相關（P＜0.05），但DPPH 抗氧化活性意外地與這些化學成分不存在顯著相關性。有研究報道，茯磚茶的抗氧化活性，還應考慮沒食子酸、兒茶素和茶色素的特性，它們可以協同或拮抗[8]。因此茯磚茶中關鍵的抗氧化因子及其相互關系還有待進一步的研究。

圖5 茯磚茶主要生化成分與其抗氧化性及滋味特征相關性分析Fig.5 Correlation analysis of the main biochemical components with their antioxidant properties and taste characteristics of Fu brick tea

水浸出物、游離氨基酸、茶多酚等成分是茶葉滋味的主要貢獻物，相關性分析也顯示各化學成分與滋味屬性存在不同的相關性。苦味與氨基酸、沒食子酸、GCG 含量呈顯著負相關（P＜0.05），與可可堿呈顯著正相關（P＜0.05）；澀味則與兒茶素類物質以及茶多酚、咖啡堿、水浸出物等呈顯著正相關（P＜0.05）；除可可堿以外，其余物質大多與鮮味和豐富度存在顯著正相關性（P＜0.05）；沒食子酸、茶多酚與兒茶素類物質與咸味存在顯著正相關性（P＜0.05）。

2.6 不同培養基上菌落形態特征

對5 個產地茯磚茶分離的5 株“金花菌”在不同培養基的形態特征進行觀察（圖6）。5 個菌株形態差異變化受培養基影響較大，主要體現在菌株生長速度及顏色，菌株在CYAS 和M40Y 培養基上生長快，菌株直徑分別為35～42 mm、48～56 mm，菌落致密，菌絲較厚且閉囊殼大量，干燥粗糙；在MEA 培養基上生長速度次之，菌落致密，顏色呈現中央橙黃色，邊緣黃色特征；在CYA 上生長速度較慢，菌落呈現中央黑褐色或褐色，邊緣黃色或淡黃色；在CZ 培養基上，菌株生長緩慢，閉囊殼少量，有色素擴散至培養基，形態差異較小。僅湖南、陜西菌株在CYA 上有滲出液，其它菌株在5 種培養基上均無滲出液。

圖6 不同產地茯磚茶中分離的“金花”菌在不同培養基上的形態特征Fig.6 Morphological characteristics on different media of"golden flower" fungi bacteria isolated from Fu brick tea of different origins

5 株“金花”菌在同培養基上差異相對較小，在CYA 上，湖南和陜西菌株顏色較深，中央黑褐色邊緣淡黃色，其它菌株顏色較淺；湖南菌株在CYAS 及M40Y 生長速度快于其它菌株，湖北菌株在M40Y上呈黃色云朵狀（圖6b4）。

2.7 光學顯微鏡下金花菌結構特征

在顯微鏡下，“金花”菌的有性結構子囊果呈球形或近球形，子囊果在生長后期破裂形成子囊，子囊成熟后釋放子囊孢子[10]。如圖7 所示，5 株“金花”菌均發現子囊孢子和子囊，其子囊呈球形或近球形，直徑117～156 μm（圖7a～圖7e）。陜西、浙江、貴州菌株均發現有性結構子囊果，直徑分別為270、543、395 μm，并且存在多核有隔菌絲（圖7j～圖7l），但在湖南菌株中并未發現子囊果，湖北菌株中發現已破裂的子囊果（圖7f）。湖北、陜西、浙江、貴州菌株均發現代表有性結構的子囊果破裂產生子囊孢子團（圖7f～圖7i）。由此可見湖南菌株生長速度快于其他菌株，子囊果完全破裂釋放子囊，并且子囊開始釋放子囊孢子；其次是湖北菌株，并未發現完整的子囊果，而只有正在破裂釋放子囊的子囊果。陜西、浙江、貴州菌株生長速度較慢。

圖7 顯微鏡下菌株的結構特征Fig.7 Structural features of the fungal under the microscope

3 結論

本研究中5 個不同產地茯磚茶的游離氨基酸、茶多酚、黃酮、兒茶素、咖啡堿含量存在顯著差異（P＜0.05）且滋味差異大。相關性分析顯示，茯磚茶的主要化學成分與滋味屬性顯著正相關?？寡趸钚燥@示湖北茯磚與其余4 個地區茯磚茶的FRAP 抗氧化活性存在顯著差異（P＜0.05），湖北茯磚與浙江茯磚之間ABTS+抗氧化活性存在顯著差異（P＜0.05）。茶多酚與茯磚茶的抗氧化活性存在顯著正相關（P＜0.05）。分離不同產地茯磚茶中的“金花”菌發現它們的形態結構在察氏酵母瓊脂培養基上存在明顯差異，并且湖南菌株生長速度快于其他菌株，從干茶來看其金花也最為茂盛。

后續實驗可將不同的“金花”菌接種于相同原料的黑毛茶進行“發花”，或將同一株“金花”菌接種于不同原料的黑毛茶進行“發花”，探究其品質差異。進一步揭示原料和微生物對茯磚茶品質的影響，為茯磚茶的深入研究提供理論基礎。