澳洲堅果抗氧化肽的分離純化及肽段鑒定

付鎵榕，馬尚玄，魏元苗，徐文婷，郭剛軍, ，賀熙勇

（1.云南省熱帶作物科學研究所，云南景洪 666100；2.云南省澳洲堅果農業工程研究中心，云南景洪 666100）

澳洲堅果（Macadamia integrifolia）為山龍眼科、澳洲堅果屬的常綠喬木果樹，原產于澳大利亞昆士蘭東南部和新南威爾士東北部沿岸的亞熱帶雨林地區，別稱夏威夷果、澳洲核桃等，是一種珍貴的可食用干果，被譽為“干果皇后”、“世界堅果之王”，具有很高的經濟價值[1]。近年來，澳洲堅果產業發展迅猛，2020 年末我國澳洲堅果種植面積為26.61 萬hm2，云南省澳洲堅果種植面積為23.53 萬hm2，產量（殼果，含水量10%）為7.50 萬t[2]。澳洲堅果果仁蛋白質豐富，含量達8%～20%[3]，總氨基酸含量平均為81.82 mg/g，種類齊全，共富含17 種氨基酸，其中包括7 種人體必需氨基酸[4]，對其進行深加工制備功能性多肽能有效提高其利用率及經濟價值[5]。

蛋白質在蛋白酶的作用下分解成多肽，氨基酸的組成和肽序列會影響其生物活性，從而賦予其降血壓、抗氧化和抑菌等不同的生物活性[6-8]。目前，利用生物酶法制備澳洲堅果多肽，研究其抑菌活性、抗氧化活性的研究已有一些報道[8-9]，但對澳洲堅果抗氧化肽的分離純化，結構鑒定相關研究未見報道。利用葡聚糖凝膠可以將多肽根據分子量的大小進行分離，且具有分離條件溫和、對樣品活性影響較小、可再生等特點，廣泛應用在蛋白質水解物的分離中[10]，LC-MS/MS 技術能準確定量定性分析復雜混合物，在多肽結構鑒定中應用廣泛[11]。課題組前期對制備澳洲堅果抗氧化肽的蛋白酶進行了篩選，采用超濾對抗氧化肽進行分級并用大孔樹脂進行除雜，篩選得到分子量小于1000 Da 的組分具有最佳的抗氧化活性[12]。本研究采用葡聚糖凝膠柱層析的方法對分子量小于1000 Da 的澳洲堅果抗氧化肽進行分離純化處理，通過測定DPPH、羥基、ABTS+自由基清除能力與還原能力評價各級純化肽的抗氧化能力；將抗氧化活性最強的組分采用LC-MS/MS 進行鑒定，得到多肽的氨基酸系列，進行抗氧化活性、安全性、水溶性分析，為澳洲堅果的開發利用及澳洲堅果抗氧化肽的深度研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

液壓壓榨澳洲堅果粕 西雙版納云墾澳洲堅果科技開發有限公司；復配蛋白酶（20 萬U/g）南寧東恒華道生物科技有限責任公司；DA201-C 大孔樹脂 鄭州和成新材料科技有限公司；Sephadex G-15 葡聚糖凝膠 合肥博美生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽 上海金穗生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2’-聯氮-雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（ABTS+）、甲酸（質譜級）、碳酸氫銨（質譜級）、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺 美國Sigma 公司；乙腈 美國Thermo 公司；氫氧化鈉、三氯乙酸、無水乙醇等 分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

Easy-nLC 1200 納升級超高效液相色譜儀、電噴霧組合型離子阱Orbitrap 質譜儀 美國Thermo公司；Acclaim PepMap RPLC C18色譜柱（1.9 μm，100? 德國Dr.Maisch GmbH；RV10 型旋轉蒸發儀 艾卡儀器設備有限公司；真空離心濃縮儀 德國Eppendorf 公司；Microfuge 22R 型低溫高速離心機 美國Beckman Coulter 公司；ME204E 型電子分析天平、FiveEasy 型pH 計 梅特勒-托利多儀器有限公司；UV754N 型紫外可見分光光度計 上海精風儀器有限公司；TGL-16C 型離心機 上海安亭科學儀器廠；TD5A-WS 型臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；DBS-160 型部分收集器 上海嘉鵬科技有限公司；BPH-9042 型恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；玻璃層析柱（φ1.0 cm×60 cm）北京瑞達恒輝科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 澳洲堅果多肽的制備 參照課題組前期試驗制備分子量小于1000 Da 的澳洲堅果抗氧化肽，將液壓壓榨的澳洲堅果果粕進行粉碎過60 目篩（孔徑0.25 mm），果粕粉與去離子水按照1:10 比例混合，沸水浴10 min 后冷卻至55 ℃，加酶量1000 U/g，酶解pH7.5，55 ℃酶解3 h 后沸水浴15 min 滅酶，冷卻至室溫后4000 r/min 離心20 min，取上清液調pH 至4.6（澳洲堅果蛋白等電點）靜置30 min，4000 r/min 離心10 min，取上清液調pH 至7.0，過1000 Da超濾膜，將分子量小于1000 Da 的多肽液用DA201-C 大孔樹脂除雜（上樣流速1 mL/min、上樣濃度15 mg/mL，上樣體積200 mL；水洗脫流速2 mL/min，水洗脫體積400 mL；400 mL 75%乙醇解吸，流速為2 mL/min），得到分子量小于1000 Da 的澳洲堅果多肽，備用。

1.2.2 葡聚糖凝膠Sephadex G-15 分離純化 將1.2.1 中制備的澳洲堅果抗氧化肽進行葡聚糖凝膠分離純化。參照姚軼俊等[13]的實驗方法，采取自然沉降法裝柱，用蒸餾水平衡后上樣，上樣濃度為15 mg/mL，上樣量為2 mL，洗脫流速為0.3 mL/min，用蒸餾水進行洗脫，3 mL 收集為一管，在280 nm 波長處檢測吸光度，分別收集各洗脫峰，測定各洗脫峰的抗氧化活性。

1.2.3 多肽濃度的測定 采用雙縮脲法進行測定，參照郭剛軍等[14]的方法進行實驗，以標準酪蛋白為標樣制作標準曲線，得出吸光值為縱坐標（Y），酪蛋白質量濃度為橫坐標（X）的回歸方程為Y=0.0461X+0.0053（R2=0.9995）。

將多肽液與等體積10%的三氯乙酸（TCA）混合，靜置30 min，在4000 r/min 下離心20 min，以除去不溶性的蛋白質和長肽鏈，取1 mL 上清液，加4 mL 雙縮脲試劑，混勻后在室溫下放置30 min，540 nm 處測定吸光值（A），按照公式計算多肽濃度。

式中：A 為吸光值（1 mL 上清液+4 mL 雙縮脲）。

1.2.4 澳洲堅果多肽的抗氧化活性測定 參照前期試驗方法[12]測定谷胱甘肽和不同濃度多肽液的DPPH、羥基、ABTS+自由基清除能力與還原能力，計算得出回歸方程及相關系數r（r值越接近1，相關性越好），利用回歸方程計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50），即清除率達到50%時對應的樣品濃度，IC50越小，抗氧化能力越強。

1.2.5 抗氧化肽鑒定與分析 將1.2.4 選出的最優組分進行LC-MS/MS 鑒定。色譜條件：50 μm×15 cm自制柱，填充反相Acclaim PepMap RPLC C18（1.9 μm，100?）；裝樣量：5 μL；流動相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈中0.1%甲酸；總流量：600 nL/min；LC 線性梯度：4%～8% B2 min，8%～28% B43 min，28%～40% B10 min，40%～95% B1 min，95%～95% B10 min。質譜條件：采用電噴霧-組合型離子阱Orbitrap 質譜儀噴淋電壓：2.2 kV，毛細管溫度：270 ℃。

利用Byonic 對原始MS 文件進行分析，基于Uniprot_Bos_taurus 數據庫（https：//www.uniprot.org）進行蛋白質和肽段鑒定及定量分析。參照Lafarga等[15]的預測方法，采用ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php）預測毒性；采用Innovagen（http://www.innovagen.com/proteomicstools）預測水溶性。

1.3 數據處理

所有實驗重復三次，結果用平均值±標準差（mean±SD）表示。采用Microsoft Excel 2019 進行數據錄入、處理與計算回歸方程；采用SPSS 27.0 統計軟件進行數據分析，組間差異用多重比較分析（LSD）、單因素方差分析（One-way ANOVA）進行處理，P＜0.05 表示差異顯著；用皮爾森法（Pearson’s）進行相關性分析，P＜0.01 為極顯著性相關。使用Origin 2021 對進行作圖。

2 結果與分析

2.1 澳洲堅果多肽的葡聚糖凝膠分離純化

超濾只是一個壓力驅動的膜分離過程，很難分離出分子量精確的多肽，進一步采用葡聚糖凝膠分離進行純化，可以獲得更精確的組分[16]。葡聚糖凝膠柱根據分子量大小對多肽進行分離，在蛋白質水解物的分離中應用廣泛[9]。分子量小于1000 Da 的澳洲堅果抗氧化肽經Sephadex G-15 凝膠柱分離出3 個分子量大小不同的組分，結果如圖1 所示，標記為G1、G2、G3。在葡聚糖凝膠分離純化中分子量大的組分在凝膠柱中保留時間短，分子量小在凝膠柱中保留時間長[17]，由圖1 可知G1 分子量最大，G3 分子量最小。

圖1 澳洲堅果多肽的G-15 凝膠柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of macadamia nut polypeptides in Sephadex G-15 column

2.2 澳洲堅果多肽組分抗氧化活性

葡聚糖凝膠是利用分子篩原理，可以根據截留分子量的大小不同對物質分離，且分離條件溫和，對樣品活性影響較小并且可重復利用，被廣泛應用于活性物質的分離，尤其是蛋白和多肽的分離[12,18]。利用多重抗氧化評估體系（DPPH、ABTS+、羥基自由基清除率、還原能力）對不同分子量大小的三個澳洲堅果多肽組分進行抗氧化活性研究，以谷胱甘肽溶液作為對照，結果如圖2～圖5 所示，并分析各組分抗氧化活性回歸方程及IC50值，結果如表1～表4 所示。

表1 澳洲堅果多肽不同組分對DPPH 自由基清除能力的回歸方程分析Table 1 Analysis by regression equation of different components of macadamia nut polypeptides on DPPH radical scavenging ability

圖2 澳洲堅果多肽不同組分對DPPH 自由基清除能力的影響Fig.2 Effects of different components of macadamia nut polypeptides on DPPH radical scavenging ability

2.2.1 不同組分澳洲堅果多肽對DPPH 自由基的清除作用 DPPH 自由基清除率廣泛應用于研究物質的體外抗氧化活性[19-20]。由圖2 及表1 可見，3 個澳洲堅果多肽組分及谷胱甘肽對DPPH 自由基均有清除作用，且清除率隨著樣品濃度的增加而增強，有較好的量-效關系。在相同濃度下，G3 的清除能力顯著（P＜0.05）優于G1、G2，且均低于谷胱甘肽。在濃度0.2 mg/mL 時，G3 的清除率最優為27.67%±1.08%，其后依次為G2（10.55%±1.04%）、G1（7.20%±0.14%）。隨著濃度的增加，各組分的清除率增加速率不同，當濃度達到0.6、0.8 mg/mL 時，G1、G2 的清除率無顯著性差異（P＞0.05），當濃度達到1.0 mg/mL時，G3 的清除率最優為67.27%±0.28%，其次為G1（32.43%±0.56%）、G2（31.26%±0.48%）。從評價樣品對DPPH 自由基清除能力的IC50值來看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對DPPH 自由基清除能力大小順序為：谷胱甘肽（IC500.01 mg/mL）＞G3（IC500.50 mg/mL）＞G1（IC503.65 mg/mL）＞G2（IC505.23 mg/mL），不同多肽組分對DPPH 自由基的清除能力不同。參考圖1 中的出峰位置，G3 出峰位置靠后，多肽的分子量小，這與不同分子量的核桃、紅花籽、綠豆多肽的抗氧化活性研究結果相同，分子量較小的多肽抗氧化活性顯著高于分子量較大的多肽[21-23]。在本研究中，G1 對DPPH自由基的清除能力優于G2，可能是G1 具有較多電子致密的側鏈基團，疏水性較強，更易于與DPPH 自由基結合，有助于提高其抗氧化活性，這與齊希光等[24]發現黑籽瓜種子中高分子量多肽具有電子致密的側鏈基團和較高的疏水性，更易于與DPPH 自由基結合的結果相符。

2.2.2 不同組分澳洲堅果多肽對羥基自由基的清除作用 羥基自由基是廣泛存在于生物體內的一種自由基，是氧自由基中最活潑的自由基，羥基自由基會引起生物體損傷，羥基自由基清除率是反映物質抗氧化作用的重要指標[25]。從圖3 及表2 可以看出，3 個澳洲堅果多肽組分及谷胱甘肽對羥基自由基有較強的清除能力，且清除率與其濃度呈正相關。G3 對羥基自由基的清除率最大，在濃度2.0 mg/mL 時，G3的清除率最優為18.82%±0.14%，G1、G2 的清除率較低分別為6.79%±1.47%、7.99%±0.69%，且兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。隨著濃度的增加，清除率的增加速率大小順序為G3、G2、G1、谷胱甘肽。當濃度達到10.0 mg/mL，3 個組分的清除率均高于谷胱甘肽且具有顯著性差異（P＜0.05），G3 的清除率最優為67.71%±0.48%。從評價樣品對自由基清除能力的IC50值來看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對羥基自由基清除能力大小順序為：G3（IC506.18 mg/mL）＞G2（IC5012.92 mg/mL）＞G1（IC5037.77 mg/mL）＞谷胱甘肽（IC5054.78 mg/mL），不同多肽組分對羥基自由基的清除能力不同，可能是因為G3 分子量較小可阻斷自由基鏈式反應，促使自由基轉化成更加穩定的物質，表現出更好的羥基自由基清除能力[26]。

表2 澳洲堅果多肽不同組分對羥基自由基清除能力的回歸方程分析Table 2 Regression equation analysis of different components of macadamia nut polypeptides on hydroxyl radical scavenging ability

圖3 澳洲堅果多肽不同組分對羥基自由基清除能力的影響Fig.3 Effects of different components of macadamia nut polypeptides on hydroxyl radical scavenging ability

2.2.3 不同組分澳洲堅果多肽對ABTS+自由基的清除作用 ABTS+自由基清除率廣泛運用于體外抗氧化活性的評價，該方法具有操作簡便、反應迅速、靈敏度高等特點[27-28]。由圖4 及表3 可見，3 個澳洲堅果多肽組分及谷胱甘肽對ABTS+自由基的清除能力均隨樣品質量濃度的增加而增大。不同組分對ABTS+的清除率具有顯著性差異（P＜0.05），G3、谷胱甘肽的清除率高于G1、G2。濃度為0.2、0.4 mg/mL時，3 個多肽組分的清除率均低于谷胱甘肽。隨著濃度的增加，清除率的增加速率大小順序為G1、G2、G3、谷胱甘肽。當濃度達到0.6 mg/mL 時，G3 的清除率為94.35±0.08%，高于谷胱甘肽的清除率91.37%±0.08%；當濃度達到1.0 mg/mL 時，G3 的清除率為94.27%±0.00%與谷胱甘肽94.56%±0.41%無顯著性差異（P＞0.05），優于其它評價樣品，G1 與G2 的清除率分別為89.55%±0.70%、84.57%±0.17%，兩者之間差異性顯著（P＜0.05）。從評價樣品對自由基清除能力的IC50值來看，不同分子量多肽及谷胱甘肽對ABTS+自由基清除能力大小順序為：谷胱甘肽（IC500.00003 mg/mL）＞G3（IC500.02 mg/mL）＞G1（IC500.31 mg/mL）＞G2（IC500.36 mg/mL），G3 對ABTS+自由基的清除能力最強，可能是分子量小的多肽的親水性較好，而ABTS+自由基是一種親水性自由基，小分子肽更易與ABTS+自由基發生反應，從而表現出更好的ABTS+自由基清除能力，這與油茶餅粕多肽分子量較小的組分抗氧化活性更強的研究結果相同[29]。G1 的清除能力優于G2，這可能是受到氨基酸序列與組成的影響[30]。

表3 澳洲堅果多肽不同組分對ABTS+自由基清除能力的回歸方程分析Table 3 Regression equation analysis of different components of macadamia nut polypeptides on ABTS+ radical scavenging ability

圖4 澳洲堅果多肽不同組分對ABTS+自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of different components of macadamia nut polypeptides on ABTS+ radical scavenging ability

2.2.4 不同組分澳洲堅果多肽還原能力分析 還原能力是指物質提供電子的能力，吸光值越大還原能力越強[31]。從圖5 及表4 可以看出，不同分子量的澳洲堅果多肽及谷胱甘肽均具有還原能力，還原能力與濃度呈正相關。G3 組分的還原能力優于G1、G2 及谷胱甘肽。在濃度2.0 mg/mL 時，G3 的還原能力為0.493±0.00，優于其它評價樣品，G1 還原能力最弱為0.130±0.02。隨著濃度的增加，還原能力的增加速率大小順序為G3、谷胱甘肽、G1、G2。當濃度達到10.0 mg/mL 時，G3 的還原能力最優為1.701±0.04，G1、G2 的還原能力分別為0.581±0.01、0.548±0.00，兩者之間無顯著性差異（P＞0.05）。從評價樣品對自由基清除能力的IC50值來看，不同分子量多肽及谷胱甘肽還原能力大小順序為：G3（IC502.19 mg/mL）＞谷胱甘肽（IC504.35 mg/mL）＞G1（IC508.09 mg/mL）＞G2（IC508.63 mg/mL），澳洲堅果蛋白結構中具有還原能力較強的基團，經過酶解被分散到低相對分子量的多肽中，經超濾、葡聚糖凝膠分離后，分子量低的肽段被富集，肽段越短使具有較多電子的基團暴露越充分，因而使G3 表現出最強的還原能力，這與松仁、核桃等植物蛋白的研究結果相同[17,21]。

表4 澳洲堅果多肽不同組分還原能力的回歸方程分析Table 4 Regression equation analysis of different components of macadamia nut polypeptides on reducing power

圖5 澳洲堅果多肽不同組分對還原能力的影響Fig.5 Effect of different components of macadamia nut polypeptides on reducing power

2.3 澳洲堅果多肽組分與抗氧化活性相關性分析

用皮爾森法（Pearson’s）對不同澳洲堅果多肽組分與抗氧化活性指標的IC50值進行相關性分析。結果如表5 所示，澳洲堅果多肽不同組分與羥基自由基清除能力（r=0.953，P＜0.01）、還原能力（r=0.823，P＜0.01）之間存在極顯著相關，與ABTS+自由基清除能力（r=0.796，P＜0.01）之間存在顯著相關，與DPPH 自由基清除能力（r=0.651，P＞0.05）無顯著性相關。結合2.2 中的分析可知分子量最小的G3 組分抗氧化活性最好，多肽的抗氧化活性受其分子量的影響，這可能是分子量小的多肽空間位阻較小，活性基團（巰基、酚羥基）暴露更充分，能更好的與自由基發生反應，表現出更好的抗氧化活性[21-22]。

表5 澳洲堅果多肽組分與抗氧化活性的相關性分析Table 5 Correlation analysis between antioxidant activities and polypeptide components of macadamia nut

葡聚糖凝膠柱層析分離得到的3 個組分對DPPH、ABTS+、羥基自由基清除率、還原能力均隨濃度的增加而增強，在相同濃度條件下G3 組分的抗氧化活性最強，且G3 組分的羥基自由基清除率、還原能力均高于同濃度的谷胱甘肽溶液。各項抗氧化評估指標的IC50值均為G3 組分最優，且ABTS+、羥基自由基清除率及還原能力的IC50值優于谷胱甘肽。以上結果表明純化肽具有更好的清除自由基的能力和還原力，抗氧化活性G3＞G2＞G1。肽的抗氧化活性與其分子量之間存在相關性，其活性可能隨著肽分子量的降低而增加，而抗氧化肽的自由基清除作用可能與氨基酸的組成和序列有關[32]。因此，選擇G3 組分進行多肽結構鑒定研究。

2.4 抗氧化肽的鑒定

采用LC-MS/MS 法檢測G3 分子量以鑒定氨基酸的序列，掃描的范圍為300～1800 Da，總離子流色譜圖見圖6。質譜采集的raw 文件，經過軟件Byonic數據庫檢索，得到46 條肽段，這些肽段長度均小于10 個氨基酸，按匹配值得分高于200 分的9 條肽段進行分析，結果如表6 所示，得分代表著該肽段的可信度，相對豐度值代表著該肽段在被分析組分中的含量。自然界中，某些多肽具有毒性并且會致死，如鵝膏毒肽類、微囊藻肽類、蝎毒肽類等[33]。因此，有必要對澳洲堅果蛋白源的抗氧化肽進行安全性評估，結果如表6 所示，基于氨基酸序列預測9 個肽段無毒性，安全性較高，可進行肽的人工合成，進行細胞或者動物實驗，研究其在食品、醫藥等行業的應用。

表6 G3 組分的肽序列分析Table 6 Peptide sequence analysis of G3 the polypeptide component

圖6 G3 組分總離子流色譜圖Fig.6 Total ion chromatogram of the G3 polypeptide component

大量研究表明，多肽的氨基酸序列、分子量和疏水性對其抗氧化活性影響巨大[34]，疏水性氨基酸在反應體系中的提高肽段在脂質體系中的溶解度，加強肽段與脂溶性自由基如DPPH 自由基的相互作用[35]。Ma 等[36]認為含有2～10 個氨基酸的寡肽比其他大多數多肽或者蛋白質具有更高抗氧化潛力，劉輝等[37]發現的大多數抗氧化活性的多肽分子量低于6000 Da，含有2～20 個氨基酸。本研究鑒定的活性肽分子量較低（631～920 Da），由3～7 個氨基酸殘基組成，這與論文報道的研究結果一致。

Agrawal 等[35]從珍珠粟蛋白水解物分離出的較好抗氧化活性的多肽SDRDLLGPNNQYLPK，認為該肽具有抗氧化能力與肽序列中含有的疏水性氨基酸Gly，Leu 和Pro 有關。Ranathunga 等[38]發現，星康吉鰻蛋白水解物中純化的抗氧化肽由55%的疏水殘基組成肽中的疏水性氨基酸對其抗氧化作用有很大貢獻。由表6 可見有6 條肽段的疏水性氨基酸占比達到60%以上，說明HLLPK、KEFFP、KEFFPA、SWIIN、HFP、SIFFPGPR 肽段賦予了G3 組分較好的抗氧化活性。經預測各多肽的水溶性不同，其中SWIIN、HFP、SIFFPGPR 難溶于水，水溶性好的HLLPK、KEFFP、KEFFPA 肽段更利于進行抗氧化劑、保健品等的開發利用，其二級質譜圖如圖7所示。

圖7 抗氧化肽的二級譜圖Fig.7 Tandem mass spectra of antioxidant peptides

多肽的N 端以酸性氨基酸殘基為主，C 末端為堿性氨基酸殘基[39]。Trp 含有氨基，His 含有咪唑環，Tyr、Phe 含有酚羥基，Met、Cys 含有巰基，這些帶有特征基團的氨基酸殘基存在于肽段中時，能有效增強其自由基清除活性[40]。肽結構中的疏水性氨基酸也與其抗氧化活性密切相關。Met 具有金屬螯合能力，Pro、Leu 可提供質子用于中和活性自由基[41]。相同的疏水性氨基酸同時出現（如Ala-Ala，Leu-Leu 和Pro-Pro 等）能賦予較強的自由基清除活性[35]。以上分析結果表明HLLPK、KEFFP、KEFFPA 肽段疏水性氨基酸占比高，氨基酸數量、結構及分子量符合抗氧化多肽的特征，且具備較好的水溶性有利于產品的開發與應用。

3 結論

分子量小于1000 Da 的澳洲堅果多肽經Sephadex G-15 凝膠柱分離，得到G1、G2、G3 三個組分，其中G3 組分的抗氧化活性最強，DPPH、羥基、ABTS+自由基清除能力及還原能力的IC50值分別為0.5、6.18、0.02、2.19 mg/mL。G3 組分經LCMS/MS 鑒定、分析，得到3 種澳洲堅果抗氧化肽序列為HLLPK、KEFFP、KEFFPA，其分子量分別為606.84、666.83、737.92 Da，疏水性氨基酸占比分別為60%、60%、66.67%。本研究結果可以為澳洲堅果抗氧化肽的人工合成、細胞及動物實驗提供參考和依據，以期篩選獲得功能活性較強的抗氧化肽，研究其作為天然抗氧化劑在食品、藥品或化妝品中的應用。