基于網絡藥理學與分子對接探討沙棘抗肥胖作用機制

陸夢柯，王梓琴，張 春，王 菲，陳志璽，王亞妮，TANG Mengze，劉 蕊，唐旭東,,

（1.甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅蘭州 730000；2.甘農生物科技有限公司，甘肅慶陽 745600；3.波士頓大學，美國馬薩諸塞州 02215；4.深圳清華大學研究院創新中藥及天然藥物研究重點實驗室，廣東深圳 518000；5.廣東省創新中藥及天然藥物研究工程中心，廣東深圳 518000）

近年來，全球肥胖人數飛速增長，肥胖已成為全球范圍日益關注的健康問題。研究表明超重和肥胖不僅會增加死亡風險[1]，也是誘發糖尿病、冠心病、高血壓、脂肪肝、腫瘤等疾病的高危因素[2]。目前，用于治療肥胖的手段有運動、藥物、手術、飲食干預、針灸推拿等[3-5]，然而這些方法卻存在著見效慢、副作用多、難以堅持等問題，因此積極有效輔助干預治療肥胖是當今社會高度關注的問題。

沙棘別名醋柳、酸刺、沙棗，為落葉灌木、小喬木或喬木。果實為假果類，常見黃色、黃綠色、紅色、淺黃色、橘紅色；果型多為圓形和卵型[6]。在我國，沙棘藥用歷史悠久，唐朝時期藏族醫藥早期著作《月王藥診》中記載沙棘可助飲食開胃消化和增強體魄[7]，元朝時蒙古族經典著作《飲膳正要》記載沙棘熬成膏可生津止咳[8]，明朝《本草綱目》記載了沙棘用于治療消化系統疾病的方法[9]。1977 年，沙棘被收錄入《中國藥典》[10]，1989 年，沙棘被列為藥食同源中藥。沙棘富含黃酮、多酚、多糖、維生素和不飽和脂肪酸等活性成分，具有其抗炎、抗癌、調節免疫、抗衰老、抗氧化等作用[11]。現有研究發現，沙棘具有一定降脂減肥的作用[12]，沙棘黃酮可抑制體重增加、改善肝臟脂質累積[13]，沙棘多糖能激活棕色脂肪，改善機體熱量，抑制體重增加和脂質累積[14]。

網絡藥理學以系統生物學、高通量組學、生物信息學為基礎，將藥理與網絡生物相結合，開啟了一種多靶標與多種疾病間復雜網狀關系的新研究模式，賦予了網絡藥理學的整體性、系統性特點，為中醫藥的證候研究、方劑配伍、新藥開發等提供了新的思路和方法[15]。分子對接是一種主要通過電場力分析受體配體的性質特征以及相互作用來預測二者之間結合模式與親和力的一種模擬方法。在中醫藥領域，利用分子對接技術將小分子活性物質與相關的靶蛋白進行對接，可以從分子水平闡明中藥藥效成分與作用機制[16]。網絡藥理學與分子對接技術結合，為闡釋現代中藥（復方）藥效物質基礎和作用機制提供理論基礎與技術支持[17]。

目前對沙棘降脂減肥的研究多集中于某類成分或某一通路靶點，本研究擬通過網絡藥理學與分子對接技術探討沙棘多成分、多靶點、多通路降脂減肥的協同作用機制和沙棘防治肥胖潛在的藥效物質基礎與作用機制，為后續研究及臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘藥材 甘肅甘農生物科技有限公司提供，深圳清華大學研究院馬驥教授鑒定為胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoidesL.的成熟果實；3T3-L1小鼠前脂肪細胞 上海中喬新舟生物科技有限公司；MTT 上海麥克林生化科技有限公司；PBS 磷酸鹽緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清、DEME高糖培養基、0.25%胰酶消化液、青霉素-鏈霉素溶液 美國Gemini 公司；小牛血清 美國Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）、乙醇 分析純，四川西隴科學有限公司；石油醚 分析純，天津市大茂化學試劑廠。

AG 135 電子天平 瑞士梅特勒托利多公司；MOV-313 P 熱風干燥箱、MCO-15 A CO2細胞培養箱 日本SANYO 公司；CK 40-32 PH 倒置顯微鏡

日本OLYMPUS 公司；冰箱 海爾集團；生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司；400 R 離心機、Multiskan FC 酶標儀 美國Thermo 公司；水浴鍋群安實驗儀器有限公司；CR-30 B+超純水機 上海杲森儀器設備有限公司；液氮罐 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 網絡藥理學與分子對接

1.2.1.1 沙棘活性成分及其對應靶點篩選 使用中藥系統藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine System Pharmacological，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索沙棘的活性成分，并設置藥代動力學參數口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 對活性成分初步篩選[18]，獲得有效成分及其相關作用靶點。將獲得的靶點導入UniProt 數據庫（https://www.uniprot.org/）對其名稱進行校正，去除無對應靶點的蛋白質，得沙棘化合物靶點集。將最終獲得的沙棘有效成分及靶點信息導入至Cytoscape 3.9.1，生成“活性成分-作用靶點”相互關系網絡圖。

1.2.1.2 肥胖靶點篩選 以“obesity”為關鍵詞，對人類孟德爾遺傳綜合數據庫（online mendelian inheritance in man，OMIM），GeneCards 數據庫，DisGe-NET 數據庫，TTD（Therapeutic Target Database）靶點數據庫進行檢索。將四個數據庫內的搜索結果進行合并去重，得到肥胖靶點。

1.2.1.3 繪制韋恩圖及蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡 將上述所得沙棘活性成分靶點與肥胖靶點導入Venny 2.0.2（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index 2.0.2.html），繪制VEEN 圖，得到沙棘靶點與肥胖靶點的交集靶點，即為沙棘抗肥胖的潛在靶點。將交集靶點上傳至STRING 數據庫平臺（Search tool for recurring instances of neighbouring genes，https://cn.string-db.org/），在“Multiple proteins”項下種類定義為“Homo sapiens”進行分析，設定最低互相作用評分條件為0.400，即中等置信度[minimum required interaction score：medium confidence（0.400）]，隱藏游離節點，建立藥物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用網絡，結果以TSV 格式文件導出。使用CytoScape 3.9.1 軟件對結果進行拓撲分析，計算度（degree）值，并以degree≥60 為界限篩選出沙棘抗肥胖的核心靶點。

1.2.1.4 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析

將上述所得交集靶點導入David 數據庫https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp，“select identifier”項選為官方基因名official gene symbol，種屬選為人Homo sapiens，進行基因本體論Gene Ontology（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析，得到GO 功能富集分析圖和KEGG 通路分析圖。

1.2.1.5 成分-靶點-信號通路網絡的構建 將上述各項得到的沙棘活性成分、交集靶點與KEGG 信號通路信息導入Cytoscape 3.9.1 構建沙棘成分-靶點-信號通路網絡圖。

1.2.1.6 分子對接 選擇沙棘抗肥胖的PPI 網絡中的關鍵靶點與其對應的潛在活性成分進行分子對接。在PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/structure）中下載關鍵靶點的pdb 格式，在TCMSP 數據庫中下載活性成分的mol 2 格式。利用Autodock Dock 1.5.7 軟件進行去水加氫處理后保存，并將抗肥胖的關鍵靶點與相應活性成分進行分子對接。分子對接結果用Pymol 2.2.0 進行可視化處理。

1.2.2 體外細胞實驗

1.2.2.1 沙棘提取物制備 沙棘鮮果洗凈挑揀后，50 ℃鼓風干燥。陰涼通風處密封貯存。

沙棘水提物[19]：稱取15.00 g 沙棘干果，加入150 mL 超純水，浸泡1 h，水浴回流1 h，放冷抽濾，收集濾液；重復提取三次，每次1 h。合并濾液，旋蒸水浴揮至浸膏狀，-80 ℃凍存。

沙棘油[20]：稱取120.00 g 沙棘果，加1200 mL石油醚（沸程30～60 ℃）浸泡過夜，索氏回流提取至無色。提取液旋蒸、水浴揮干溶劑，得沙棘油，4 ℃保存。

1.2.2.2 MTT 法檢測細胞增殖 對數生長期的3T3-L1 小鼠前脂肪細胞，棄去完全培養基，加入1 mL PBS 清洗后，用1 mL 胰酶消化2～3 min，加入3 mL完全培養基終止消化。離心后，棄去廢液，加入1 mL完全培養基，使用計數板計數。調整細胞濃度為35000 個/mL，接種于96 孔板，每孔加入100 μL 細胞懸液。設置空白組（含100 μL 完全培養基）、對照組（含細胞的100 μL 細胞培養液）、藥物組（沙棘水提物、沙棘油濃度分別設置為100、125、250、500 μg·mL-1），每組3 個復孔。細胞培養24 h 后，吸去各藥物組培養基，加入含不同濃度藥物的完全培養基，培養24、48、72 h。每孔加入10 μL MTT，放入培養箱培養4 h，取出，棄去培養基，每孔加入150 μL DMSO。放入酶標儀，振蕩5 min，于570 nm處測其吸光度，計算細胞存活率[21]。

1.3 數據處理

使用Graph Pad Prism 9.0.0 等軟件進行數據統計分析，組間差異均使用單因素方差分析，P＜0.05 表示存在顯著性差異，兩兩比較用LSD-T 檢驗。

2 結果與分析

2.1 網絡藥理學與分子對接

2.1.1 沙棘活性成分及其對應靶點 基于TCMSP數據庫篩選符合OB≥30%、DL≥0.18 值的活性成分共33 個，其中22 個活性成分有對應靶點（表1），沙棘活性成分對應靶點蛋白去重后共196 個。繪制沙棘活性成分與靶點網絡圖（圖1）。

表1 沙棘活性成分表Table 1 Active components of Hippophae fructus

2.1.2 肥胖靶點 通過OMIM 數據庫、GeneCards-數據庫、DisGeNET 數據庫、TTD 數據庫檢索肥胖相關基因，篩選DisGeNET 數據庫中Score≥0.02 的靶點，GeneCards 數據庫中Relevance＞1.247 的靶點，將所得的肥胖靶點合并去重，共得2971 個疾病靶點。

2.1.3 韋恩圖及PPI 網絡 將沙棘活性成分靶點及疾病靶點導入Venny，繪制Veen 圖（圖2）得到二者交集靶點，即得沙棘治療肥胖的潛在靶點151 個，包括TNF、IL6、CASP3、FOS、MAPK8、PPARA。將151 個交集靶點導入String 在線數據庫，獲得PPI 網絡圖（圖3），利用CytoScape 3.9.1 軟件進行拓撲分析。以degree≥60 篩選出33 個核心作用靶點：AKT1、TNF、IL6、TP53、VEGFA、IL1B、CASP3、CTNNB1、ESR1、PPARG、PTGS2、HIF1A、EGFR、MYC、MMP9、EGF、PTEN、FOS、CXCL8、CAT、CCND1、CCL2、NFKBIA、IL10、NOS3、HMOX1、MMP2、ERBB2、ICAM1、RELA、CASP8、BCL2L1、MAPK8。

圖2 沙棘靶點與肥胖靶點交集韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the intersection of Hippophae fructus targets and obesity targets

圖3 PPI 蛋白網絡圖Fig.3 PPI protein network diagram

2.1.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析將交集靶點呈遞到David 數據庫進行KEGG 通路富集分析和GO 功能分析。

KEGG 分析結果顯示共有173 條富集顯著的信號通路，對count 值≥25 的信號通路進行氣泡圖展示，結果見圖4。其中惡性腫瘤通路顯示出較強關聯，沙棘抗肥胖的其他相關信號通路有：脂質與動脈粥樣硬化通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 信號通路、剪切力與動脈粥樣硬化通路、乙型肝炎等。

圖4 KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig.4 Bubbles in enrichment analysis of KEGG pathway

GO 富集分析包括GO 生物過程（biological process，BP）分析、分子功能（molecular function，MF）分析和細胞組分（cellular component，CC）分析。選取count 值≥25 的GO 各項富集分析結果進行統計學分析，按照相關度排列。GO-BP 分析結果表示沙棘主要通過RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、基因表達的正調控、DNA 轉錄正調控、信號轉導、凋亡過程負調控等生物過程發揮抗肥胖的作用（見圖5）；GO-CC 分析結果表示可通過細胞溶質、細胞核、質膜等細胞組分達到治療肥胖的效果（見圖6）；GO-MF 分析結果表示沙棘可通過蛋白結合、同蛋白結合、酶結合、蛋白質同源二聚活性等分子功能治療肥胖（見圖7）。

圖5 GO-BP 分析結果Fig.5 Analysis results of GO biological process

圖6 GO-CC 分析結果Fig.6 Analysis results of GO cellular component

圖7 GO-MF 分析結果Fig.7 Analysis results of GO molecular function

2.1.5 成分-靶點-信號通路網絡的構建 將篩選所得沙棘活性成分、藥物-疾病交集靶點與KEGG 信號通路信息導入Cytoscape 3.9.1 軟件構建沙棘成分-靶點-信號通路網絡圖，結果見圖8。此網絡圖共計186 個節點和724 條邊，其中22 個紅色菱形節點表示沙棘活性成分，13 個紫色六邊形節點表示信號通路，151 個藍色圓形節點表示交集靶點蛋白。從該圖中可知活性成分SJ22（Quercetin）、SJ14（Kaempferol）、SJ12（Beta-sitosterol）、SJ11（Isorhamnetin）SJ16（Stigmasterol）、SJ10（Beta-carotene）、SJ1（Pelargonidin）可能是沙棘治療肥胖的關鍵活性成分，惡性腫瘤、脂質和動脈粥樣硬化、PI3K-Akt 可能是關鍵作用通路。該分析結果展示出沙棘治療肥胖病癥過程中多成分、多靶點、多通路協同作用的特點。

圖8 成分-靶點-信號通路網絡Fig.8 Pathway network of components-targets-signalings

2.1.6 分子對接 選擇沙棘抗肥胖的PPI 網絡中度值≥95 的關鍵靶點AKT1、IL-6、VEGFA、TNF 與其對應的潛在活性成分進行分子對接驗證。對接結合能見表2。結合能＜0 kcal·mol-1，表明受體分子與配體分子能自發結合，結合能≤-5.0 kcal·mol-1表明受體與配體之間有較好的結合活性。結合能絕對值越高，對接能力越強，對接后分子穩定性越高，均方根偏差（RMSD）越小表示對接結果越準確。部分分子對接結果可視化見圖9。

圖9 成分-靶點對接可視化Fig.9 Visualization of component-target docking

表2 分子對接結合能Table 2 Binding energy of molecular docking

2.2 MTT 檢測沙棘提取物對3T3-L1 小鼠前脂肪細胞增殖作用的影響

3T3-L1 小鼠前脂肪細胞具有增殖分化的能力，是常用的體外脂肪生成模型[22]。脂肪細胞數目擴增和體積肥大是影響體內脂肪總重的主要因素，細胞數量受到細胞凋亡和增殖等活動的影響，因此抑制脂肪增殖、誘導細胞凋亡也被視為肥胖治療手段[23]。

利用MTT 法檢測沙棘提取物不同濃度、不同作用時間對3T3-L1 前脂肪細胞的增殖的影響，結果見圖10。由圖10A 可知，與對照組相比，沙棘水提物與沙棘油作用于3T3-L1 前脂肪細胞24 h 后，125、250 μg·mL-1沙棘水提物與100、125 μg·mL-1沙棘油對細胞有短暫的促增殖效果（P＜0.01，P＜0.05），100 μg·mL-1沙棘水提物與250 μg·mL-1沙棘油無較為明顯變化。250 μg·mL-1的沙棘水提物與沙棘油則表現出抑制細胞增殖的效果（P＜0.01，P＜0.05）。隨著藥物作用時間的增長至48 h（見圖10B），除250 μg·mL-1的沙棘水提物與100 μg·mL-1的沙棘油外與對照組無顯著性差異外，其余各組均表現出顯著抑制細胞增殖的效果（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。藥物作用時間至72 h 后，除100 μg·mL-1沙棘油與對照組相比無顯著性差異外，其余各組均表現出顯著抑制細胞增殖的效果（見圖10C）（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

圖10 沙棘提取物對3T3-L1 小鼠前脂肪細胞增殖的影響Fig.10 Effect of Hippophae fructus extracts on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

3 討論與結論

本研究采用網絡藥理學和分子對接技術探討沙棘抗肥胖的有效成分和作用機制，并利用3T3-L1 小鼠前脂肪細胞進行體外驗證。

本研究篩選出22 個具有對應靶點的沙棘活性成分，槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、α/β-谷甾醇、麥角甾烯醇、表兒茶素可能為沙棘抗肥胖潛在活性成分。研究表明，槲皮素能改善與代謝綜合征相關的異常，如肥胖、血脂異常和葡萄糖不耐受等病癥[24]，它能通過靶向PPARα/γ調控糖異生改善肝臟脂肪蓄積[25]。山奈酚可促進成熟脂肪細胞中Cebpa基因表達的下調和脂質積累的減少，調節3T3-L1 細胞的成脂分化，進而達到抗肥胖作用，也可通過調節能量平衡、下丘腦炎癥相關中樞過程、腸道菌群等途徑達到抗肥胖的目的[26-28]。β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素的一種，也是維生素A 的主要來源。類胡蘿卜素可參與脂肪組織代謝和炎癥的調節，β-胡蘿卜素通過β3-AR/p38 MAPK/SIRT 信號通路上調調節脂肪分解和脂肪氧化，誘導3T3-L1 白色脂肪細胞褐變[29]。

通過構建沙棘與疾病的靶點Veen 圖與PPI 網絡，篩選出151 個沙棘抗肥胖的潛在作用靶點。AKT1 是脂肪細胞分化和克隆擴增過程中極為重要的信號分子[30]，周坤[31]研究表明山楂多糖、黃酮提取物能夠通過PI3K/AKT 通路起到調節肥胖小鼠糖脂代謝異常的作用。白色脂肪組織中的脂肪細胞以及M1 巨噬細胞可分泌大量的TNF-α及IL-6 等促炎因子，加快肥胖及其相關代謝病的發展[32]，高脂小鼠表現出明顯的體質量增加、糖脂代謝紊亂、回腸炎癥水平增加[33]。IL-6 因子可促進脂肪組織脂解，刺激脂質代謝[34]。嚴歡等[35]發現小麥麩皮多酚提取物能降低大鼠肝勻漿中IL-6、TNF-α等因子的含量，減輕肥胖引起的慢性炎癥，減肥效果良好。VEGFA 為血管內皮生長因子，能促進血管生成、增強血管通透性，調節脂肪組織的分化和能量代謝等過程[36]，VEGFA表達下調后能夠促進白色脂肪的棕色化，降低體重、增強葡萄糖清除能力以及胰島素敏感性，并且對高脂食物誘導的肥胖具有一定的抗性[37]。

結合篩選得到的沙棘抗肥胖交集作用靶點，進行KEGG 通路分析和GO 功能分析，探討其抗肥胖分子作用機制。結果提示惡性腫瘤通路富集靶點最多，是沙棘抗肥胖較為顯著通路。肥胖是癌癥誘發因素之一，研究發現子宮內膜癌[38]、乳腺癌[39]、結直腸癌[40]、甲狀腺癌[41]等都與肥胖有密切的關系[42]。肥胖相關癌癥的發生與體內生長激素和脂肪因子水平升高、腸道菌群失調、腫瘤代謝改變和慢性低度炎癥等微環境變化有著密切關系[43-44]，脂肪細胞分泌高水平的IL-6、TNF、脂肪因子和瘦素，組織炎癥加重，促進癌細胞增殖[45]。研究人員通過癌癥與肥胖等代謝疾病間的相關性研究，期望達到早期識別、應對癌癥發生[46]。沙棘成分-靶點-通路圖表明沙棘可通路多成分、多靶點、多通路的協同作用達到抗肥胖。將AKT1、TNF、IL-6、VEGFA 四個核心靶點與對應活性成分進行分子對接驗證，結果表明各結合能均＜-7 kcal·mol-1，對接結果良好，有較好的結合活性。體外細胞實驗表明，濃度為100、125、250 μg·mL-1的沙棘水提物與沙棘油短時間（24 h）作用于3T3-L1 前脂肪細胞，促進細胞增殖。隨著藥物作用時間的增長（48 h），各個濃度（100～500 μg·mL-1）的沙棘水提物與沙棘油均表現出一定的抑制細胞增殖的作用（250 μg·mL-1的沙棘水提物與100 μg·mL-1的沙棘油除外）。在作用時間達到72 h 時，僅100 μg·mL-1的沙棘油與對照組差異不顯著，各組藥物對抑制細胞增殖均有顯著效果（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

綜上所述，本研究探討了沙棘抗肥胖的潛在有效成分和作用機制，為進一步臨床研究和產品開發提供參考。