芋淀粉合成酶基因家族的鑒定、生物信息學及表達分析

何芳練,劉莉莉,邱祖楊,董偉清

(1.廣西壯族自治區農業科學院蔬菜研究所,南寧 530007;2.荔浦市農業農村局,廣西 荔浦 546600)

【研究意義】淀粉是大多數植物的主要儲存碳水化合物,是人類飲食中熱量的重要來源,也是一種廉價、可再生的原材料,可用于許多非食品用途,包括紙張、紡織品、藥品、醇基燃料、染料、黏合劑和建筑材料制造等[1-2]。淀粉由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成,其中直鏈淀粉對淀粉的特性有重要影響,由α-1,4糖苷鍵連接形成的葡萄糖鏈占天然淀粉的5%～35%[2-3]。芋[Colocasiaesculenta(L). Schott ]是一種富含淀粉的塊莖類作物,在熱帶和亞熱帶地區廣泛栽培。我國有2000多年的芋栽培歷史,是世界第二大芋生產國和最大出口國[4-5],但我國芋主產區均存在品種退化,產量、品質下降等問題[6]。球莖是芋的主要食用器官,其淀粉占球莖干物質含量的70%～80%[5, 7]。目前,芋淀粉生物合成已有相關報道,一些參與淀粉生物合成相關的酶基因已被鑒定[8-9],包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)[10-12]、淀粉合成酶(Starch synthase,SS)[13-14]、淀粉分支酶(Starch branching enzyme,SBE)[15-16]等,其中對AGPase和SBE基因家族的結構特征和表達模式已經進行了較深入的研究,但針對芋SS(CeSS)基因家族信息的了解非常有限,因此,有必要在全基因組范圍內鑒定CeSS基因家族的候選基因并明確其表達模式,以促進芋的產量提高和品質改良。【前人研究進展】淀粉在植物中的生物合成已有許多相關報道,淀粉由不同系列的酶協同作用合成,包括AGPase、SS、SBE、淀粉脫分支酶(Starch debranching enzyme,DBE)和淀粉磷酸化酶(Starch phosphorylase,Pho)等[17-21],其中,SS在直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成過程中發揮重要作用[21-22]。SS家族屬于碳水化合物活性酶第5家族的旁系家族,由至少6個保守糖基轉移酶(Glycosyl transferase,GT)組成,C-末端具有GT5和GT1組成的保守GT催化結構域,N-末端具有可變結構域,包括盤繞結構域(Coiled-coil domain)和碳水化合物結合模塊(Carbohydrate-binding module,CBM)等[23]。SS家族分為5種類型,分別為SSI、SSII、SSIII、SSIV、GBSS[24]。SSI在支鏈淀粉生物合成中將聚合度((Degree of polymerization,DP)為6～7的短葡聚糖鏈延長成DP 為8～12的葡聚糖鏈[25-28];SSII進一步延長支鏈淀粉中DP小于10的短葡聚糖鏈[19,29-30];SSIII產生長葡聚糖鏈并連接多個支鏈淀粉簇[31-33];SSIV影響淀粉顆粒的大小和形狀,也具有延長葡聚糖鏈的功能[34-35];GBSS主要參與直鏈淀粉生物合成,具有2個成員(GBSSI和GBSSII),GBSSI負責胚乳的直鏈淀粉生物合成,而GBSSII負責葉片的直鏈淀粉生物合成[3,22,36]。SS在植物淀粉生物合成和品質改良方面發揮著重要作用,如抑制小麥SSI或SSIIIa基因的表達會導致淀粉顆粒形態、大小和精細結構發生顯著變化[28,33];SSII基因缺失會使淀粉理化性質發生改變,增加直鏈淀粉的含量[30,37-39];GBSSI基因缺失不會顯著改變淀粉含量,但會使支鏈淀粉含量減少[24];通過CRISPR/Cas9技術對水稻、木薯和馬鈴薯的GBSSI基因進行編輯,成功創制低直鏈淀粉或無直鏈淀粉的新種質[40-42];通過對大麥和小麥的SSIIa進行基因編輯,成功創制了高直鏈淀粉新種質[43-44]。【本研究切入點】雖然芋SSI和SSII基因的cDNA序列已被測定和分析,但CeSS基因家族結構特征和表達模式仍不清楚,亟待研究。【擬解決的關鍵問題】使用HMMER 3.12b軟件鑒定芋基因組中CeSS基因家族信息,并對其分子結構特征、系統發育關系、順式作用元件及表達模式進行分析,以加強對CeSS基因家族成員的了解,并為芋產量、品質和營養性狀的遺傳改良提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試芋材料為芋新品種荔浦芋1號,該品種為魁芋類型,具有產量高、品質優和耐儲藏等特點。芋在播種90 d(3月齡)后,球莖淀粉含量迅速上升,為整個生育期淀粉含量上升最快的階段,此時球莖也進入快速膨大發育期[8,15]。因此,選擇播種90 d的球莖、葉片、葉柄和根用于CeSS基因的空間表達分析;選擇播種30、60、90 d的球莖用于CeSS基因的時序性表達分析。選擇播種90 d的芋植株進行干旱處理,對照組保持每天澆水,處理組自然干旱7 d(2張新葉保持正常發育,其余葉片從邊緣開始干枯),采集對照組和處理組根、葉片和球莖用于CeSS基因在干旱脅迫下的表達分析。所有樣品均設置3次生物學重復,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 CeSS蛋白鑒定和系統發育分析 從國家基因庫生命大數據平臺(https://db.cngb.org/)下載芋參考基因組數據,使用HMMER 3.12b以SS基因家族典型保守結構域Glyco_transf_5(Pfam登錄號:PF08323)為模型預測CeSS蛋白,E值閾值設為小于2.7e-15。使用NCBI保守結構域數據庫(CDD v3.20,E值設置為0.01)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和SMART數據庫(http://smart.embl.de)進一步驗證候選CeSS蛋白序列的保守結構域。分別從TAIR數據庫(http://www.arabidopsis.org)和RGAP數據庫(http://rice.plantbiology.msu.edu)下載擬南芥和水稻的SS家族蛋白序列,使用MEGA 7.0對芋、水稻和擬南芥的SS蛋白序列進行序列比對,使用鄰接法構建系統發育樹(Bootstrap值為1000次)。

1.2.2 CeSS蛋白特性和基因結構分析 ExPASy軟件(http://web.expasy.org/protparam)可預測蛋白序列的各種物理和化學參數,包括分子量、理論等電點、氨基酸組成、原子組成、消光系數、估計半衰期、不穩定指數、脂肪族指數和平均親水性(GRAVY)等 ,使用該軟件預測CeSS蛋白的分子量和理論等電點;MEME 5.5.1(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)是可預測蛋白質motif的在線工具,使用該軟件預測CeSS蛋白的保守motif(E閾值設置為小于2.60e-04);InterPro數據庫(http://www.ebi.ac.uk/interpro)通過將蛋白分類為家族并預測結構域和重要部位來提供蛋白質的功能分析,使用該數據庫對預測的motif進行功能注釋;使用NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)和InterPro數據庫預測CeSS蛋白的保守結構域;GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org)可用于基因注釋特征的可視化,使用該軟件預測CeSS基因結構特征;PlantCARE數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)是一個預測植物順式作用元件的在線工具,使用該軟件對CeSS基因上游2 kb序列預測啟動子區域的順式作用元件。

1.2.3CeSS基因轉錄組分析 對CeSS基因在正常生長條件下芋不同組織、球莖不同發育階段及干旱脅迫下的轉錄表達情況進行分析。對播種90 d的球莖、葉片、葉柄和根開展轉錄組測序,從轉錄組數據中提取CeSS基因的FPKM(Fragments per kilobase per million mapped reads)值,分析CeSS基因在不同組織的表達差異;對發育30、60、90、120、150 和240 d的球莖組織開展轉錄組測序,從轉錄組數據中提取CeSS基因的FPKM值,分析CeSS基因在球莖不同發育階段的表達差異。對干旱脅迫試驗中對照組和處理組的球莖、葉片和根進行轉錄組測序,從轉錄組數據中提取CeSS基因的FPKM值,分析CeSS基因在干旱脅迫下的表達差異。利用CeSS基因的FPKM值,在百邁客云平臺(https://international.biocloud.net/zh/software/tools/detail/small/305)繪制CeSS基因在正常生長條件下不同組織、球莖不同發育階段及干旱脅迫下的聚類熱圖。

1.2.4CeSS基因實時熒光定量PCR分析 使用植物多糖多酚總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,DP441]提取所有樣品總RNA,使用TIANScript Ⅱ cDNA 第一鏈合成試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司,KR107]將提取的總RNA 反轉錄成cDNA 第一鏈。以正常生長條件下不同組織、球莖不同發育階段以及干旱脅迫下對照組和處理組的cDNA為模板,使用Analytik Jena qTOWERE2.2 熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR試驗。根據CeSS基因序列信息,利用Primer 5.0設計實時熒光定量PCR引物(表1),以芋Actin基因為內參基因[11]。使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司,Q711-02)進行實時熒光定量PCR檢測。反應體系(20.0 μL):2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,模板cDNA 1.0 μL,雙蒸水補足20.0 μL。反應程序:95 ℃預變性30 s;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,進行40個循環。每個樣品3次重復,采用2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量[45]。

表1 CeSS基因的實時熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 CeSS蛋白鑒定及系統發育分析

使用SS基因家族典型保守結構域Glyco_transf_5(Pfam登錄號PF08323)為模型鑒定芋SS基因家族。通過HMMER 3.12b軟件在芋基因組中共鑒定出6個CeSS基因,并根據擬南芥中的同源基因分別命名為CeSS1、CeSS2、CeSS3-1、CeSS3-2、CeSS4和CeGBSS1。6個預測的CeSS基因長度為4980～61 347 bp,對應的CDS長度為1275～2895 bp,編碼蛋白的氨基酸殘基數量為424～964個,分子量為48 067.43～109 391.75 Da,理論等電點為5.18～6.11(表2)。CeSS基因在基因長度、編碼蛋白大小、分子質量和理論等電點的差異可能反映其在各種生物過程中的功能差異。

系統發育關系對于了解基因家族的結構及多個植物物種的進化歷史至關重要。為了揭示芋SS蛋白的進化關系,本研究構建了芋、水稻和擬南芥SS蛋白的系統發育進化樹。23個SS蛋白被分成5個亞家族,CeSS蛋白在5個亞家族均有分布,其中CeSS3-1蛋白和CeSS3-2蛋白分布在亞家族3。在水稻和擬南芥中,5個亞家族也均有SS蛋白分布,其中擬南芥在亞家族4包含2個SS蛋白(AtSS4-1和AtSS4-2);而在水稻中,除了亞家族1只包含1個SS蛋白(OsSS1)外,其余4個亞家族包含至少2個SS蛋白(圖1)。

CeSS1、CeSS2、CeSS3-1、CeSS3-2、CeSS4和CeGBSS1為芋SS蛋白,OsSS1、OsSS2-1、OsSS2-3、OsSS3-1、OsSS3-2、OsSS4-1、OsSS4-2、OsSS4-3、OsGBSS1和OsGBSS2為水稻(Oryza sativa)SS蛋白,AtSS1、AtSS2、AtSS3、AtSS4-1、AtSS4-2和AtGBSS1為擬南芥(Arabidopsis thaliana)SS蛋白。CeSS1, CeSS2, CeSS3-1, CeSS3-2, CeSS4 and CeGBSS1 are taro SS proteins, OsSS1, OsSS2-1, OsSS2-3, OsSS3-1, OsSS3-2, OsSS4-1, OsSS4-2, OsSS4-3, OsGBSS1 and OsGBSS2 are rice (Oryza sativa) SS proteins, AtSS1, AtSS2, AtSS3, AtSS4-1, AtSS4-2 and AtGBSS1 are Arabidopsis thaliana SS proteins.

2.2 CeSS基因結構和保守motif分析

使用GSDS 2.0軟件對6個CeSS基因結構進行分析,結果如圖2-A所示,6個CeSS基因外顯子數量為7～15個,說明這些基因在進化和功能上產生了差異,進一步支持了CeSS基因的進化分析結果。為進一步探究CeSS蛋白結構多樣性并預測其功能,使用MEME 5.5.1軟件在6個CeSS蛋白中鑒定出10個保守motif,并在InterPro數據庫中進行注釋。結果有7個motif獲得了注釋,其中motif 2和motif 5注釋為淀粉合成酶催化結構域(Starch synthase catalytic domain,PF08323),motif 1和motif 3注釋為糖基轉移酶群組1(Glycosyl transferases group 1,PF00534/PF13692),mitof 4、motif 8和motif 10注釋為糖原磷酸化酶B(Glycogen phosphorylase B,G3DSA:3.40.50.2000);大部分CeSS蛋白同時含有motif 2和motif 5(淀粉合成酶催化結構域),而CeSS3-1蛋白和CeSS3-2蛋白僅包含其中1個;除CeSS3-2蛋白外,其余CeSS蛋白均含有motif 1和motif 3(糖基轉移酶群組1)、mitof 4和mitof 8(糖原磷酸化酶B)(圖2-B,表3)。使用NCBI數據庫和SMART數據庫對CeSS蛋白的保守結構域進行預測,結果如表4所示,所有CeSS蛋白均含有淀粉合成酶催化結構域;除CeSS3-2蛋白外,所有CeSS蛋白都含有糖基轉移酶群組1。6個CeSS基因在外顯子數量、保守motif和保守結構域的差異可能反映了不同CeSS基因在進化歷史和功能方面的差異。

A: 基因結構分析;B: 保守motif分析。A: Gene structure analysis; B: Conserved motif analysis.

表3 CeSS蛋白保守motif及功能注釋情況

表4 CeSS蛋白的保守結構域分析

2.3 芋CeSS基因啟動子區域順式作用元件分析

為了研究CeSS基因家族的調控作用,提取6個CeSS基因起始密碼子上游2 kb的序列,使用PlantCARE數據庫預測該區域的順式作用元件。共預測到73個順式作用元件,其中36個具有功能注釋。6個CeSS基因啟動子除了具有核心元件 TATA-box和CAAT-box外,還存在大量與光響應、激素響應、脅迫響應及生長發育等相關元件(表5)。所有CeSS基因啟動子均含有5～8個光響應元件,說明這些基因可能受光的調控。

表5 芋CeSS基因啟動子區域順式作用元件分析

6個CeSS基因啟動子共有生長素、水楊酸、赤霉素、茉莉酸甲酯和脫落酸5種激素響應元件,每個基因至少含有3個以上激素響應元件。其中只有CeSS3-1基因含有生長素響應元件TGA-element;除CeSS3-2基因外,其余基因啟動子均含有水楊酸響應元件TCA-motif;除CeSS4基因外,其余基因啟動子均含有茉莉酸甲酯響應元件CGTCA-motif和TGACG-motif;除CeSS3-1基因外,其余基因啟動子均含有脫落酸響應元件ABRE;CeGBSS1基因含有赤霉素響應元件GARE-motif和P-box,而CeSS2和CeSS4基因僅含有P-box。CeSS基因家族啟動子含有多種激素響應元件,且不同基因在激素響應元件方面存在差異,說明這些基因可能受到多種激素調控,且不同基因可能存在不同調控方式。

在生長發育相關元件中,CeSS1、CeSS2、CeSS3-2和CeSS4基因啟動子含有與分生組織表達相關的調節元件CAT-box;CeSS1、CeSS3-2和CeSS4基因啟動子含有與蛋白代謝相關的調節元件O2-site;CeSS3-2基因啟動子含有種子特異性調控元件RY-element;CeGBSS1基因啟動子含有晝夜節律調節元件circadian。CeSS基因家族啟動子含有與生長發育相關的元件,說明這些基因可能與芋生長發育密切相關。

在脅迫響應相關元件中,所有CeSS基因啟動子至少含有1個厭氧誘導相關調節元件(ARE和GC-motif);CeSS1基因啟動子含有干旱誘導相關元件MBS;CeGBSS1基因啟動子含有低溫響應元件LTR;CeSS1和CeSS3-1基因啟動子含有防御和壓力響應元件TC-rich repeats。CeSS基因家族啟動子含有脅迫響應相關的元件,說明這些基因可能響應厭氧脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫及防御和壓力脅迫等逆境脅迫。

2.4 芋CeSS基因在正常生長發育條件下的轉錄表達分析

為了研究CeSS基因在芋正常生長發育中的功能,對植株正常發育90 d的不同組織(球莖、葉片、葉柄和根)和球莖不同發育階段(30、60、90、120、150 和240 d)的樣品進行轉錄組測序,從轉錄組數據中提取CeSS基因家族的FPKM值,對其在不同組織和球莖不同發育階段的表達模式進行分析。在不同組織中,CeGBSS1基因在球莖、葉片和葉柄中高表達。其中,以葉片的表達量最高,FPKM值為1036.25;其次為球莖和葉柄,FPKM值分別為529.28和255.90;根的表達量最低,FPKM值為51.06。CeSS2、CeSS3-1和CeSS3-2基因在葉片(FPKM值為64.34～98.84)和球莖(FPKM值為27.30～34.24)的整體表達量高于葉柄(FPKM值為18.12～27.09)和根(FPKM值為10.33～13.02)。CeSS1基因在所有組織中均有表達,但表達量較低(FPKM值為1.02～7.25)(圖3)。在芋球莖不同發育階段中,CeGBSS1基因在所有發育階段均有較高的表達量(FPKM值為65.81～332.50),表達量呈先升高后降低趨勢,其中120 d時表達量最高;與30 d相比,120和150 d的表達量差異達顯著水平(P<0.05,下同)。CeSS1、CeSS2、CeSS3-1、CeSS3-2和CeSS4基因在芋球莖所有發育階段均有表達,但表達量較低,FPKM值低于20.00(圖4)。

聚類熱圖根據CeSS基因的FPKM值繪制,基因表達變化的差異以綠色-紅色標度顯示,圖例數字是對FPKM值進行歸一化的數值,下同。The clustering heat map was drawn according to the FPKM value of the CeSS gene. The difference in gene expression changes was shown on a green-red scale. The legend number was the normalised value of the FPKM value. The same as below.

TS1、TS2、TS3、TS4、TS5和TS6分別代表發育30、60、90、120、150和240 d的球莖。TS1, TS2, TS3, TS4, TS5 and TS6 represented taro corms developing at 30, 60, 90, 120, 150 and 240 days, respectively.

2.5 CeSS基因在干旱脅迫下的轉錄表達分析

為了研究CeSS基因響應干旱脅迫的轉錄表達,對播種90 d的植株進行干旱脅迫,對照組保持每天澆水,處理組自然干旱7 d,分別對對照組和處理組的球莖、葉片和根進行轉錄組測序,從轉錄組數據中提取CeSS基因家族的FPKM值,對其在干旱脅迫下的表達模式進行分析。如圖5所示,在球莖中,CeSS基因家族在干旱脅迫下的轉錄表達均下降,但下降幅度低于葉片,其中CeGBSS1基因的FPKM值從1360.31下降到933.51;CeSS2、CeSS3-1和CeSS3-2基因的FPKM值分別從148.44、65.35和64.51下降到49.66、45.91和47.70。在葉片中,CeSS基因家族在干旱脅迫下的轉錄表達也均下降,其中CeGBSS1基因的FPKM值從1451.21下降到493.08;CeSS2、CeSS3-1和CeSS3-2基因的FPKM值分別從153.45、99.06和105.03下降到72.80、63.64和59.78。在根中,CeSS基因家族在干旱脅迫下的轉錄表達略有降低,其中CeGBSS1基因的FPKM值從184.53下降到170.32。

DCC1、DCL1和DCR1分別代表對照組的球莖、葉片和根,DCC2、DCL2和DCR2分別代表干旱脅迫處理組的球莖、葉片和根。DCC1, DCL1 and DCR1 represented corm, leaf and root in controls, respectively, and DCC2, DCL2 and DCR2 represented corm, leaf and root in drought treatments, respectively.

2.6 CeSS基因的實時熒光定量PCR檢測

使用實時熒光定量PCR進一步驗證轉錄組數據的準確性。在正常生長發育條件下,CeSS基因在葉片和球莖的整體表達量均高于葉柄和根,其中CeSS2、CeSS3-1、CeSS3-2和CeGBSS1基因在葉片和球莖的相對表達量極顯著高于根和葉柄(P<0.01,下同);CeSS4基因在球莖的相對表達量極顯著高于其他組織;CeSS1基因在葉片的相對表達量顯著高于其他組織(圖6)。在球莖不同發育階段,除了CeSS4基因在球莖發育90 d的表達量略低于60 d外,其余CeSS基因表達量在球莖發育30～90 d的發育過程中均呈上升趨勢,其中CeGBSS1基因在球莖發育60和90 d的相對表達量均極顯著高于30 d;CeSS2和CeSS3-2基因在球莖發育90 d的相對表達量極顯著高于其他發育階段;CeSS3-1和CeSS4基因分別在球莖發育90和60 d的相對表達量顯著高于其他發育階段(圖7)。在干旱脅迫下,所有CeSS基因在葉片的相對表達量較對照組顯著或極顯著降低;CeSS基因在球莖的表達量有不同的表達模式,CeSS2和CeSS4基因表達量下降,而CeSS1、CeSS3-1、CeSS3-2和CeGBSS1基因表達量略有上升,但均未達顯著水平;所有CeSS基因在根的表達量略有降低,其中CeSS4基因達顯著水平,其余基因未達顯著水平(圖8)。綜上所述,除了干旱脅迫下CeSS基因在球莖的表達略有差異外,實時熒光定量PCR檢測結果與轉錄組表達分析結果一致,驗證了轉錄組表達分析結果的準確性。

圖7 CeSS基因在芋球莖不同發育階段的相對表達量Fig.7 Relative expression of CeSS genes in taro corms at different developmental stages

圖8 CeSS基因在干旱脅迫下的相對表達量Fig.8 Relative expression of CeSS genes in response to drought stress

3 討 論

雖然芋也是富含淀粉的塊莖類作物,但與其他淀粉類塊莖作物(如馬鈴薯、木薯和甘薯等)相比,芋的研究相對較少,研究深度還有差距,尤其在淀粉(直鏈淀粉和支鏈淀粉)生物合成關鍵基因的挖掘與利用及淀粉品質改良方面[41,46-47]。SS參與直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成,影響淀粉的結構和理化性質[3,19,48]。本研究使用HMM模型(PF08323)從芋基因組中鑒定了6個SS基因,與學者在擬南芥的研究結果一致,但也與一些植物的SS基因數量有差異,如水稻、高粱、小麥和大麥的SS基因分別為11、11、9和27個[22,49]。根據系統發育分析,6個芋SS基因分為5個亞群,與前人研究結果一致[24,50-51],其中有2個SS基因分布在亞群3,可能與基因組中片段重復事件有關,在水稻基因組中,SSII、SSIII和SSIV 3個亞家族發生了片段重復事件[22]。系統發育分析得到了基因結構和保守結構域分析的進一步支持。外顯子-內含子結構特征分析顯示6個SS基因的外顯子數量不同,為7～15個,與在水稻[22]和高粱[49]的報道一致。在保守結構域上,CeSS1、CeSS2、CeSS4和CeGBSS1蛋白均具有淀粉合成酶催化結構域(motif 2和motif 5)和糖基轉移酶群組1(motif 1和motif 3),而分布在亞家族3上的CeSS3-1基因編碼蛋白具有motif 1、motif 3和motif 5,CeSS3-2基因的編碼蛋白只含有motif 2,與水稻[22]的研究結果一致。

順式作用元件參與基因的表達調控。對芋淀粉合成酶基因家族啟動子區域順式作用元件進行分析,發現該區域均存在光響應元件、激素響應元件等,高粱淀粉合成酶基因家族啟動子區域也存在光響應元件和激素響應元件[49],說明淀粉合成酶基因可能受到光和激素的調控。同時,在淀粉生物合成途徑中,其他淀粉生物合成相關基因如AGPase、SBE等基因家族的順式作用元件也存在大量光響應元件和激素響應元件[15,52],說明淀粉合成代謝也可能受到光和激素的調控。

基因表達分析能在轉錄水平了解基因的功能。芋在播種60～120 d為淀粉快速積累期,淀粉含量從4.51 g/100 g增加到21.5 g/100 g,尤其60～90 d是其中的關鍵階段,90 d淀粉含量比60 d淀粉含量增加221.5%[8,15];同時,播種90 d后,球莖開始進入快速膨大階段[7]。因此,播種90 d階段對芋產量和品質有重要影響,本研究選取該階段進行不同組織的轉錄表達分析和干旱脅迫研究是合適的。在本研究中,CeGBSS1基因在葉片、球莖和葉柄等組織及球莖不同發育階段均具有較高的表達量,說明其可能在芋淀粉生物合成中發揮重要作用,與之前在水稻[22]和高粱[49]等作物的報道一致。CeSS1和CeSS2基因在葉片和球莖具有較高的表達量,與之前在芋的報道一致[13-14]。干旱對淀粉生物合成的影響極大,是非生物脅迫中限制作物生產的主要環境因素[53]。在本研究中,干旱脅迫下所有芋SS基因在葉片和根的表達量均下降,其中在葉片的下降與對照組相比達顯著水平,而在球莖中有不同的表達模式,但差異不顯著。在對水稻SS基因家族的研究中,不同SS基因在干旱脅迫下表達模式有差異,淀粉合成酶活性及淀粉含量在不同組織中的積累也不同[54]。芋在干旱脅迫下SS基因的表達與淀粉合成酶活性、淀粉含量及與其他淀粉生物合成相關基因的協同關系還有待進一步研究。鑒于SS基因在直鏈淀粉和支鏈淀粉生物合成中的作用,已經在許多作物如水稻、木薯、馬鈴薯、大麥和小麥中對SS基因進行編輯,創制出不同淀粉類型的新種質[40-44],為芋淀粉品質改良和新種質的創制提供了參考和研究思路。

4 結 論

在芋基因組中鑒定出6個CeSS基因,明確其分子結構特征和表達模式。CeGBSS1基因在播種90 d的不同芋組織及球莖不同發育階段呈現較高表達量,推測是芋淀粉生物合成的關鍵基因。