云南白菜根腫病拮抗菌的篩選及鑒定

張怡寧,劉秋艷,朱美竹,曾 民,蘇 源,梁家燦,劉 慶,姚永興,周曉罡

(1.昆明學院農學與生命科學學院,昆明 650214;2.云南省農業(yè)科學院生物技術與種質資源研究所,昆明 650223;3.云南省農業(yè)生物技術重點實驗室,昆明 650223;4.農業(yè)部西南作物基因資源與種質創(chuàng)制重點實驗室,昆明 650223;5.云南昊盟農業(yè)科技有限公司,云南 楚雄 651604)

【研究意義】十字花科蔬菜在中國具有重要的經濟價值,根腫病是十字花科作物的主要病害[1]。據統(tǒng)計,在云南超過10個州市(49 個縣區(qū))均有根腫病發(fā)生,發(fā)病面積達1.64×104hm2。因云南蔬菜周年可生產上市的特點,導致其全年發(fā)病,危害極其嚴重,是影響云南大白菜及其他十字花科蔬菜產量的主要因素[2-3]。目前主要采用化學農藥對根腫病進行防治,但化學農藥的廣泛使用會造成環(huán)境污染,同時也存在成本較高的問題。本研究擬從白菜植株內及其根際土壤中篩選對云南白菜根腫病有較好防治效果的生防菌株,并對其進行深入研究,包括生防菌株的篩選鑒定、發(fā)酵培養(yǎng)組分的優(yōu)化等,以期篩選到具生防潛能的菌株,對白菜根腫病具備良好的生物防治效果,同時提供可供參考的理論指導[4]。【前人研究進展】作為一種嚴重影響十字花科蔬菜產量和品質的真菌病害[5-6],蕓薹根腫菌無法在體外進行培養(yǎng)[7-8]。因此目前對白菜根腫病的防治,主要是通過對病原菌休眠孢子萌發(fā)抑制率的檢測來進行。王靖等[9]通過對病原菌休眠孢子萌發(fā)抑制率的檢測獲得2株田間生防效果較好的放線菌,A316和A10的防治效果分別為65.84%、59.59%。熊國如等[10]通過對病原指示菌的篩選得到1株枯草芽孢桿菌BacillussubtilisXF-1,XF-1不僅對大白菜根腫病的發(fā)生具有很好的抑制作用,而且還能提高大白菜的產量;張思雨[4]通過對病原指示菌的篩選得到4株生防菌,其在田間的抑制效果良好,生防菌及其抑制率為ZF480(64.08%)、ZF481(60.61%)、ZF72(63.82%)和ZF129(64.94%)。蔣歡等[11]通過大田試驗發(fā)現,放線菌B18對榨菜根腫病的田間防效為42.01%,增產率為37.24%。楊力凡[12]研究發(fā)現,將深綠霉菌的發(fā)酵物添加到化肥中,可有效減少大田中根腫病的發(fā)病率;盤文政等[13]將有機肥和生防菌株混合使用防治油菜根腫病,結果表明其田間防效可達83.12%。【本研究切入點】生物防控因其成本低、效果好、對環(huán)境無污染等優(yōu)點成為近年來防治植物病害的首要選擇。目前云南省白菜的主要病害為根腫病,危害程度較大,年均造成十字花科作物減產25%～60%[14-15]。筆者擬通過原位篩選技術從云南本地篩選獲得對十字花科根腫病具有高效拮抗作用的生防菌株加以應用,為解決云南省日益嚴重的根腫病害提供新的微生物資源。【擬解決的關鍵問題】通過篩選獲得對云南白菜根腫病具有高效生物防治功能且能夠適應云南高海拔、強紫外線生態(tài)環(huán)境的菌株。并對該菌株進行生理生化鑒定,優(yōu)化發(fā)酵條件,為其應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

在云南省曲靖市麒麟區(qū)三寶鄉(xiāng)白菜種植大棚內進行采樣,整個地塊均有發(fā)病且發(fā)病癥狀較均勻,白菜根腫病的全茬發(fā)病率為60%～70%。

1.2 供試材料

供試白菜(Brassicarapavar.glabraRegel)品種為易感品種曲彩一號。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基參考王靖[16]的方法略作改動,Hoagland營養(yǎng)液的配制參考羅紅春[17]的方法。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集 采用五點取樣法采集白菜根際周圍0～20 cm土層的帶根土樣,每個點取0.5 kg,將5個樣品混勻后平均分成2份保存?zhèn)溆谩２捎秒S機取樣法采集健康或者發(fā)病較輕的白菜10株,保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 白菜根系分泌物的收集 參考王靖[16]的實驗方法略作改動,將白菜種子(曲彩一號)在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽2～3 d,待出芽后轉入裝有水培營養(yǎng)液的100 mL小燒杯中,每個燒杯中插苗5株,置于恒溫培養(yǎng)箱,25 ℃中光暗交替培養(yǎng)7 d,用0.22 μm的細菌過濾器過濾后保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.3 休眠孢子懸浮液的制備 試驗步驟(圖1)參考楊佩文等[18]的方法并有所改動。

圖1 根腫病菌休眠孢子懸浮液制備工藝Fig.1 Preparation technology of suspension liquid of dormant spores of P.brassicae

1.3.4 芽孢桿菌的分離純化 土壤中芽孢桿菌的分離純化:在錐形瓶中加入土樣5 g,無菌水50 mL,振蕩器上充分震蕩混勻。70 ℃水浴加熱10 min,經過梯度稀釋后得到10-3、10-4、和10-5土壤稀釋液。分別取各梯度的稀釋液100 μL 涂布于NA固體培養(yǎng)基上,3組重復, 37 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d。挑取單菌落于NA固體培養(yǎng)基上平板劃線進行分離純化。純化出的菌體保存于4 ℃冰箱中備用。

白菜內芽孢桿菌的分離純化:稱取采集白菜的健康組織10 g,用水沖洗干凈。使用75%酒精消毒2～3 min,次氯酸鈉消毒1～2 min,無菌水沖洗后,放入研缽充分研磨,研磨液70 ℃水浴加熱10 min,稀釋成500和1000倍的稀釋液。純化方法同“土壤中芽孢桿菌的分離純化”。純化出的菌體保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.5 拮抗菌株的篩選 將上述保存的菌株活化,制成1×106個孢子/mL的待測菌株培養(yǎng)液。將根系分泌物121 ℃滅菌20 min,取5 mL加入錐形瓶中,同時將根腫病菌休眠孢子懸浮液和待測菌株培養(yǎng)液各0.5 mL接種到錐形瓶中。對照組將待測菌株培養(yǎng)液替換為無菌水,其他條件不變,pH 6.3,放入恒溫培養(yǎng)箱,溫度設置為24 ℃,黑暗培養(yǎng),每組實驗3個重復。5 d后鏡檢。

白菜根腫病菌休眠孢子的萌發(fā)通過地衣紅染色法(1%)[19]判定。通過顯微鏡觀察孢子的萌發(fā)情況,未萌發(fā)的孢子呈紅色,萌發(fā)的休眠孢子呈透明色。

休眠孢子萌發(fā)率(%)=孢子萌發(fā)數/調查孢子總數×100

(1)

孢子抑制率(%)=[(對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對照孢子萌發(fā)率]×100

(2)

1.3.6 拮抗菌株的鑒定 培養(yǎng)性狀觀察:參照東秀珠等[20]的方法進行菌株鑒定。將篩選得到的休眠孢子抑制率最高的拮抗菌接種于NA固體培養(yǎng)基上,采用平板劃線法分離單菌落,倒置培養(yǎng)2～3 d,溫度37 ℃。培養(yǎng)結束后觀察菌落的大小、顏色、表面特征、邊緣形狀等初步判定菌株類型。

形態(tài)特征觀察:對上述拮抗細菌分別進行革蘭氏染色和芽孢染色,100×油鏡下觀察拮抗菌株的個體形態(tài)及染色情況。

生理生化指標檢測:用HBI微生物生化鑒定條(購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司)對上述拮抗細菌進行生理生化檢測。

分子序列分析:采用細菌基因組DNA提取試劑盒(購于北京全式金生物技術有限公司)對上述拮抗菌株進行DNA提取。PCR擴增引物采用細菌16S rDNA通用引物。PCR反應總體系見表1,反應程序見表2。PCR擴增產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳確定大小,并送至生物公司進行測序分析。利用軟件MEGA6.0將測序結果進行對比分析,構建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定其種屬。

表1 PCR反應總體系

表2 PCR反應程序

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

從土壤樣品和白菜樣品中共分離到46株細菌,對白菜根腫病菌休眠孢子抑制率在60%以上的有2株(圖2),抑制率在50%～60%的有15株,抑制率在50%以下的有29株。其中抑制效果最好的為TB-7菌株,抑制率為76.88%。

萌發(fā)的根腫病菌休眠孢子呈透明,未萌發(fā)的根腫病菌休眠孢子呈紅色。The uncolored ones are germinated dormant spores, and the colored (red) ones are ungerminated dormant spores.

從土壤樣品中共分離出30株細菌,編號為TB-1～TB-30,其中對白菜根腫病菌休眠孢子萌發(fā)抑制率達到50%以上的有13株(表3)。抑制效果最好的是TB-7菌株,抑制率為76.88%。

表3 土壤中部分菌株對白菜根腫病菌休眠孢子的抑制率

從白菜內共分離出16株細菌,編號為EB-1～EB-16,其中對白菜根腫病休眠孢子萌發(fā)抑制率達到50%以上的有8株(表4)。抑制效果最好的是EB-15菌株,其抑制率為67.38%。

表4 白菜內部分菌株對根腫病菌休眠孢子的抑制率

2.2 拮抗菌株的鑒定

TB-7菌株在NA固體培養(yǎng)基上菌落較小(圖3),顏色呈淡黃色,表面光滑且扁平,菌體濕潤,不透明,邊緣呈規(guī)則狀。

圖3 TB-7菌株的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of TB-7

革蘭氏染色結果如圖4所示,TB-7菌株的菌體均呈紫色、桿狀,為革蘭氏陽性菌;芽孢染色結果如圖5所示,TB-7菌株的菌體和芽孢分別被染成紅色和綠色,為芽孢桿菌。

圖4 TB-7菌株革蘭氏染色Fig.4 Gram stain of TB-7

圖5 TB-7菌株芽孢染色Fig.5 Spore staining of TB-7

生理生化指標檢測結果從表5可見,TB-7菌株是好氧菌,V-P、淀粉水解、pH 5.7生長3項檢測指標均呈陽性,檸檬酸鹽、丙酸鹽、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、明膠液化、7%NaCl生長、硝酸鹽還原8項檢測指標均呈陰性。因芽孢桿菌多為需氧或兼性厭氧,能耐酸、耐鹽、耐高溫且具有較高的淀粉酶活性,可初步判定TB-7菌株為芽孢桿菌。

表5 TB-7菌株生理生化指標檢測

對TB-7菌株的DNA提取物進行PCR擴增后,將擴增產物進行電泳檢測(圖6),條帶亮度位置約在1500 bp處。將測序結果在NBCI數據庫中進行Blast同源性分析,用軟件MEGA6.0進行序列對比(圖7),TB-7菌株與堅強芽孢桿菌(Cytobacillusfirmus)同源性達到100%,TB-7菌株為芽孢桿菌屬的堅強芽孢桿菌。TB-7菌株的16S rDNA測序序列如圖8所示。

圖6 TB-7菌株16S rDNA PCR產物Fig.6 16S rDNA PCR products of TB-7

圖7 TB-7菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain TB-7

圖8 TB-7菌株16S rDNA序列Fig.8 16S rDNA sequence of strain TB-7

3 討 論

目前,中國研發(fā)的生物農藥種類頗多,在冊登記產品數量超過1200個,其中有效成分50多種。然而這些產品中用于十字花科蔬菜根腫病防治的生物農藥只有1種,為枯草芽孢桿菌[21]。芽孢桿菌相對于其他菌類而言,具有強抗逆性、光譜抗菌性等特點。所以在各種農作物的病害防治方面應得到廣泛應用。近年來,用于農作物病蟲害防治的芽孢桿菌種類較多,最常見的有地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌巨大芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌等[22-24]。

形態(tài)學鑒定、生理生化檢測和DNA分子序列分析顯示本研究篩選到的TB-7菌株為芽孢桿菌屬的堅強芽孢桿菌。

十字花科蔬菜根腫病菌難以在體外進行培養(yǎng),只能專性寄生于活體內[25-26],依靠在體外人工純培養(yǎng)的根腫病菌來篩選其生物防治菌株十分困難。目前主要通過病原指示菌篩選和根腫病菌休眠孢子萌發(fā)抑制率的測定獲得根腫病的生防菌株。Lee等[26]從韓國大白菜的根部分離出3株對十字花科根腫病有良好防治效果的內生放線菌。孫良菲等[27]結合休眠孢子萌發(fā)抑制率篩選和病原指示菌篩選,獲得1株放線菌YN-6和1株真菌XP-F2,其對感病品種“四季奶油小白菜”根腫病有較好的生物防治效果。

本研究通過測定根腫病菌休眠孢子萌發(fā)抑制率來篩選對白菜根腫病具有抑菌作用的拮抗菌,經過篩選獲得對白菜根腫病菌休眠孢子萌發(fā)抑制率最高的菌株TB-7,其抑制率為76.88%。TB-7菌株經鑒定為芽孢桿菌屬的堅強芽孢桿菌,目前鮮見其在根腫病防治應用方面的報道。本實驗通過檢測根腫病菌休眠孢子的萌發(fā)抑制率,篩選獲得的TB-7菌株對抑制根腫病具有較強的針對性,后期筆者將通過盆栽試驗和田間試驗對TB-7菌株生防效果進行深入研究,以期為解決云南日益嚴重的十字花科作物根腫病提供新的菌種資源。

4 結 論

從白菜及其根際土壤中共分離出46株細菌,其中根際土壤中分離出30株細菌,白菜內分離出16株內生細菌。對白菜根腫病休眠孢子萌發(fā)抑制效果最好的是TB-7菌株,休眠孢子抑制率為76.88%。TB-7菌株是革蘭氏陽性菌,在NA培養(yǎng)基上菌落較小,顏色呈淡黃色,表面光滑且扁平,菌體濕潤,不透明,邊緣呈規(guī)則狀。TB-7菌株的分子測序結果為TB-7菌株的16S rDNA電泳條帶亮度位置約在1500 bp處;TB-7菌株與堅強芽孢桿菌(Cytobacillusfirmus)同源性達到100%,判定TB-7菌株為芽孢桿菌屬的堅強芽孢桿菌。