春尺蠖熱激蛋白AcinHsp70基因的克隆、分子特性與表達分析

陳 龍,朱圣杰,崔闊澍,路 慧,王 靖,郝雅嫻

(1. 河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系,內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015000; 2. 四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,成都 610041)

【研究意義】春尺蠖(Apocheimacinerarius)屬于鱗翅目、尺蛾科昆蟲,食性呈多樣化。該蟲主要分布于我國北方多個省(市、自治區(qū)),危害牧草、林木和經(jīng)濟樹種[1-2]。近年來,危害對象逐漸由楊、桑、柳、檸條及經(jīng)濟類林木擴散到玉米和小麥等大田作物,危害區(qū)域也由北(內(nèi)蒙古、新疆和河北等地)向南(四川、云南等)擴散。春尺蠖3齡幼蟲于4月上旬出現(xiàn)并發(fā)生危害,此時內(nèi)蒙古西部檸條天然草場的晝夜溫差達10 ℃,能在如此惡劣環(huán)境中生存下來并發(fā)生危害,與其較強的抗寒性密不可分。熱激蛋白(HSP)作為昆蟲生存重要的調(diào)控因子,在昆蟲生長、發(fā)育和繁殖以及在抵御外界不利環(huán)境的脅迫中具有重要作用[3-6]。因此,研究Hsp基因在春尺蠖對溫度脅迫的響應(yīng)機制具有重要意義。【前人研究進展】近年來,有關(guān)Hsp70基因的序列及在高溫和低溫脅迫下的表達均有報道。例如,韭菜遲眼蕈蚊(Bradysiaodoriphaga)在40 ℃高溫處理下,體內(nèi)Hsp70與sHsp均上調(diào)表達[7]。綠豆象成蟲高溫處理后,CcHsp70-5基因表達量顯著上調(diào),推測該基因有助于綠豆象成蟲抵御高溫脅迫[8]。對梨小食心蟲(Grapholithamolesta)[5]和空心蓮子草葉甲(Agasicleshygrophila)[9]進行高溫處理后,發(fā)現(xiàn)Hsp70基因表達量顯著上調(diào)。對赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)不同齡期幼蟲高溫脅迫1 h中的研究發(fā)現(xiàn),Hsp70基因的表達均不同程度上調(diào)1.1～2.0倍[10]。Li等[11]通過對松墨天牛(Monochamusalternatus)MaltHsp70-2的沉默研究中發(fā)現(xiàn),在沉默MaltHsp70-2基因后,成蟲的耐熱性顯著降低,該基因可能在成蟲耐熱性中扮演重要角色。在低溫脅迫中,Hsp70基因同樣起到保護昆蟲機體的作用。如黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)在-7 ℃低溫條件下1 h,Hsp70基因表達量顯著上調(diào)[12]。褐飛虱(Nilaparvatalugens)Hsp70的表達量在低溫脅迫中下降,但不受高溫影響[13]。此外,Hsp70不同亞族基因?qū)Ω摺⒌蜏孛{迫也表現(xiàn)出不同的響應(yīng)模式[14-15]。【本研究切入點】為深入探究熱激蛋白70基因在春尺蠖應(yīng)對低溫脅迫中的作用,本研究基于前期組學(xué)數(shù)據(jù),篩選Hsp70基因,結(jié)合Blastp和RT-PCR 技術(shù)克隆獲取1個Hsp70基因,對其分子特征、理化性質(zhì)和系統(tǒng)進化關(guān)系進行分析,同時分析該基因在不同溫度和4 ℃不同時間脅迫下的表達譜。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確Hsp70基因在春尺蠖3齡幼蟲響應(yīng)低溫脅迫中的作用,為深入探究春尺蠖應(yīng)對逆境脅迫的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

春尺蠖雌雄成蟲在2021年春季采集于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗檸條草場(108°45′23.63″ E,40°46′4.19″ N),帶回實驗室后在室溫下以檸條錦雞兒成對飼喂養(yǎng),將所產(chǎn)卵置于恒溫(22±1) ℃、光周期L∶D=18∶6、相對濕度55%～59%的ZXQP-R1700 上海智城人工氣候箱中孵化,孵化出的幼蟲以檸條錦雞兒連續(xù)飼養(yǎng),待幼蟲發(fā)育至3齡,選取供試幼蟲(蛻皮后2 d)做以下處理:①在-10、-5、0、5和25 ℃不同溫度下各處理1 h;②在4 ℃下處理0.5、1、3、5和7 h。每個處理3次重復(fù),每次重復(fù)5頭幼蟲,處理結(jié)束后用液氮速凍,置于-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、DNA純化、pMD19-T連接載體和PCR Mix均購于大連寶生物有限公司;DH5α感受態(tài)細胞等購于天根生化科技有限公司(北京)。

1.3 RNA提取及cDNA第1鏈的合成

選取1.1中處理的春尺蠖樣品,置于高溫滅菌后的研缽中添加液氮研磨,RNA提取步驟參照TaKaRa RNA提取試劑盒說明書。分別利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和Nano PhotometerTMP-Class超微量分光光度計檢測RNA的質(zhì)量和濃度,待檢測指標合格后將RNA反轉(zhuǎn)合成第1鏈。

1.4 春尺蠖AcinHsp70基因的克隆

根據(jù)前期河套地區(qū)綠色農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)與預(yù)警控制實驗室已經(jīng)獲取的春尺蠖幼蟲低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),以Hsp70為關(guān)鍵詞在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫基因功能注釋中搜索,結(jié)合NCBI BlastP驗證,篩選出具有完整CDS序列的Hsp70基因,命名為AcinHsp70(GenBank登錄號:OP750249)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的基因序列信息,利用Primer Premier 5.0軟件在AcinHsp70基因第74～2055 bp范圍內(nèi)設(shè)計RT-PCR擴增引物(表1)來完成基因完整CDS的擴增。

表1 春尺蠖AcinHsp70的克隆與qRT-PCR檢測引物

PCR反應(yīng)體系為25 μL,其中cDNA擴增模板1 μL,F/R引物各1 μL,PCR Mix 12.5 μL,最后無酶水補齊至25 μL。

PCR反應(yīng)條件:首先進行5 min 94 ℃的預(yù)變性;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,運行30個循環(huán);72 ℃運行10 min完成延伸過程,最后4 ℃低溫保存。PCR擴增完成后,擴增產(chǎn)物用1.0%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測AcinHsp70基因的擴增狀況,而后經(jīng)PCR產(chǎn)物膠回收、亞克隆后提取質(zhì)粒送測序上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.5 春尺蠖AcinHsp70基因的生物信息學(xué)分析

在NCBI 中利用(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線網(wǎng)站預(yù)測春尺蠖AcinHsp70基因的編碼蛋白區(qū)。使用在線預(yù)測工具ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測春尺蠖AcinHsp70基因編碼氨基酸的基本理化性質(zhì);使用DNAMAN 6.0軟件分析春尺蠖及其他目昆蟲的熱激蛋白70基因氨基酸序列一致。利用SignalIP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線網(wǎng)站預(yù)測春尺蠖AcinHsp70基因蛋白N端信號肽;蛋白跨膜區(qū)域則利用TMHMM在線網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行預(yù)測;利用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位分析;磷酸化位點和糖基化位點預(yù)測分別選用在線預(yù)測網(wǎng)站NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和DictyOGlyc1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)在線預(yù)測。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,參數(shù)為鄰接法(Neighbor-joining, NJ)、P距離(P-distance),運行1000次。

1.6 春尺蠖AcinHsp70基因的表達

利用RT-qPCR檢測春尺蠖Hsp70基因在不同溫度及4 ℃不同時間處理下的表達譜,內(nèi)參基因選用Actin,引物見表1,反應(yīng)體系為20 μL:模板cDNA 2 μL,上/下游引物各0.4 μL,GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL,以Free Water將體系補至20 μL,GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒說明書作為本實驗的參照程序。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件中的單因素方差分析中的Duncan多重比較分析對AcinHsp70基因差異表達情況統(tǒng)計分析,利用GraphPad Prism 7.0 軟件作圖。柱形圖結(jié)果用平均值±標準誤表示,差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 春尺蠖AcinHsp70基因的克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中已有的春尺蠖AcinHsp70序列信息,在基因編碼蛋白區(qū)設(shè)計引物擴增目的基因CDS序列,以AcinHsp70的F/R為引物在目的基因外圍擴增1988 bp的片段,經(jīng)濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測在2000 bp處發(fā)現(xiàn)一條特異性單一條帶(圖1),經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)上述條帶分別包含轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中1899 bp的Hsp70基因序列且序列信息比對一致。

M:DL2000 DNA Marker;1:春尺蠖 AcinHsp70 的PCR擴增產(chǎn)物。M: DL2000 DNA Marker; 1: PCR products of AcinHsp70.

2.2 AcinHsp70基因蛋白的生物信息學(xué)分析

春尺蠖AcinHsp70蛋白基因完整的CDS區(qū)為1899 bp,預(yù)測分子式為C3052H4904N876O971S16,共編碼633個氨基酸,預(yù)測蛋白質(zhì)分子量和等電點分別為69.91 kDa和5.51,負電荷殘基(Asp + Glu)總電荷為95,正電荷殘基(Arg + Lys)總電荷為83,半衰期和脂肪指數(shù)分別為30 h和82.62。該蛋白的平均親水性為-0.507,預(yù)測不穩(wěn)定系數(shù)為33.19,故該蛋白屬于親水穩(wěn)定蛋白,N端氨基酸為蛋氨酸(Met, M)。AcinHsp70基因蛋白具有Hsp70家族簽名序列(圖2),在N端均不含信號肽且無跨膜區(qū)。磷酸位點檢測分別發(fā)現(xiàn)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸位點24、26和8個(圖3);未發(fā)現(xiàn)糖基化位點(圖4)。此外,亞細胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要位于細胞質(zhì)(圖5)。

圖3 春尺蠖AcinHsp70蛋白的磷酸化位點預(yù)測Fig.3 Prediction of the phosphorylation sites of the AcinHsp70 protein from A. cinerarius

圖4 春尺蠖AcinHsp70基因的糖基化位點預(yù)測Fig.4 Prediction of the glycosylation sites of the AcinHsp70 gene from A. cinerarius

圖5 春尺蠖AcinHsp70基因的亞細胞定位預(yù)測Fig.5 Prediction of the subcellular localization of the AcinHsp70 gene from A. cinerarius

2.3 春尺蠖AcinHsp70基因蛋白的序列一致性比對及系統(tǒng)進化關(guān)系分析

將春尺蠖AcinHsp70基因的氨基酸序列與NCBI中搜索得到的其它鱗翅目昆蟲序列進行比對,春尺蠖與慶網(wǎng)蛺蝶的一致性最高(圖6),達92.91%,其次為美洲棉鈴蟲(Helicoverpazea)、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、柞蠶(Antheraeapernyi),一致性分別為91.80%、91.80%和91.17%,均在90%以上;而與斜紋夜蛾(Spodopteralitura)、家蠶(Bombyxmori)BmorHsp70A1和BmorHsp70的一致性均在90%以下,分別為89.11%、89.84%和83.88%。

Hsp70蛋白來源物種及其 GenBank 登錄號。AcinHsp70: 春尺蠖 A. cinerarius Hsp70(MZ689788); McinHsp70-2:慶網(wǎng)蛺蝶 M. cinxia Hsp70-2(AGR84224.1); HzeaHsp70:美洲棉鈴蟲 H. zea Hsp70(ACV32640.1); AperHsp70-2: 柞蠶 A. pernyi Hsp70-2(ALL42052.1);HarmHsp70:棉鈴蟲H. armigera Hsp70(ADP37711.1);SlitHsp70:斜紋夜蛾S. litura Hsp70(ADV03160.1);BmorHsp70A1:家蠶B. mori Hsp70 A1(NP_001296526.1);BmorHsp70:家蠶(NP_001037396.1);Consensus: 共有序列。

通過NCBI搜索其它目昆蟲已上傳的Hsp70基因的氨基酸序列與春尺蠖AcinHsp70序列信息結(jié)合構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。系統(tǒng)進化結(jié)果顯示(圖7),春尺蠖AcinHsp70與鱗翅目昆蟲Hsp70聚為一類,且與同鱗翅目昆蟲的慶網(wǎng)蛺蝶親緣關(guān)系最近。

春尺蠖AcinHsp70蛋白用三角標記。AcinHsp70 protein of A. cinerarium is marked with filled triangle.

2.4 春尺蠖AcinHsp70基因在不同溫度脅迫下的表達譜

從圖8中可知,AcinHsp70基因在回溫與不回溫下的表達量均在-10 ℃達到最大值,不回溫條件下,隨著溫度上升表達量下降,除-10 ℃外,其余溫度條件下差異不顯著(P>0.05);回溫條件下,隨著溫度上升表達量也呈下降趨勢,其余溫度條件下差異顯著(-5與0 ℃、5與25 ℃之間無顯著差異)(P<0.05);在相同溫度下,除-10 ℃外,其余溫度下基因表達量回溫后均呈上升趨勢,除5和25 ℃外,表達量差異顯著(P<0.05)。

圖8 春尺蠖AcinHsp70基因在不同溫度脅迫下的表達量Fig.8 Expression profile of AcinHsp70 gene under different temperature stress of A. cinerarius

2.5 春尺蠖AcinHsp70基因在4 ℃不同時間脅迫下的表達譜

從圖9中可知,AcinHsp70基因在4 ℃處理1 h 后表達量達最大值,總體呈先上升后下降趨勢,在上升和下降階段(除3和5 h)表達量均差異顯著(P<0.05)。

圖9 春尺蠖AcinHsp70基因在4 ℃不同時間脅迫下的表達譜Fig.9 Expression profile of AcinHsp70 gene in A.cinerarius under 4 ℃ stress for different time

3 討 論

本研究基于前期已獲取的春尺蠖幼蟲不同溫度脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從中篩選獲取Hsp70基因,結(jié)合NCBI BlstP和RT-PCR技術(shù),克隆獲取Hsp70基因完整的CDS區(qū),命名為AcinHsp70,同時上傳NCBI獲取GenBank登錄號OP750249。在對春尺蠖AcinHsp70基因1899 bp的CDS區(qū)域分析中發(fā)現(xiàn),該基因蛋白氨基酸尾部序列為EEVD,還發(fā)現(xiàn)3個Hsp70基因家族特有的標簽序列,所以表明Hsp70屬于胞質(zhì)型Hsp70基因家族。此外,Hsp70基因蛋白的亞細胞定位結(jié)果顯示,該基因主要位于細胞質(zhì)中,進一步證實了上述結(jié)論。

Hsp70基因家族中2個亞家族誘導(dǎo)型Hsp70和結(jié)構(gòu)型Hsc70,主要區(qū)別在于結(jié)構(gòu)型Hsc70存在多個GGXP序列結(jié)構(gòu),而誘導(dǎo)型Hsp70則沒有。通過分析AcinHsp70基因編碼的蛋白序列,未發(fā)現(xiàn)該特征序列,同時結(jié)合表達譜情況(受溫度誘導(dǎo)表達),進一步確認AcinHsp70是誘導(dǎo)型Hsp70基因。

從春尺蠖Hsp70基因與其它昆蟲的系統(tǒng)進化樹中發(fā)現(xiàn),Hsp70基因在不同種類昆蟲中具有較高的保守性,春尺蠖Hsp70基因與同為鱗翅目的慶網(wǎng)蛺蝶序列一致性最高,且具有較高同源性,但半翅目同翅亞目昆蟲Hsp70基因相似度較低,系統(tǒng)進化樹表現(xiàn)為半翅目的褐飛虱和同翅目的白背飛虱(Sogatellafurcifera)聚為一類,沒有和半翅目昆蟲的中華淡翅盲蝽(Tytthuschinensis)聚為一類,與同種的Hsp70基因親緣關(guān)系較遠,張青等[16]、譚瑤等[17]研究也出現(xiàn)類似結(jié)果,原因可能是與其親緣關(guān)系更近的昆蟲Hsp70還未被鑒定出來。本研究的春尺蠖未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象,春尺蠖與慶網(wǎng)蛺蝶Hsp70親緣關(guān)系最近,序列一致性達92.91%。

HSP70是生物體對外界溫度脅迫響應(yīng)聯(lián)系緊密的一類蛋白質(zhì),相關(guān)研究也證實其在昆蟲抵抗高/低溫脅迫中具有重要作用[18-19]。春尺蠖3齡幼蟲最早于4月上旬開始發(fā)生危害,此時當?shù)貢円箿夭钶^大(最大可達10 ℃),能在如此環(huán)境中生存下來且發(fā)生危害,與其極強的抗寒性密切相關(guān),3齡幼蟲作為危害的臨界期,在該時期防治可以有效控制種群數(shù)量。本研究對春尺蠖3齡幼蟲進行不同溫度(-10、-5、0、5和25 ℃)回溫與不回溫及4 ℃不同時間(0、0.5、1、3、5和7 h)處理,通過qPCR技術(shù)檢測AcinHsp70的mRNA表達水平來探討該基因?qū)囟鹊捻憫?yīng)。在低溫條件下,灰飛虱體內(nèi)的LsHsp70基因和LsHsc70基因均可被誘導(dǎo)表達[12],但是Kim等[20]卻發(fā)現(xiàn)灰飛虱體內(nèi)另外2種Hsp70基因卻不受低溫誘導(dǎo)。大螟(Sesamiainferens)在應(yīng)對低溫脅迫時Sihsc70的表達并不顯著[21]。低溫可以誘導(dǎo)黑腹果蠅Hsp70Aa,但卻不能誘導(dǎo)Hsc70-1[22]。本研究中AcinHsp70基因不回溫下的表達量在-10 ℃達到最大值,其余溫度無顯著差異,結(jié)果表明AcinHsp70基因可被低溫誘導(dǎo)表達,但僅限-10 ℃,高于-10 ℃的低溫不需要更多的Hsp70,在常溫下體內(nèi)表達的Hsp70可以應(yīng)對高于-10 ℃的低溫脅迫。昆蟲體內(nèi)的多種Hsp70基因表達呈現(xiàn)多樣化,說明昆蟲體內(nèi)不同Hsp70發(fā)揮不同作用。

在研究對環(huán)境應(yīng)激的反應(yīng)時,必須注意涵蓋暴露和恢復(fù)兩種情況[23]。本研究中,春尺蠖AcinHsp70在1 h低溫處理后基因表達量未發(fā)生顯著變化(-10 ℃除外),但在25 ℃回溫30 min后發(fā)生顯著上調(diào)(5 ℃除外),5 ℃雖然未發(fā)生顯著上調(diào),卻呈上升趨勢。在黑腹果蠅的研究中發(fā)現(xiàn),Hsp70Aa基因表達量均在低溫處理期間未發(fā)生明顯變化,在回溫后則發(fā)生明顯上調(diào)[23]。推測春尺蠖在-10 ℃處理回溫30 min后,Hsp70基因表達量逐步降低,可能因為在回溫30 min后體內(nèi)不需要大量的Hsp70蛋白,需要更多的回溫時間才能實現(xiàn)表達上調(diào),例如在對大豆蚜若蚜高溫脅迫回溫2 h后,Hsp70基因的表達量顯著影響上調(diào)[24]。

有研究表明,熱激蛋白的表達有助于提高生物抵御逆境的能力,但是會消耗體內(nèi)很多能量,對其它蛋白的合成造成影響,嚴重時會造成壽命縮短和生殖能力下滑,所以顯著的誘導(dǎo)表達不能長久和穩(wěn)定[25]。本研究將春尺蠖3齡幼蟲在4 ℃條件下處理,隨著處理時間延長,AcinHsp70基因的表達量先上升后下降,在1 h處達到最大值,達到對照的23.92倍,在上升和下降階段(除0.5和7 h)差異顯著(P<0.05)。韓嵐嵐等[24]和譚瑤等[17]分別對大豆蚜(Aphisglycines)熱激和沙蔥螢葉甲(Galerucadaurica)卵低溫處理后也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果,由此推測,隨著低溫脅迫時間的延長,過多的變性蛋白影響了AcinHsp70的表達。

4 結(jié) 論

獲取了春尺蠖誘導(dǎo)型Hsp70基因,對其分子特征與低溫脅迫下的表達情況進行分析,在春尺蠖體內(nèi)存在結(jié)構(gòu)型和誘導(dǎo)型Hsp70,今后筆者將對2種熱激蛋白基因進一步研究,才能深入系統(tǒng)地了解Hsp70基因家族在響應(yīng)外界不利環(huán)境中的作用機理。此外,本研究僅從基因水平對AcinHsp70研究,蛋白水平及缺失研究也十分重要。春尺蠖雌雄成蟲最早于2月下旬羽化出土,所處溫度遠低于-10 ℃,Hsp70基因在成蟲低溫應(yīng)激的機制更為突顯,需進一步研究。