哈茨木霉UN-2 β-葡聚糖酶誘導及對水稻紋枯病的抑菌防病作用

楊春林,席亞東,胡 強,李洪浩

(1. 四川省農業科學院,成都 610066;2. 四川省樂山市植保植檢站,四川 樂山 614000;3. 四川省農業科學院植物保護研究所,成都 610066;4. 樂山師范學院竹類病蟲防控與資源開發四川省重點實驗室,四川 樂山 614000)

【研究意義】水稻紋枯病(Rice sheath blight)是水稻生產上三大主要真菌病害之一,在我國稻區分布廣泛,一般發病田塊減產15%～20%,發病嚴重的可導致減產60%～70%,甚至絕收,嚴重影響糧食生產安全。水稻紋枯病由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)侵染引起,由于立枯絲核菌以菌核的形式在極端環境下越冬[1],利于病原菌的存活和傳播從而加大了水稻紋枯病的防治難度。為應對環境污染問題推行的秸稈還田措施使得田間菌源逐年增加、土壤氮素水平偏高,加上水稻旱直播栽培技術的推廣,水稻紋枯病呈逐年加重趨勢[2]。利用抗病品種被公認為是應對水稻病害最安全和經濟的方法,近年已有關于轉基因抗病育種工程培育出抗紋枯病的水稻新品系[3],但是由于對轉基因作物安全的擔憂,這些抗病品系未能在生產上推廣應用。井岡霉素是近20年來我國防治水稻紋枯病應用最多的生物抗菌素,年產制劑量達幾十萬t[4]。由于長期使用,部分地區的水稻紋枯病菌對井岡霉素的抗性水平表現出持續上升趨勢[5],使用量也明顯增加,因此,亟需開發新型高效的防治水稻紋枯病的藥劑作為井岡霉素替代產品。【前人研究進展】近年來,市場上出現了一些登記用于防治水稻紋枯病的化學殺菌劑及復配殺菌劑[6-7],受到國內眾多銷售商的青睞。由于化學農藥帶來的面源污染和食品安全問題引起社會各界的廣泛關注,綠色環保的生物制劑開發和利用仍然是水稻紋枯病防治研究的重點。目前已報道的對水稻紋枯病菌具有拮抗作用的微生物主要有伯克霍爾德氏菌[8]、木霉菌[9]、芽孢桿菌[10-11]、假單胞菌[12]、鏈霉菌[13]等。木霉菌因同時具有空間占位、降解病原真菌細胞壁誘導植物產生防御抗性等多種生防機制,是最重要的植物病害生物防治菌之一。在包括趨向生長、纏繞和穿透等真菌寄生過程中,木霉分泌的一系列真菌細胞壁降解酶如纖維素酶、幾丁質酶、葡聚糖酶等起著重要作用[14],其中的葡聚糖酶是公認的影響生防真菌重寄生能力的重要因子之一。葡聚糖酶屬于水解酶類,外源葡聚糖酶通過催化葡聚糖多聚體的水解從而抑制病原真菌的生長及增殖[15],隨著環境污染和農產品質量安全問題日益突出,作為具有生防功能的生物酶類,葡聚糖酶在植物真菌病害防治方面應用廣泛,也是目前研究的熱點[16-21]。農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室引進1株生防能力較好的哈茨木霉菌株[22],通過誘變育種的方法獲得高產葡聚糖酶的突變菌株UN-2并對其產β-葡聚糖酶的生防潛力進行初步研究?！颈狙芯壳腥朦c】木霉抑菌因子較多,其對水稻紋枯病防效的研究主要集中在株菌發酵產物或幾丁質酶、膠毒霉素等單項抑菌因子[14,23],未見β-葡聚糖酶對水稻紋枯病病原真菌的體外拮抗及田間防效試驗相關報道?！緮M解決的關鍵問題】采用正交試驗設計優化哈茨木霉UN-2菌株產β-葡聚糖酶的培養基組分及發酵參數,提高其產酶能力,并著重研究β-葡聚糖酶粗酶液對水稻紋枯病病原菌的拮抗作用及田間防效,旨在闡明哈茨木霉UN-2菌株防治水稻紋枯病的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

哈茨木霉TrichodermaharzianumUN-2菌株由四川省農業科學院植物保護研究所保存;5%井岡霉素購自浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司;β-葡聚糖、葡萄糖標準品購自德國Sigma公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 試劑及培養基制備

DNS試劑:3,5-二硝基水楊酸3.15 g、NaOH 20 g、酒石酸鉀鈉91 g、苯酚2.5 g、無水亞硫酸鈉2.5 g、ddH2O 1000 mL。

初始產酶培養基:1 g/L β-葡聚糖、5 g/L蛋白胨、10 g/L燕麥粉、1 g/L KH2PO4、0.1 g/L CuSO4·5H2O、0.1 g/L CaCl2·2H2O、0.08 g/L MnCl2·4H2O、0.1 g/L MgSO4·7H2O、0.07 g/L ZnSO4·7H2O、0.05 g/L CoCl2·6H2O、0.01 g/L FeS04·7H2O。

1.3 木霉菌株產β-葡聚糖酶培養基組分及誘導條件優化

1.3.1 木霉菌單孢子懸液的制備 取斜面保存的木霉菌種,于30 ℃條件下活化培養至產生大量綠色分生孢子,用5 mL無菌生理鹽水沖洗孢子制成懸液,倒入無菌三角瓶中,塞緊棉塞并用無菌牛皮紙包扎瓶口,充分振蕩形成單孢子懸液,用滅菌脫脂棉過濾,血球計數板計數,調整孢子濃度為1×106cfu/mL。

1.3.2 單因素試驗 ①分別以麥麩、米糠、玉米粉、麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖替代初始產酶培養基中的燕麥粉;②分別以牛肉膏、胰蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、NH4C、NH4NO3、KNH3L替代初始產酶培養基中的蛋白胨;③在只含有1 g/L β-葡聚糖(產酶誘導物)、10 g/L最佳碳源以及5 g/L最佳氮源的培養基中分別添加不同的金屬離子,使產酶培養基中單一金屬離子濃度為1 mmol/L,以不加金屬離子的培養基為對照;接種5 mL木霉單孢子懸液,于28 ℃、150 r/min振蕩培養,一定時間后測定不同處理葡聚糖酶活性,考查不同碳源、氮源和金屬離子對菌株產β-葡聚糖酶的影響。每個處理4次重復。

1.3.3 正交試驗 以單因素試驗篩選出來的最佳碳源、氮源、金屬離子以及產酶誘導物(β-葡聚糖)作正交試驗,優化木霉菌株產β-葡聚糖酶培養基組分。獲得培養基優化配方后,利用正交試驗研究溫度、pH、接種量、瓶裝量、搖床轉速和發酵時間對木霉菌株產葡聚糖酶活性的影響。

1.3.4 β-葡聚糖酶粗酶液的制備 木霉菌株β-葡聚糖酶誘導發酵液于4 ℃、5000 r/min離心10 min,取上清液。在上清液中加入分散的硫酸銨,攪拌均勻后于室溫靜置過夜,將鹽析液于4 ℃、8000 r/min離心20 min,去上清液,加5 mL磷酸鹽緩沖液充分溶解,若出現渾濁現象則再次離心10 min;將上清液用0.20 μm微孔濾膜過濾除去分生孢子即得β-葡聚糖酶粗酶液,于4 ℃保存備用。

1.3.5 葡聚糖酶活性測定 采用還原糖法(DNS法)測定木霉菌株產β-葡聚糖酶粗酶液活性,以每分鐘水解葡聚糖產生1 μmol還原糖所需的葡聚糖酶量為一個活性單位。

1.4 粗酶液對紋枯病菌的體外拮抗作用

參考Vinale等[24]的抑菌方法,將木霉菌株在最優β-葡聚糖酶誘導條件下的發酵液按上述方法制成粗酶液,無菌水稀釋不同倍數;打孔器從活化的紋枯病菌菌落距邊沿約1 cm處打取直徑5 mm的菌片,菌面向上接種于直徑90 mm的PDA平板中心,用移液器吸取20 μL不同稀釋倍數的粗酶液,均勻涂布于菌片上,用相同體積的無菌水為對照,每個處理重復3 次,處理置于培養箱25 ℃黑暗條件下培養,觀察和記錄菌絲生長情況。將紋枯病菌菌核分別放入裝有不同稀釋倍數粗酶液的三角瓶中,置于搖床100 r/min振蕩處理,4 h后取出菌核用無菌水沖洗,移入PDA平板,24 h后記錄菌核萌發數,每處理30個菌核,重復3次。

1.5 粗酶液對水稻紋枯病的田間防效

水稻種子催芽2 d播種,25 d后單株插栽到大田,試驗田常規管理。小區隨機區組排列,每小區66.7 m2,小區之間以一行水稻為保護行,在水稻分蘗盛期按陳志誼等[25]的方法接種立枯絲核菌,3 d后分別噴施不同稀釋倍數的β-葡聚糖酶粗酶液和5%井岡霉素(120 g/667 m2),以無菌水處理為對照,4次重復。距收獲期25 d左右調查田間發病情況,每小區隨機抽取50株水稻調查紋枯病發生情況,記錄發病株數并進行病情嚴重度分級[26],收獲時調查結實率和千粒重。

病株率(%)=(病株數/調查總株數)×100

病情指數=[∑(各級發病株數×相應病級數)/(調查總株數×9)]×100

相對防效(%)=[(對照區病情指數-處理區病情指數)/對照區病情指數]×100

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源對木霉菌株產β-葡聚糖酶的影響 由圖1可知,麥麩作為碳源時木霉UN-2發酵產β-葡聚糖酶活性最高,誘導發酵60 h酶活達56.3 U/mL,燕麥粉、玉米粉、米糠依次降低;乳糖、葡萄糖、麥芽糖分別作為碳源時,β-葡聚糖酶活性為20.3～29.1 U/mL,蔗糖作為碳源的產酶能力最差,發酵48 h后β-葡聚糖酶活性為11.8 U/mL。植物來源物質作為碳源的情況下木霉發酵產β-葡聚糖酶活性整體高于單一糖類物質,其原因可能是植物細胞壁結構含葡聚糖,對木霉產葡聚糖酶具有一定的誘導作用。試驗選用麥麩作為最佳碳源進行下一步的優化試驗。

圖1 不同碳源對菌株UN-2產β-葡聚糖酶的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on β-glucanase activity of strain UN-2

2.1.2 氮源對木霉菌株產β-葡聚糖酶的影響 由圖2可知,木霉菌株UN-2在8種單一氮源條件下均可誘導產生β-葡聚糖酶,4種有機氮源條件下木霉UN-2產酶活性差異不大,發酵60 h蛋白胨產酶活性為58.3 U/mL,略高于其余3種有機氮源;4種無機氮源之間差異顯著,硫酸銨作為唯一氮源的情況下木霉誘導發酵60 h后β-葡聚糖酶活性為79.6 U/mL,為參試8種氮源中最佳,硝酸鉀次之;硝酸銨和氯化銨作氮源時木霉產酶能力較差,發酵72 h后β-葡聚糖酶活性分別為25.1 和30.8 U/mL,表明木霉UN-2產β-葡聚糖酶對氮源具有較強的選擇性。硝酸鉀作為氮源時,木霉UN-2發酵48 h后β-葡聚糖酶活性達最高值,隨時間增加酶活呈遞減趨勢,其余氮源酶活均在發酵60 h后達到峰值。

圖2 不同氮源對菌株UN-2產β-葡聚糖酶的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on β-glucanase activity of strain UN-2

2.1.3 金屬離子對木霉菌株產酶的影響 由表1可知,Cu2+、Fe2+和Mn2+對木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶具有抑制作用,發酵72 h后β-葡聚糖酶活性較對照降低30%以上;另外5種金屬離子對木霉產β-葡聚糖酶具有一定的促進作用,其中Ca2+和Mg2+對木霉產β-葡聚糖酶的促進作用最明顯,發酵72 h后β-葡聚糖酶相對活性分別為134.18%和148.55%。隨著培養時間的延長,金屬離子對木霉產酶能力的促進或抑制作用越來越明顯,提示金屬離子對木霉產酶的影響程度可能與發酵時間呈正相關。

表1 金屬離子對突變菌株產酶的影響

2.2 正交試驗結果

2.2.1 木霉菌株產β-葡聚糖酶培養基優化 以上述單因素試驗篩選出來的最佳碳源(麥麩)、氮源(硫酸銨)、2種金屬離子(Mg2+、Ca2+)以及產酶誘導物(β-葡聚糖),采用正交設計L16(45)作正交試驗優化木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶培養基組分,結果見表2。5個因素的極差R大小為A>D>C>E>B,即各因素對木霉菌株產β-葡聚糖酶的影響大小順序為:麥麩>Ca2+>Mg2+>β-葡聚糖>硫酸銨,可見碳源對木霉β-葡聚糖酶活性的影響最大,金屬離子次之,氮源影響最小。該木霉菌株產β-葡聚糖酶的最優培養基組合為A2D2C4E4B1,即麥麩10.0 g/L、Ca2+1.5 mmol/L、Mg2+0.5 mmol/L、β-葡聚糖0.5 g/L及硫酸銨4.0 g/L。

表2 培養基成分的正交試驗結果

2.2.2 木霉菌株產β-葡聚糖酶發酵參數優化 在最優培養基條件下,設置不同的溫度、pH、接種量等發酵參數,采用6因素5水平安排正交試驗,結果見表3。從極差的大小可以判斷,溫度對木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶的影響遠遠大于其他幾個因素,6個因素對木霉產β-葡聚糖酶的影響大小為:溫度>發酵時間>pH>搖床轉速>瓶裝量>接種量,結果表明適宜的培養溫度是β-葡聚糖酶高產的關鍵。木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶最優發酵條件組合為A3E3B2F3D4C1,按此參數誘導發酵,木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶活性為97.68 U/mL,大于正交設計中β-葡聚糖酶最高的試驗組合12的93.52 U/mL。木霉菌株產β-葡聚糖酶最佳發酵參數為溫度32 ℃、發酵時間64 h、pH 6.5、搖床轉速160 r/min、瓶裝量30 mL/250 mL、接種量8 mL(106cfu/mL)。

表3 發酵條件的正交試驗結果

2.3 木霉β-葡聚糖酶粗酶液對2種絲核菌的拮抗作用

體外拮抗試驗結果表明,木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶粗酶液對立枯絲核菌(R.solani)和禾谷絲核菌(R.cerealis)的菌絲生長和菌核萌發有明顯的抑制作用(表4)。2 d后測定數據顯示,不同濃度的粗酶液對2種病原真菌的抑制作用差異顯著,隨著稀釋倍數的增加,粗酶液對病原真菌菌絲生長和菌核萌發的抑制作用逐漸減弱。β-葡聚糖酶粗酶液對立枯絲核菌菌絲生長和菌核萌發的抑制效果均好于禾谷絲核菌,稀釋50倍處理對禾谷絲核菌菌絲生長沒有明顯的抑制作用,而稀釋100倍的粗酶液對立枯絲核菌菌核萌發仍有明顯抑制作用,表明立枯絲核菌對β-葡聚糖酶更敏感。這可能跟β-葡聚糖酶對病原真菌的抑制作用具有種間差異性有關。

表4 粗酶液對不同病原真菌菌絲生長和菌核萌發的影響

2.4 木霉β-葡聚糖酶粗酶液對水稻紋枯病的防治效果

由于人工接種了水稻紋枯病菌,調查時水稻病株率和病情指數較高(表5),對照的病株率為96%,病情指數達63.41;β-葡聚糖酶粗酶液對水稻紋枯病田間流行的控制作用明顯,稀釋5倍時水稻病株率為78%,病情指數為18.57,與5%井岡霉素處理差異不顯著。β-葡聚糖酶粗酶液稀釋5倍處理對由立枯絲核菌引起的水稻紋枯病田間防效高達70.45%,略低于5%井岡霉素處理的73.11%;隨著稀釋倍數的增加,β-葡聚糖酶粗酶液對水稻紋枯病的防治效果逐漸降低,與體外拮抗試驗結果一致。β-葡聚糖酶粗酶液和5%井岡霉素處理均提高了水稻結實率,同時提高了稻粒充實度,千粒重增加2.04～4.54 g,表明β-葡聚糖酶粗酶液對水稻具有一定的促生作用。

表5 粗酶液對水稻紋枯病田間防治效果

3 討 論

立枯絲核菌(R.solani)是瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)的無性形態,具有很強的腐生性且寄主范圍廣范,能引起多種農作物病害,對我國主要糧食作物水稻、玉米和馬鈴薯的產量和品質影響很大[27]。立枯絲核菌侵染不同作物表現出不同癥狀,其侵染水稻引起的紋枯病是影響水稻生產的重要真菌病害。由于該菌產生的菌核結構能在土壤中存活數年并可以反復萌發,使得紋枯病成為水稻生產上最難控制的病害之一[28-29]。利用生物防治控制水稻紋枯病是目前研究的熱點,木霉菌(Trichodermaspp.)擁有拮抗植物病原真菌的特性,國內多家農藥生產企業已成功開發出木霉商品制劑登記用于黃瓜、番茄、煙草等作物多種病害防治。隨著木霉菌生防特性相關研究的深入開展,其對水稻紋枯病的生防潛力日益受到人們的重視并取得了突破性進展,王艷麗等[30]研究結果表明兩株哈茨木霉菌對水稻紋枯病的最高防效分別為77.56%和83.09%;唐家斌等[31]利用木霉和類木霉混合菌株噴施處理對水稻紋枯病防效達32.25%,并對水稻結實率和千粒重等產量因素有較大提高作用;孫冬梅等[32]用黃綠木霉發酵液處理后的水稻紋枯病菌絲接種水稻植株,發病率明顯降低;劉路寧等[23]研究結果表明,綠木霉TY009對水稻紋枯病有顯著的拮抗作用。

木霉菌對植物病原真菌的生防機制包括重寄生、競爭及產生β-葡聚糖酶等細胞壁水解酶類抗菌物質。β-葡聚糖酶不僅能通過水解病原真菌細胞壁成分控制病害發展,其直接作用于植物細胞壁的產物,低聚糖可誘導與抗病反應有關的酶類(如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸-CoA聯結酶(4CL))的合成,從而增強植物的抗病性[33]。生物來源的β-葡聚糖酶資源豐富、性質穩定,在環境污染和農產品質量安全問題日益突出的今天,作為具有生防功能的生物酶類,β-葡聚糖酶在植物真菌病害防治方面具有巨大的研究價值。有報道證實,外源誘導提高植株體內β-葡聚糖酶活性可以降低水稻紋枯病田間發病水平[34],通過染色體整合β-1,4-葡聚糖酶基因提高綠色木霉對小麥紋枯病的防治效果[35]。鮮有關于β-葡聚糖酶對植物病原真菌體外拮抗作用的研究,也未見β-葡聚糖酶田間防治水稻紋枯病的報道。本研究表明,哈茨木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶粗酶液對立枯絲核菌(R.solani)和禾谷絲核菌(R.cerealis)的菌絲生長和菌核萌發均有明顯的抑制作用,稀釋5倍處理對由立枯絲核菌引起的水稻紋枯病田間防效高達70.45%,并能提高水稻結實率和稻粒充實度,這為水稻紋枯病的生物防治提供了一個新的參考方向。

不同木霉菌株產生的抗菌化合物種類差異很大,對植物病原真菌的拮抗機制也不盡相同。試驗表明哈茨木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶粗酶液對立枯絲核菌菌絲生長和菌核萌發的抑制效果均好于禾谷絲核菌,由此證實β-葡聚糖酶與絲核菌種屬之間的關系是特異性的而非廣譜性的,其對病原真菌的抑制作用具有種間差異。禾谷絲核菌和立枯絲核菌屬近源種,禾谷絲核菌是小麥和玉米紋枯病的主要病原,而立枯絲核菌除了引起水稻紋枯病外,還能引起立枯病等眾多土傳病害。鑒于此,在木霉生防產品的實際應用中,應針對不同的病原或作物進行個性化試驗以便獲得對該地區特定病害最佳防控效果。

微生物生防制劑在生產上大面積推廣使用,必須進行產業化、規?；a。微生物產酶的活性和發酵條件有關,使用最佳發酵配方與適宜的工藝流程是提高微生物農藥菌劑防治效果、降低生產成本的關鍵。 微生物產酶發酵條件一般包括誘導因子、碳源、氮源、無機鹽等培養基組分以及培養溫度、初始pH、接種量等參數[36]。本研究表明,突變木霉菌株UN-2以麥麩10.0 g/L、β-葡聚糖0.5 g/L、硫酸銨4.0 g/L、Ca2+1.5 mmol/L、Mg2+0.5 mmol/L為培養基組分,在溫度32 ℃、初始pH 6.5、接種量8 mL、瓶裝量30 mL/250 mL、搖床轉速160 r/min條件下發酵64 h獲得β-葡聚糖酶活性最高。在培養基的組分中,麥麩作為碳源對木霉產β-葡聚糖酶活性的影響最大,其原因可能是由于β-葡聚糖酶是誘導性酶,麥麩中的β-葡聚糖在木霉發酵過程中具有誘導作用。β-葡聚糖既是酶的誘導劑,又是抑制劑,在低濃度條件下能夠提高菌種產酶能力,高濃度可能阻遏酶的合成[37]。由于麥麩中的β-葡聚糖與木聚糖交聯在一起,發酵初期不能被充分利用,在培養基中加入外源β-葡聚糖可有效促進木霉菌株的產酶能力。但是,如果培養基中麥麩含量過高,其含有的β-葡聚糖則會在木霉發酵后期對木霉產酶能力產生一定的抑制作用。因此,木霉菌株發酵產β-葡聚糖酶活性對培養基中麥麩的含量較為敏感,實際應用中要著重把握。

4 結 論

試驗通過單因素和正交試驗優化了木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶的培養基組分和發酵參數,在最優條件下誘導發酵,木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶活性達97.68 U/mL。木霉菌株UN-2產β-葡聚糖酶粗酶液對立枯絲核菌和禾谷絲核菌的菌絲生長和菌核萌發有明顯的抑制作用,不同濃度的粗酶液對兩種病原真菌的抑制作用差異顯著,隨著稀釋倍數的增加,粗酶液對病原真菌菌絲生長和菌核萌發的抑制作用逐漸減弱。木霉產β-葡聚糖酶粗酶液對立枯絲核菌菌絲生長和菌核萌發的抑制效果均好于禾谷絲核菌,對由立枯絲核菌引起的水稻紋枯病田間防效高達70.45%,與5%井岡霉素處理相當。β-葡聚糖酶粗酶液和5%井岡霉素處理均提高了水稻結實率和稻粒充實度,增加千粒重約2.04～4.54 g,表明β-葡聚糖酶粗酶液對水稻具有一定的促生作用。