存活素和細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子2B在骨髓增生異常綜合征診斷及患者預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值研究

馬麗麗,付長(zhǎng)江

(1.赤峰市醫(yī)院血液科,內(nèi)蒙古 赤峰 024000;2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院介入科,內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)是以血細(xì)胞性質(zhì)、數(shù)量異常為主要特征惡性克隆性造血干細(xì)胞疾病,患者骨髓增生較活躍,外周血細(xì)胞減少,極易引發(fā)白血病,嚴(yán)重威脅患者生命健康[1-2]。該疾病高發(fā)于老年群體,發(fā)病隱匿,臨床常出現(xiàn)漏診和誤診現(xiàn)象,目前國(guó)內(nèi)外研究重點(diǎn)一直放在診斷和治療方面[3-4]。現(xiàn)階段外周血及骨髓形態(tài)學(xué)檢查、細(xì)胞遺傳分析、流式細(xì)胞免疫表型分析等是臨床常用的MDS診斷方式,具有一定應(yīng)用價(jià)值,但仍缺乏識(shí)別惡性克隆的敏感度和特異性[5-6]。有研究[7-8]表明,MDS患者髓內(nèi)無(wú)效造血主要原因可能是細(xì)胞過(guò)度凋亡,而造血細(xì)胞大量增殖會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定,因此基因突變分析可能是MDS臨床診斷的新方式。存活素(Survivin)可以調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡,而細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子2B(Cyclin dependent kinase inhibitor 2B,P15INK4B)有抑制分裂細(xì)胞的作用,可以控制細(xì)胞增殖[9]。但Survivin、P15INK4B在MDS中的研究較少,故本研究對(duì)MDS患者Survivin和 P15INK4B表達(dá)展開(kāi)分析,探討其在MDS診斷及患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年5月至2022年5月本院收治的MDS患者150例,設(shè)為觀察組,其中男性96例,女性54例;年齡49～68歲,平均(59.42±4.33)歲;體重指數(shù)(BMI)20～26 kg/m2,平均(23.01±1.08)kg/m2;高中及以下96例,大專(zhuān)及以上54例;低危45例,中危79例,高危26例;糖尿病32例,肺部疾病21例。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合MDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[10],臨床確診為MDS;心、肺、肝、腎等重要器官功能正常;精神和認(rèn)知功能正常,可以進(jìn)行有效溝通;各項(xiàng)數(shù)據(jù)資料完整,不會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響;簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):伴有先天性血液系統(tǒng)疾病;伴有惡性腫瘤、再生障礙性貧血及感染性疾病;免疫系統(tǒng)異常,可能影響研究結(jié)果;中途退出。另選取同期于本院進(jìn)行體檢的健康者150例為對(duì)照組,其中男性94例,女性56例;年齡48～70歲,平均(59.88±4.25)歲;BMI 20～26 kg/m2,平均(23.14±1.21)kg/m2;高中及以下93例,大專(zhuān)及以上57例;低危47例,中危80例,高危23例;糖尿病30例,肺部疾病20例。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)(倫理批號(hào):20190425)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞表面標(biāo)記檢測(cè):抽取所有研究對(duì)象1～2 ml骨髓,EDTA抗凝,幼稚細(xì)胞群、成熟粒細(xì)胞群和成熟單核細(xì)胞群采用CD45/SSC雙參數(shù)散點(diǎn)圖識(shí)別,流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同細(xì)胞群的分化抗原表達(dá)。磷酸鹽緩沖液對(duì)細(xì)胞濃度進(jìn)行稀釋,隨后室溫下進(jìn)行單克隆抗體標(biāo)記,將調(diào)整濃度后的100 μl單細(xì)胞懸液加入充分混合,再加入紅細(xì)胞裂解液2 ml,1500 r/min離心5 min,去除上層血清,磷酸鹽緩沖液洗滌1次,磷酸鹽緩沖液固定后上機(jī)檢測(cè),統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性率(實(shí)際檢測(cè)到的基因例數(shù)占總例數(shù)的百分比)。

1.2.2 Survivin和P15INK4B mRNA表達(dá)檢測(cè):細(xì)胞中總RNA采用TRIzol法提取,測(cè)定光密度值,隨后以β-actin為內(nèi)參(正向引物序列為5’-CGCTGCCACCGTAATCCGGACA-3’,反向引物序列為5’-GTCACGCAATTTCGACCCCGCT-3’),采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)Survivin、P15INK4B mRNA表達(dá)。Survivin mRNA正向引物序列為5’-CTAUCTCAAGGTGCACCGCAGC-3’, 反向引物序列為5’-GAGGCCATGGCAGCCAGCTAC-3’,擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性45 s,72 ℃退火1 min,循環(huán)40次。P15INK4B mRNA正向引物序列為5’-ACGTCGCGGCAGCGATGCT-3’, 反向引物序列為5’-CUGTGGGTGCAUGTGGGAACA-3’,擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,56 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸40 s,循環(huán)30次。

1.2.3 預(yù)后隨訪 對(duì)觀察組患者進(jìn)行為期1年的隨訪。隨訪結(jié)束后,將病死者歸入病死組,將其余患者歸入存活組。

2 結(jié) 果

2.1 兩組Survivin、P15INK4B陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1(圖1、2)。觀察組Survivin陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組,P15INK4B陽(yáng)性表達(dá)率及mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(均P<0.05)。

表1 兩組Survivin、P15INK4B陽(yáng)性表達(dá)情況及mRNA表達(dá)水平比較

圖1 兩組Survivin陽(yáng)性表達(dá)情況(×400)

圖2 兩組P15INK4B陽(yáng)性表達(dá)情況(×400)

2.2 不同預(yù)后患者Survivin、P15INK4B mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表2。150例MDS患者中50例病死,1年生存率為66.67%(100/150)。病死組Survivin mRNA表達(dá)水平高于存活組,P15INK4B mRNA表達(dá)水平低于存活組(均P<0.05)。

表2 不同預(yù)后患者Survivin、P15INK4B mRNA表達(dá)水平比較

2.3 Survivin、P15INK4B對(duì)MDS的診斷價(jià)值 見(jiàn)表3。Survivin、P15INK4B對(duì)MDS均有較高診斷價(jià)值,兩者聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值更高(Z=3.328、4.072,均P<0.05)。

表3 Survivin、P15INK4B對(duì)MDS的診斷價(jià)值

2.4 Survivin、P15INK4B對(duì)MDS患者不良預(yù)后的評(píng)估價(jià)值 見(jiàn)表4。Survivin、P15INK4B對(duì)MDS患者不良預(yù)后均有較高診斷價(jià)值,兩者聯(lián)合檢測(cè)的評(píng)估價(jià)值更高(Z=4.477、2.520,均P<0.05)。

表4 Survivin、P15INK4B對(duì)MDS患者不良預(yù)后的評(píng)估價(jià)值

3 討 論

MDS是以骨髓細(xì)胞異常分化、成熟和骨髓衰竭為特征的異質(zhì)性骨髓腫瘤,部分患者病情數(shù)十年也無(wú)明顯變化,但部分患者從低危進(jìn)展為高危后極易發(fā)展為白血病,更有部分患者因骨髓功能衰竭而病死[11-12]。有研究[13-14]表明,細(xì)胞凋亡屬于一種細(xì)胞死亡程序,具有保守性、遺傳性和漸進(jìn)性等特點(diǎn),該程序異常與MDS發(fā)病機(jī)制有關(guān),具有獨(dú)特的生化和形態(tài)學(xué)特性。細(xì)胞凋亡異常往往與癌癥的發(fā)生具有緊密聯(lián)系,影響血液惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,進(jìn)一步增加該疾病診斷難度[15-16]。因此,為尋找MDS更具特異性的診斷方式,為該疾病治療提供新靶點(diǎn),本研究對(duì) MDS患者凋亡抑制因子Survivin、P15INK4B陽(yáng)性表達(dá)情況及mRNA表達(dá)水平進(jìn)行分析,觀察其應(yīng)用價(jià)值。

Survivin是具有抗細(xì)胞凋亡功能的凋亡抑制基因,且與一些腫瘤預(yù)后具有相關(guān)性[17-18]。P15INK4B屬于細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控基因,有抑制細(xì)胞周期蛋白依賴激酶4、6的作用,進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞G1期至S期起到調(diào)控作用,故P15INK4B基因還屬于候補(bǔ)的腫瘤抑制基因[19-20]。本研究結(jié)果顯示,觀察組Survivin mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組更高,P15INK4B mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組更低,與MINAIYAN等[21]及LOUNTOS等[22]研究結(jié)果一致,提示MDS患者Survivin高表達(dá),P15INK4B低表達(dá)。其原因可能是:外周分化成熟的細(xì)胞較少,但骨髓增生活躍,使骨髓中粒系、紅系和巨核系細(xì)胞凋亡增加,導(dǎo)致患者無(wú)效造血;Survivin只在轉(zhuǎn)化細(xì)胞和增殖細(xì)胞中被檢出,可以加速細(xì)胞有絲分裂,促使細(xì)胞快速分裂為相同的子細(xì)胞,其過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致癌細(xì)胞分裂旺盛,快速增殖,從而加速M(fèi)DS發(fā)展[23-24]。同時(shí),MDS發(fā)病機(jī)制之一為基因的高度甲基化,而基因高度甲基化會(huì)發(fā)生基因沉默,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖,加速疾病發(fā)展[25]。P15INK4B作為候補(bǔ)腫瘤抑制基因,在多種惡性血液疾病中常表現(xiàn)為基因純合子缺失,甲基化異常,而P15INK4B基因甲基化與血液特征和細(xì)胞遺傳學(xué)具有相關(guān)性,超甲基化則會(huì)加快疾病進(jìn)程[26]。本研究結(jié)果顯示,病死組Survivin mRNA表達(dá)水平較存活組更高,P15INK4B mRNA表達(dá)水平較存活組更低。

此外,本研究通過(guò)繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn),Survivin、P15INK4B表達(dá)水平對(duì)MDS具有一定診斷價(jià)值,對(duì)MDS患者不良預(yù)后同樣具有較高評(píng)估價(jià)值,兩者聯(lián)合檢測(cè)不但對(duì)MDS有更高的診斷價(jià)值,而且對(duì)MDS患者不良預(yù)后也有更高的評(píng)估價(jià)值,提示Survivin、P15INK4B檢測(cè)在MDS患者中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述,MDS患者Survivin高表達(dá),且與患者預(yù)后呈正相關(guān);P15INK4B低表達(dá),且與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān);兩者均可用于MDS的診斷及不良預(yù)后的評(píng)估,聯(lián)合檢測(cè)有更高的價(jià)值。但上述檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的要求較高,可能不適用于所有醫(yī)院,后續(xù)還需進(jìn)行更加深入的研究,為MDS的臨床診斷提供更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、科學(xué)的方法。