芍藥苷調(diào)節(jié)絲氨酸/蘇氨酸激酶/鼠雙微基因2/p53信號通路對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響實(shí)驗(yàn)研究

許衛(wèi)星,張 薇,陳姣敏,尹鳳雷,王 娟

(滄州市中心醫(yī)院血液內(nèi)一科,河北 滄州 061001)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見的病理類型,約占所有確診非霍奇金淋巴瘤病例的30%～40%,具有很大的異質(zhì)性,呈彌漫性生長[1-2]。DLBCL的主要治療方案是利妥昔單抗加環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松,大約40%～50%患者通過該方法可治愈[3],但由于超過一半的患者出現(xiàn)化療耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,DLBCL患者的5年生存率非常低[4],因此研究新的藥物對于DLBCL患者的治療非常重要。芍藥苷(Paeoniflorin,PAE)從白芍中獲得,具有預(yù)防低血壓綜合征、預(yù)防驚厥以及免疫調(diào)節(jié)等多種功能,還被證明在多種人類惡性腫瘤中具有抗癌活性[5],但其在DLBCL中的研究鮮有報(bào)道。絲氨酸/蘇氨酸激酶(Serine/threonine kinase,AKT)信號通路是經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號通路,可抑制細(xì)胞凋亡,調(diào)節(jié)糖原代謝,通過一系列機(jī)制參與許多不同類型腫瘤的發(fā)展,如AKT/鼠雙微基因2(Murine double minute 2,MDM2)/p53信號通路在細(xì)胞凋亡和增殖的調(diào)節(jié)中起重要作用[6]。已有研究[7]顯示,抑制MDM2/p53信號通路可以抑制DLBCL的發(fā)展。本研究研究探討PAE通過調(diào)節(jié)AKT/MDM2/p53信號通路對DLBCL細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 DLBCL細(xì)胞株OCI-LY3細(xì)胞由吉雅生物技術(shù)研究所提供,在補(bǔ)充有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),在37 ℃、5% CO2的潮濕空氣中孵育,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器 Gibco提供RPMI-1640培養(yǎng)基(批號:A1049105);GIBCO提供青霉素-鏈霉素(批號:15140-122);Excell Bio提供胎牛血清(批號:FCS500);西安開米生物工程有限公司提供PAE(批號:K120505);南京恩晶生物科技有限公司提供CCK-8試劑盒(批號:E1CK-000208)、RIPA裂解液(批號:E1WP106)、SDS-PAGE變性蛋白上樣緩沖液(批號:E1WP303);上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號:P10010);Abcam公司提供AKT激活劑SC79(批號:ab146428)、p-AKT(批號:ab8933)、p-MDM2(批號:ab16895)、AKT(批號:ab8805)、MDM2(批號:ab22710)、p53(批號:ab26)單克隆抗體;BD Biosciences公司提供Annexin V-FITC/碘化丙錠(PI)雙染試劑盒(批號:559763)。Thermo Fisher Scientific提供Multiskan MK3酶標(biāo)儀;BD BioScience提供BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀;Thermo公司提供HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱;南京麥高德生物科技有限公司提供Tanon VE-180B轉(zhuǎn)膜儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞分組及處理[8-9]:OCI-LY3細(xì)胞分別經(jīng)15、30、60 μmol/L PAE處理,標(biāo)記為PAE低濃度組、PAE中濃度組和PAE高濃度組;并設(shè)置在60 μmol/L PAE進(jìn)行處理前,以8 μg/ml SC79孵育細(xì)胞24 h,標(biāo)記為PAE高濃度+SC79組;同時(shí)以未經(jīng)處理的細(xì)胞為對照組。各組處理48 h后進(jìn)行指標(biāo)分析。

1.3.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖:取OCI-LY3細(xì)胞(1×103個(gè)/孔)接種到96孔板中,置于37 ℃濕潤培養(yǎng)箱中,按照上述分組處理后向每個(gè)孔中加入10 μl CCK-8試劑,并在37 ℃孵育2 h。最后使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值,分析細(xì)胞增殖。

1.3.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞克隆形成能力:將OCI-LY3細(xì)胞接種到6孔板中,加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d,每3天更換1次培養(yǎng)基,之后經(jīng)4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色,在室溫下孵育30 min,用去離子水洗去多余的染料,進(jìn)行克隆形成計(jì)數(shù)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期:收集OCI-LY3細(xì)胞,用PBS洗滌,固定在預(yù)冷的75%乙醇中,并在20 ℃下儲存過夜。用PBS洗滌后,用PI在室溫下染色15 min,通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化。

1.3.5 Annexin V/PI雙染法分析細(xì)胞凋亡:將PBS洗滌的細(xì)胞懸浮在100 μl FITC結(jié)合緩沖液中,最低濃度為1×106個(gè)/ml,在4 ℃下與5 μl膜聯(lián)蛋白V/FITC結(jié)合15 min。然后加入10 μl PI在室溫下黑暗中孵育30 min,流式細(xì)胞儀及FlowJo軟件分析凋亡細(xì)胞變化。

1.3.6 Western blot檢測p-AKT、p-MDM2、AKT、MDM2、p53蛋白水平:從OCI-LY3細(xì)胞中提取蛋白質(zhì),經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。然后用5%脫脂牛奶封閉膜1 h,并在4 ℃下與p-AKT、p-MDM2、AKT、MDM2、p53一抗一起孵育過夜。用Tris緩沖溶液洗滌膜3次后,室溫下將辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗與膜孵育1 h,使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測免疫反應(yīng)性蛋白條帶,以單克隆GAPDH抗體為對照,使用圖像分析程序定量分析條帶。

2 結(jié) 果

2.1 PAE對OCI-LY3細(xì)胞增殖的影響 與對照組(100.00±0.00)比較,細(xì)胞增殖率在PAE低濃度組(75.28±7.56)、PAE中濃度組(52.38±5.26)、PAE高濃度組(32.55±3.27)中降低(q=11.973、23.064、32.668,均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組細(xì)胞增殖率(56.77±5.69)增加(q=11.731,P<0.05)。

2.2 PAE對OCI-LY3細(xì)胞克隆形成能力的影響 見圖1。對照組、PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組和PAE高濃度+SC79組細(xì)胞克隆形成數(shù)依次為(176.52±17.68)個(gè)、(123.34±12.36)個(gè)、(86.34±8.77)個(gè)、(42.22±4.26)個(gè)和(87.61±8.81)個(gè)。與對照組比較,PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組細(xì)胞克隆形成數(shù)降低(q=11.532、19.555、29.122,均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組細(xì)胞克隆形成數(shù)增加(q=9.842,P<0.05)。

圖1 各組細(xì)胞克隆形成數(shù)變化(結(jié)晶紫染色)

2.3 PAE對OCI-LY3細(xì)胞周期的影響 見表1。與對照組比較,PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組G0/G1期增加,G2/M、S期降低(均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組G0/G1期降低,G2/M、S期增加(P<0.05)。

表1 各組OCI-LY3細(xì)胞周期比較(%)

2.4 PAE對OCI-LY3細(xì)胞凋亡的影響 見圖2。對照組、PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組和PAE高濃度+SC79組細(xì)胞凋亡率依次為(6.82±0.70)%、(13.55±1.36)%、(27.88±2.88)%、(39.88±4.02)%和(26.75±2.71)%。與對照組比較,細(xì)胞凋亡率在PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組增加(q=6.301、19.742、30.991,均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組細(xì)胞凋亡率降低(q=12.308,P<0.05)。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況

2.5 PAE對OCI-LY3細(xì)胞p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2、p53表達(dá)的影響 見表2。與對照組比較,PAE低濃度組、PAE中濃度組、PAE高濃度組p53表達(dá)增加,p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2表達(dá)降低(均P<0.05)。與PAE高濃度組比較,PAE高濃度+SC79組p53表達(dá)水平降低,p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2表達(dá)增加(均P<0.05)。

表2 各組細(xì)胞p-AKT/AKT、p-MDM2/MDM2、p53表達(dá)比較

3 討 論

DLBCL是一種起源于B淋巴細(xì)胞的惡性腫瘤,有遺傳異質(zhì)性和顯著的表型。在目前的臨床治療中,大多數(shù)DLBCL患者生存時(shí)間短,雖然其治愈率得到改善,但臨床療效仍不令人滿意,多數(shù)患者在腫瘤復(fù)發(fā)后病死[10-12],因此迫切需要開發(fā)新的治療策略提高DLBCL的治療效果。

尋找中藥活性成分并揭示其潛在抗腫瘤作用機(jī)制已成為當(dāng)今醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)[13]。PAE是芍藥的主要成分之一。作為一種活性化合物,PAE通過影響細(xì)胞凋亡、周期停滯、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移等不同細(xì)胞生物學(xué)過程,在各種類型的腫瘤中表現(xiàn)出潛在的抗腫瘤作用[14]。SI等[15]研究發(fā)現(xiàn),PAE可減少結(jié)腸腫瘤的數(shù)量和大小,提高小鼠的存活率。PAE可抑制人B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病Nalm-6和SUP-B15細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯,為白血病的治療提供潛在藥物[16]。細(xì)胞周期對于控制細(xì)胞增殖至關(guān)重要,而對細(xì)胞增殖的抑制是由于細(xì)胞生長停滯在細(xì)胞周期的G1或G0/G1期[17],本研究發(fā)現(xiàn)PAE可以劑量依賴的方式抑制細(xì)胞克隆形成數(shù)及增殖率,使細(xì)胞周期停滯G0/G1期,提示PAE具有抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用。腫瘤的發(fā)展受細(xì)胞增殖和凋亡間的平衡控制,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種有吸引力的治療策略[18]。本研究發(fā)現(xiàn),PAE可以劑量依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表明PAE的抗腫瘤作用可能通過抑制OCI-LY3細(xì)胞增殖促進(jìn)其凋亡的實(shí)現(xiàn)。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,作為一種經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號軸,可通過多種機(jī)制與腫瘤發(fā)生相關(guān),許多類型惡性腫瘤如子宮內(nèi)膜癌、肺癌、乳腺癌和肝癌的發(fā)生均與AKT異常磷酸化水平的增加有關(guān)[19]。例如,抑制磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/AKT信號表達(dá)可抑制人結(jié)直腸癌的生長,促進(jìn)其凋亡[20]。作為AKT的重要下游靶標(biāo),MDM2可在AKT活化后磷酸化并易位至細(xì)胞核,從而抑制腫瘤抑制蛋白p53表達(dá),因此AKT/MDM2/p53信號通路在細(xì)胞周期、增殖和凋亡的調(diào)節(jié)中具有重要作用[21-22],抑制這一途徑的新型藥物是治療腫瘤的途徑之一[23]。例如,小檗胺治療后可抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/MDM2/p53信號通路初步實(shí)現(xiàn)的[24]。在結(jié)直腸癌研究中,木香烴內(nèi)酯被證明是一種新的AKT抑制劑,通過抑制AKT的磷酸化來抑制MDM2泛素化,從而激活和誘導(dǎo)p53的穩(wěn)定性,進(jìn)而抑制大腸癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)PAE處理OCI-LY3細(xì)胞后,可顯著抑制AKT磷酸化水平,進(jìn)而降低MDM2水平,上調(diào)p53表達(dá),進(jìn)而抑制OCI-LY3細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,促進(jìn)其凋亡,提示在DLBCL發(fā)展過程中AKT/MDM2通路作用可能被促進(jìn),進(jìn)而抑制了抑癌基因p53表達(dá),使得癌細(xì)胞的功能增強(qiáng),但PAE可能作為一種AKT抑制劑逆轉(zhuǎn)了上述通路的表達(dá),從而抑制了OCI-LY3細(xì)胞的惡性行為發(fā)展。最后實(shí)驗(yàn)以AKT/MDM2/p53信號通路激活劑SC79進(jìn)行了回復(fù)驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)PAE高濃度+SC79共同處理后,細(xì)胞凋亡率、p53表達(dá)、G0/G1期顯著降低,細(xì)胞克隆形成數(shù)、增殖率、p-AKT/AKT表達(dá)、p-MDM2/MDM2表達(dá)、G2/M期、S期顯著增加,表明SC79逆轉(zhuǎn)了PAE高濃度對OCI-LY3細(xì)胞惡性行為的抑制作用,提示PAE可能通過抑制AKT/MDM2/p53信號通路抑制DLBCL細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡及細(xì)胞周期停滯。

綜上所述,PAE通過抑制AKT/MDM2上調(diào)p53表達(dá),抑制DLBCL細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展,誘導(dǎo)其凋亡,可作為AKT抑制劑參與治療DLBCL。但由于細(xì)胞研究單一且缺乏動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)論仍需針對上述不足進(jìn)一步完善。