長鏈非編碼RNA RP11-641D5.1通過靶向微小RNA-486-5p調(diào)控急性髓系白血病細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和免疫逃逸實驗研究

敖會芳,黃 華,王紅權(quán),劉 俊,郭春梅,姚 云

(1.荊楚理工學(xué)院附屬中心醫(yī)院 荊門市人民醫(yī)院血液內(nèi)科,湖北 荊門 448000;2.荊楚理工學(xué)院附屬中心醫(yī)院 荊門市人民醫(yī)院感染性疾病科,湖北 荊門 448000;3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科,遼寧 大連 116011)

急性髓系白血病是成年人常見的血液系統(tǒng)腫瘤,起源于髓系造血干/祖細(xì)胞,表現(xiàn)為異常的幼稚細(xì)胞和原始細(xì)胞過度增殖[1-2]。急性髓系白血病患者5年生存率較低,且發(fā)病率表現(xiàn)為逐漸上升趨勢,嚴(yán)重危害患者的生命健康[3]。目前,急性髓系白血病的發(fā)病機制并不清楚。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是一類無蛋白編碼功能的單鏈RNA分子,廣泛表達于真核細(xì)胞中,參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[4]。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展,越來越多的研究[5-7]表明,lncRNA作為一種功能性RNA,影響多種腫瘤如黑色素瘤、骨肉瘤、膽管瘤、白血病的發(fā)生和發(fā)展。lncRNA不僅能夠作為急性髓系白血病的診斷標(biāo)志物,還具有潛在治療價值,其在急性髓系白血病的靶向治療方面發(fā)揮重要作用[8-9]。根據(jù)lncRNAdb數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),RP11-641D5.1基因位于人染色體3q26.2區(qū)域,負(fù)責(zé)編碼長度為410個核苷酸長度的lncRNA。RP11-641D5.1在惡性腫瘤特別是急性髓系白血病中的表達和功能尚未明確。本研究基于基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)分析顯示,急性髓系白血病患者骨髓組織中RP11-641D5.1表達明顯低于正常骨髓組織。因此,本研究通過上調(diào)RP11-641D5.1表達分析急性髓系白血病細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和免疫逃逸的變化及可能的分子機制,為尋找急性髓系白血病診療的潛在靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞與主要試劑 人骨髓基質(zhì)細(xì)胞HS-5和急性髓系白血病細(xì)胞株(HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4)購自中科院上海細(xì)胞庫。微小RNA(miR)-486-5p、miR-NC、陰性質(zhì)粒和RP11-641D5.1質(zhì)粒(批號:STLC006、STLC008、MILC003、MILC004)購自廣州銳博生物公司;TRIzol試劑、細(xì)胞周期試劑盒(批號:631460、672349)購自日本Takara公司;熒光素酶野生型載體RP11-641D5.1-WT和突變型載體RP11-641D5.1-MUT(批號:KHC0532、KHC0648)購自武漢三鷹科技有限公司;酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、Lipofectamine 3000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:12356151、12445032、12749869)購自美國Invitrogen公司;雙熒光素酶報告基因試劑盒(批號:HZYY9684)購自杭州禹揚科技有限公司;磷酸化酪氨酸激酶(p-JAK)、磷酸化轉(zhuǎn)錄激活因子(p-STAT)、β-微管蛋白(β-Tubulin)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(SOCS3)、核內(nèi)原癌基因c-myc抗體(批號:ab32101、ab267373、ab18207、ab280884、ab185656)購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 用含13%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HS-5、SKM-1細(xì)胞,用含13%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)HL-60細(xì)胞,用含13%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)THP-1、KG-1、NB4細(xì)胞,在恒溫和恒濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前18 h,將對數(shù)生長期SKM-1細(xì)胞接種在24孔板,采用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體試劑分別將陰性質(zhì)粒(NC組)和RP11-641D5.1質(zhì)粒(RP11-641D5.1組)轉(zhuǎn)染到SKM-1細(xì)胞,最終濃度為50 nmol/L。

1.3 實驗方法

1.3.1 實時定量PCR(RT-qPCR)檢測RP11-641D5.1和miR-486-5p表達:用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,采用無核酸酶的雙蒸水溶解,通過Nano Drop分光光度分析總RNA的純度和濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄2.0 μg RNA為cDNA,在PCR擴增儀中進行RT-qPCR。以GAPDH或U6為內(nèi)參,引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法分析RP11-641D5.1和miR-486-5p表達。

表1 各基因引物序列

1.3.2 集落形成實驗檢測SKM-1細(xì)胞增殖:將轉(zhuǎn)染后的兩組SKM-1細(xì)胞分別以3000個/孔重新接種于6孔板,每組5個復(fù)孔。恒溫、恒濕培養(yǎng)11 d。采用2 ml無水甲醇固定SKM-1細(xì)胞,2 ml結(jié)晶紫染色,用雙蒸水充分洗滌,烘干后觀察兩組SKM-1細(xì)胞的集落形成,統(tǒng)計分析并拍照。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測SKM-1細(xì)胞周期:收集轉(zhuǎn)染后的兩組SKM-1細(xì)胞,制備為單細(xì)胞懸液。采用2 ml 75%乙醇在低溫下固定SKM-1細(xì)胞,加入300 μl PI試劑染色15 min。通過篩網(wǎng)充分過濾兩組細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞儀分析SKM-1細(xì)胞的周期分布。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測細(xì)胞因子表達量:收集轉(zhuǎn)染后的兩組SKM-1細(xì)胞,分別加入T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)48 h。加入150 μl生物素標(biāo)記的抗體工作液,室溫下反應(yīng)1.5 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5次,加入150 μl辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗工作液,室溫下反應(yīng)1 h。用PBS溶液洗5次,加入150 μl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液,室溫下反應(yīng)1 h。加入150 μl終止液,采用全自動酶標(biāo)儀分析各孔的光密度值,計算干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)的含量。

1.3.5 雙熒光素酶報告實驗檢測RP11-641D5.1和miR-486-5p的靶向關(guān)系:用LncCeRBase軟件預(yù)測RP11-641D5.1和miR-486-5p的結(jié)合位點。分別共轉(zhuǎn)染RP11-641D5.1-WT與miR-NC、RP11-641D5.1-WT與miR-486-5p、RP11-641D5.1-MUT與miR-NC、RP11-641D5.1-MUT與miR-486-5p至對數(shù)生長期的SKM-1細(xì)胞,應(yīng)用雙熒光素酶報告基因試劑盒處理各組SKM-1細(xì)胞,熒光發(fā)光檢測儀檢測螢火蟲熒光素活性以及海腎熒光素活性。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測JAK-STAT3信號通路蛋白表達:配制含2%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,提取轉(zhuǎn)染后兩組SKM-1細(xì)胞的總蛋白。取55 μg蛋白樣品在13% SDS-PAGE膠電泳3 h,用260 mA電流轉(zhuǎn)膜到聚偏二氯乙烯膜。加入快速封閉液,室溫下封閉20 min。制備一抗稀釋液,均按照1∶2000進行稀釋,低溫孵育一抗17 h。ECL顯影試劑處理2 min后,在暗室內(nèi)曝光并顯影。

2 結(jié) 果

2.1 急性髓系白血病細(xì)胞株中RP11-641D5.1表達情況 見圖1。RT-qPCR結(jié)果顯示,相對于HS-5細(xì)胞,急性髓系白血病細(xì)胞株HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4中RP11-641D5.1表達較低,且SKM-1細(xì)胞中表達最低(均P<0.05)。故后續(xù)采用SKM-1細(xì)胞進行實驗。

注:與HS-5比較,*P<0.05;與SKM-1比較,#P<0.05圖1 急性髓系白血病細(xì)胞株中RP11-641D5.1表達比較

2.2 兩組SKM-1細(xì)胞RP11-641D5.1表達量比較 轉(zhuǎn)染實驗結(jié)果顯示,NC組與RP11-641D5.1組中RP11-641D5.1相對表達量分別為1.03±0.25和10.17±0.79。與NC組比較,RP11-641D5.1組SKM-1細(xì)胞中RP11-641D5.1表達量升高(P<0.05)。

2.3 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細(xì)胞增殖的影響 見圖2。集落形成實驗結(jié)果顯示,NC組和RP11-641D5.1組SKM-1細(xì)胞集落形成數(shù)量分別為(116.86±15.43)個和(42.70±11.14)個。與NC組比較,RP11-641D5.1組SKM-1細(xì)胞集落形成數(shù)量減少(P<0.05)。

注:左圖為兩組細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果;右圖中,與NC組比較,*P<0.05圖2 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細(xì)胞增殖的影響

2.4 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細(xì)胞周期的影響 見圖3。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與NC組比較,RP11-641D5.1組G0/G1期細(xì)胞比例升高,S期和G2/M期細(xì)胞比例降低(均P<0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05圖3 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細(xì)胞周期的影響

2.5 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-2含量的影響 見圖4。酶聯(lián)免疫吸附實驗結(jié)果顯示,與NC組比較,RP11-641D5.1組共培養(yǎng)的T淋巴細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2含量升高(均P<0.05)。

注:與NC組比較,*P<0.05圖4 過表達RP11-641D5.1對SKM-1細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-2含量的影響

2.6 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果 見圖5、6。LncCeRBase軟件預(yù)測結(jié)果顯示,RP11-641D5.1與miR-486-5p存在互補結(jié)合序列,miR-486-5p可能為RP11-641D5.1的靶基因。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,與miR-NC比較,miR-486-5p能夠抑制RP11-641D5.1-WT的熒光素酶活性(P<0.05),而對RP11-641D5.1-MUT的熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。

圖5 RP11-641D5.1與miR-486-5p的結(jié)合位點

2.7 過表達RP11-641D5.1對 miR-486-5p表達的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示,NC組與RP11-641D5.1組SKM-1細(xì)胞中miR-486-5p相對表達量分別為6.15±0.37和0.98±0.30。與NC組比較,RP11-641D5.1組SKM-1細(xì)胞中miR-486-5p表達水平降低(P<0.05)。

2.8 過表達RP11-641D5.1對JAK-STAT3信號通路蛋白表達的影響 見圖7。Western blot結(jié)果顯示,與NC組比較,RP11-641D5.1組JAK-STAT3信號通路蛋白p-JAK、p-STAT、SOCS3、c-myc蛋白表達水平降低(均P<0.05)。

圖7 JAK-STAT3信號通路蛋白電泳圖

3 討 論

lncRNA是非編碼RNA家族的重要成員,參與細(xì)胞的各種活動如氨基酸代謝、脂肪消化、糖異生等[10-11]。近年來研究[12-13]發(fā)現(xiàn),lncRNA在肺鱗癌、三陰性乳腺癌、鼻咽癌等多種腫瘤中異常表達,能夠促進或抑制腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡和免疫逃逸。越來越多的lncRNA被證明參與急性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展過程,與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)或正相關(guān)[14-15]。例如,lncRNA USP30-AS1在急性髓系白血病中高表達,其高表達與急性髓系白血病預(yù)后不良有關(guān),lncRNA USP30-AS1可促進急性髓系白血病細(xì)胞活力、免疫逃逸并抑制細(xì)胞凋亡[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn),與正常骨髓組織相比,lncRNA MAFG-AS1在急性髓系白血病中過表達,通過海綿化miR-147b促進急性髓系白血病HL-60細(xì)胞生長、細(xì)胞周期進展和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。目前,RP11-641D5.1在腫瘤中的表達模式和作用研究較少。

GEO數(shù)據(jù)庫分析顯示,RP11-641D5.1在急性髓系白血病患者骨髓組織中呈低表達。本研究中,RP11-641D5.1在急性髓系白血病HL-60、SKM-1、THP-1、KG-1、NB4細(xì)胞中也呈低表達,其可能是急性髓系白血病診斷的分子標(biāo)記。本研究結(jié)果顯示,過表達RP11-641D5.1的急性髓系白血病SKM-1細(xì)胞增殖活力顯著降低,同時細(xì)胞在G0/G1期發(fā)生阻滯,細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-2含量增加,表明細(xì)胞的免疫逃逸顯著被抑制,提示RP11-641D5.1在急性髓系白血病細(xì)胞中可能為抑癌基因。研究[18-21]證實,lncRNA主要作為競爭性內(nèi)源性RNA充當(dāng)分子海綿,定向結(jié)合miRNA。本研究利用LncCeRBase軟件分析發(fā)現(xiàn),miR-486-5p與RP11-641D5.1存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告實驗檢測發(fā)現(xiàn),RP11-641D5.1能夠靶向結(jié)合miR-486-5p。miR-486-5p在卵巢癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中高表達,能夠促進腫瘤細(xì)胞的生長和分化,在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[22-24]。研究[25]表明,miR-486-5p在急性髓系白血病中表達上調(diào),能夠顯著促進急性髓系白血病的惡性生物學(xué)行為。本研究采用RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)過表達RP11-641D5.1后miR-486-5p表達量下調(diào)。以上實驗結(jié)果說明,RP11-641D5.1可作為miR-486-5p的競爭性內(nèi)源性RNA發(fā)揮作用。多項研究表明,JAK-STAT3信號通路在急性髓系白血病細(xì)胞中異常表達,其激活能夠加速急性髓系白血病細(xì)胞周期進展,促進腫瘤細(xì)胞的增殖和免疫逃逸。已有研究[23]證實,miR-486-5p主要通過介導(dǎo)激活JAK-STAT3信號通路促進急性髓系白血病的發(fā)展。本研究又發(fā)現(xiàn),過表達RP11-641D5.1后JAK-STAT3信號通路相關(guān)蛋白p-JAK、p-STAT、SOCS3、c-myc活性降低。進一步研究證明RP11-641D5.1通過調(diào)控miR-486-5p表達參與急性髓系白血病的發(fā)展。

綜上所述,RP11-641D5.1在急性髓系白血病中表達水平降低,可能通過下調(diào)miR-486-5p表達抑制急性髓系白血病細(xì)胞增殖、周期進展及免疫逃逸。RP11-641D5.1可能成為急性髓系白血病分子治療的潛在靶點。本研究的不足之處在于RP11-641D5.1是否在體內(nèi)同樣對急性髓系白血病細(xì)胞的生長和免疫逃逸具有抑制作用,本研究下一步將通過建立急性髓系白血病小鼠模型探究RP11-641D5.1在體內(nèi)的抑癌作用。