枳椇子黃酮的含量測定及其抗氧化作用的分子機制

劉菁華,駱潔雅,郭 鵬,葉 子,楊 娟,王柯琪,嚴湘儒,楊盛剛,黃 勁

(1. 貴州醫科大學基礎醫學院,貴州 貴陽 550025;2. 貴州醫科大學貴州省病原生物學特色重點實驗室,貴州 貴陽 550025;3. 貴州醫科大學藥學院,貴州 貴陽 550025)

枳椇子為鼠李科(Rhamnaceae)鼠李屬(Hovenia)植物枳椇(Hoveniadulcis)的干燥成熟帶肉質花序軸的果實和種子,性平味甘,具有除煩止渴、清退濕熱、解酒毒之功效[1]。枳椇子黃酮作為一種天然抗氧化劑[2-4],在枳椇子中含量較高,主要包括雙氫楊梅素、雙氫槲皮素、槲皮素、雙氫山萘酚和山萘酚5種成分[3]。研究顯示,枳椇子黃酮可通過提高生物體內抗氧化酶的活性,增強自由基的清除,進而減少自由基介導的氧化應激對肝臟的損傷,達到解酒保肝的作用[5-6]。因此,針對枳椇子黃酮產品的開發日益受到關注。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一種重要的特異性清除自由基的抗氧化酶,普遍存在于生物體內[7]。SOD由2個亞基組成,能催化超氧離子生成H2O2和O2,使機體免受超氧離子的侵害,在抗炎、抗衰老和抗腫瘤等方面具有重要的作用[7]。有研究顯示,多種黃酮或黃酮類化合物,如綠茶黃酮和白藜蘆醇等能通過與SOD結合,穩定其構象,從而影響其催化活性[8-10]。然而,目前鮮有枳椇子黃酮與SOD相互作用的報道,為進一步探討枳椇子黃酮抗氧化活性的作用機制,本試驗以槲皮素作為對照品,利用分光光度法測定枳椇子黃酮含量,并采用分子對接分析枳椇子黃酮與SOD的相互作用,為枳椇子產品深加工和枳椇子黃酮抗氧化應激作用機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 中藥材和主要試劑 枳椇子,購自遵義藥材批發市場,經貴州醫科大學藥學院楊盛剛副教授鑒定為優質藥材。甲醇、乙醇、無水三氯化鋁(AlCl3)、冰醋酸和槲皮素等試劑,均為分析純,購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器 UV-2700紫外可見光分光光度計(日本島津儀器有限公司),HH-2數顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司),EL204電子天平(美國Mettler Toledo科技有限公司),DFT-100高速中藥粉碎機(溫嶺大得中藥器械有限公司),實驗室超純水機(美國Millipore公司),RE-52旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 軟件 AutoDock 4.2.6和AutoDock Tools 1.5.6(美國 Scripps研究所),PyMol 2.4(美國DeLano Scientific LLC公司),LigPlot+(歐洲分子生物實驗室EMBL-EBI)。

1.4 方法

1.4.1 枳椇子供試品儲存液的制備 參照參考文獻[11]的方法制備枳椇子提取液。準確稱取枳椇子100 g,碾碎成粉末過80目篩,加蒸餾水(料液比1∶6),冷凝回流煎煮2次,合并濾液,即得水提液。取水提液100 mL,加入100 mL乙醇,過夜沉淀。隔日使用布氏漏斗進行粗過濾,再經過0.45 μm濾膜過濾,使用旋轉蒸發儀除去乙醇,水浴鍋80 ℃加熱3 h制備浸膏,使用甲醇溶解配制濃度為100 mg/mL的供試品儲存液。

1.4.2 枳椇子總黃酮含量的測定 準確稱取槲皮素0.005 g于50 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容得100 μg/mL的對照品儲備液。準確吸取對照品儲備液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mL,分別置于6個10 mL容量瓶中,加入濃度為0.1 mol/L的AlCl3甲醇溶液2 mL、濃度為0.2 mol/L的醋酸溶液4 mL,加甲醇定容至刻度,搖勻靜置40 min后備用。以未加對照品儲備液的溶液作為調零溶液,用紫外可見光分光光度計在190～800 nm波長范圍內進行紫外-可見光吸收光譜(Ultraviolet and visible spectrogram,UV-Vis)全波段掃描,選擇最大吸收波長作為后續的檢測波長。以吸光度值為縱坐標,對照品質量濃度為橫坐標,繪制標準曲線。將供試品儲存液(100 mg/mL)用甲醇稀釋10倍,準確吸取0.625 mL于10 mL容量瓶中,加入0.1 mol/L的AlCl3甲醇溶液2 mL,0.2 mol/L的醋酸溶液4 mL,加甲醇定容至刻度,在對照品最大吸收波長處檢測其吸光度值,按照公式(1)計算樣品的總黃酮含量。

(1)

式中,C(mg/mL)為枳椇子總黃酮濃度,V(mL)為供試品儲存液的體積,m(g)為枳椇子質量。

1.4.3 配受體準備 從PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取枳椇子黃酮的主要成分:雙氫楊梅素(PubChem CID:161557)、雙氫槲皮素(PubChem CID:439533)、槲皮素(PubChem CID:5280343)、雙氫山萘酚(PubChem CID:122850)和山萘酚(PubChem CID:5280863)三維(3 Dimensions,3D)結構的sdf格式文件,通過OpenBabel 3.1.1(http://openbabel.org/)[12]將其轉化為pdb格式文件,導入AutoDock Tools 1.5.6[13]中,對配體進行加極性氫,計算Gasteiger電荷,添加原子類型,設置可扭轉鍵,將位置和電荷等結構信息保存為pdbqt格式文件。然后,從Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/)中獲取SOD同源二聚體(PDB ID:4B3E)的晶體結構,通過PyMol 2.4刪除晶體中的原配體和水分子,保存為pdb格式文件,通過AutoDock Tools 1.5.6對酶進行加氫,計算電荷,保存為pdbqt格式文件。由于SOD是一類含銅鋅離子的金屬酶,且銅鋅離子在酶促反應的進行和SOD結構的穩定方面具有重要作用,因此將銅和鋅離子的電荷數設為+2.0,保存于SOD的pdbqt格式文件中。

1.4.4 枳椇子黃酮與SOD的分子對接 使用北京大學來魯華和裴劍鋒團隊開發的CavityPlus軟件[14](http://pkumdl.cn:8000/cavityplus/index.php)中CorrSite2.0模塊預測枳椇子黃酮主要成分與SOD相互作用的潛在位點,以Z-score分值作為評判標準,得分高于0.5且數值越大,則表明該位點作為結合口袋的潛力越大;運用AutoDock 4.2.6軟件中半柔性對接的方法,以拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm,LGA)進行構象搜索,設置對接參數Number of GA Run為50、Maximum number of evals為3 000 000、Maximum number of generations為30 000,其他參數為默認值,然后將枳椇子黃酮5個主要成分依次與SOD的結合位點對接;將上述對接結果導入PyMol 2.4和LigPlot+中,分析配體與受體之間相互作用的氨基酸和化學鍵。

2 結果

2.1 槲皮素對照品的UV-Vis全波段掃描 結果見圖1,槲皮素對照品顯色在421 nm處出現最大吸收值,因此后續試驗選用421 nm作為檢測波長。

圖1 槲皮素對照品UV-Vis掃描

2.2 枳椇子總黃酮含量的測定 根據槲皮素對照品的吸光度值,繪制標準曲線(圖2),得枳椇子總黃酮濃度線性回歸方程為Y= 0.078 70X+0.001 006,R2=0.999 6,其中X為黃酮質量濃度,Y為吸光度值。根據回歸方程和公式(1)計算,枳椇子總黃酮含量為8.23 mg/g。

圖2 槲皮素對照品標準曲線

2.3 枳椇子黃酮與SOD相互作用位點的分析 從Protein Data Bank獲得的SOD同源二聚體的三維結構見圖3,將其導入CavityPlus軟件預測枳椇子黃酮主要成分與SOD相互作用的潛在位點,結果顯示,其相互作用的活性位點共有7個,分別為Site1～7(圖4);Site1～7的Z-score分值分別是1.03、2.19、0.06、-0.67、-0.13、0.06和-0.40,其中Site2的 Z-score分值最高,為2.19,推測兩者結合位點為SOD中2條鏈交界面且靠近鋅離子的一凹陷區域,即Site2為枳椇子黃酮與SOD的結合位點,故后續選用此位點作為枳椇子黃酮與SOD的對接口袋。

圖3 SOD同源二聚體的三維結構

圖4 枳椇子黃酮主要成分與SOD潛在結合位點預測

2.4 枳椇子黃酮與SOD相互作用的氨基酸和化學鍵 分子對接結果見圖5,枳椇子黃酮5個主要成分均能與SOD直接作用,其結合能范圍為-8.5～-8.3 kcal/mol,結合配受體間相互作用的氨基酸和氫鍵數量見表1,提示枳椇子黃酮化合物均能與SOD形成穩定的復合物。

表1 枳椇子黃酮主要成分與SOD相互作用的氨基酸和化學鍵

圖5 枳椇子黃酮與SOD的分子對接

為探究枳椇子黃酮抗氧化作用分子機制,用PyMol 2.4和LigPlot+分析枳椇子黃酮與SOD相互作用的氨基酸和成鍵作用,結果如圖6所示,枳椇子黃酮5個主要成分分別與SOD的多個氨基酸殘基發生相互作用,其互作的氨基酸殘基見表1,枳椇子黃酮5個主要成分均與SOD中A鏈的Gly147和B鏈的Gly147氨基酸殘基有直接作用。進一步分析兩者相互作用的化學鍵發現,枳椇子黃酮的酚羥基和苯環分別通過氫鍵和疏水作用力與SOD發生相互作用(圖6)。如圖7所示,靜電作用力也進一步起到穩定復合物的作用。

圖6 枳椇子黃酮與SOD相互作用化學鍵的二維平面圖

圖7 枳椇子黃酮與SOD對接的靜電作用力

3 討論

枳椇子作為藥食同源植物枳椇的果實和種子,富含黃酮類、生物堿類、皂苷和糖苷類等多種生物活性物質[3],尤其是枳椇子黃酮具有較好的抗氧化和抗炎活性。研究表明,雙氫楊梅素、雙氫槲皮素、槲皮素、雙氫山萘酚和山萘酚是枳椇子黃酮中主要的5種活性成分,對酒精性肝損傷、糖尿病和腫瘤等疾病有一定的干預治療作用[4,6,15],其作為功能性食品或膳食補充劑具有良好的市場開發潛力[16]。目前市場上的相關產品有枳椇子解酒飲料、枳椇子膠囊和枳椇子酸奶等[17],但是枳椇子深加工產品比較缺乏。本試驗采用醇提法對貴州省遵義地區的枳椇子黃酮含量進行評估,采用紫外-可見分光光度法測得枳椇子總黃酮含量為8.23 mg/g,這為后續枳椇子產品深加工提供了參考。

SOD是重要的抗氧化酶,通過清除氧自由基,維持機體的氧化與抗氧化平衡[7-8]。本課題組在前期研究中發現,枳椇子含藥血清能顯著提高細胞的SOD酶活性,減少自由基介導的氧化應激對肝細胞的損傷,進而發揮對酒精性肝損傷細胞的保護作用[5]。同時有文獻報道,枳椇子抗氧化活性與其所含的黃酮密切相關,枳椇子黃酮可通過增加SOD活性,進而參與多種疾病的干預和治療[5,18],但其作用機制尚不清楚。為進一步探索枳椇子黃酮抗氧化應激的潛在分子機制,本試驗采用分子對接、計算機模擬分析枳椇子黃酮與SOD之間的相互作用,結果顯示,兩者結合位點為SOD中2條鏈交界面且靠近Zn2+的一凹陷區域,其結合能為-8.5～-8.3 kcal/mol;進一步分析相互作用的基團和化學鍵,發現枳椇子黃酮通過氫鍵、疏水作用力和靜電作用力與SOD發生直接作用。有研究通過核磁共振(Nuclear magnetic resonance,NMR)和電噴霧質譜(Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技術發現,綠茶中的茶黃酮和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)以及白藜蘆醇等多酚類化合物可與SOD形成穩定的復合物[8-9,19-20]。有研究表明,配受體間相互作用的氫鍵、疏水作用力和靜電作用力等非共價鍵具有降低反應結合能,增加酶結構穩定性的作用[9,20]。結合本試驗中枳椇子黃酮主要成分與SOD相互作用的化學鍵,提示枳椇子黃酮可能通過氫鍵等非共價鍵與SOD結合,進而促進其與底物的結合,增強其抗氧化損傷作用。

綜上所述,本試驗采用醇提法提取枳椇子黃酮成分,紫外-可見分光光度法測定黃酮含量,并進一步采用分子對接分析枳椇子黃酮與SOD相互作用的潛在分子機制,為后續探索枳椇子黃酮抗氧化應激作用機制及挖掘枳椇子產品的附加價值提供了科學依據。