女貞子中主要活性成分紅景天苷和特女貞苷的逆轉(zhuǎn)鐵過(guò)載促進(jìn)骨形成相互作用研究

何丹丹 趙白秀 汪華君 蔣俊* 沈袁佳怡 何津津

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,江蘇 南京 210028

2.江蘇大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013

3.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是最普遍的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥之一[1],其特征在于雌激素水平和骨密度降低,骨骼微觀結(jié)構(gòu)破壞,骨脆性和骨折易感性增加[2]。PMOP的常見和嚴(yán)重危害是多部位發(fā)生脆性骨折,尤其是髖部和椎骨骨折[3-4]。在世界范圍內(nèi),超過(guò)50%的絕經(jīng)后婦女患有PMOP[5],PMOP已經(jīng)成為危害中老年婦女健康的重大疾病之一[6-7]。除雌激素缺失外,鐵過(guò)載是PMOP所伴隨的不可忽視的危險(xiǎn)因素。女性每年約有36 mg鐵通過(guò)月經(jīng)排出[8],然而停經(jīng)后5～10年內(nèi),鐵蓄積可導(dǎo)致血清鐵蛋白水平上升2～3倍[9]。研究表明,血液、組織中游離鐵蓄積過(guò)多則會(huì)誘發(fā)骨量降低、破壞骨微結(jié)構(gòu)和骨的生物力學(xué)強(qiáng)度[10]。因此,篩選出能下調(diào)鐵過(guò)載、逆轉(zhuǎn)鐵代謝紊亂的有效中藥是防治PMOP的創(chuàng)新策略。女貞子是木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實(shí)[11],在2020年版《絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中醫(yī)臨床指南》中被強(qiáng)推薦為抗PMOP有效藥物。女貞子中含有苯乙醇類、環(huán)烯醚萜類和三萜類等多種類型的活性化合物,且苯乙醇類和環(huán)烯醚萜類[12]的含量最高。紅景天苷、特女貞苷分別是苯乙醇類和環(huán)烯醚萜類的代表性成分,也是藥典中女貞子飲片的質(zhì)控指標(biāo)[13];特女貞苷、紅景天苷的抗PMOP的藥理作用已有報(bào)道[14-16],但兩者間的藥效學(xué)相互作用研究未見報(bào)道。

藥效學(xué)相互作用形式包括協(xié)同作用、相加作用和拮抗作用,主要表現(xiàn)為藥理效應(yīng)改變引起的藥效和(或毒性)的改變,表現(xiàn)在同一受體部位或相同生理系統(tǒng)上作用的相加(1+1=2)、協(xié)同(1+1>2)或拮抗(1+1<1)[17-18]。為闡述特女貞苷和紅景天苷的抗PMOP效應(yīng)以及兩者間的相互作用,本研究采用檸檬酸鐵銨建立鐵過(guò)載誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型,茜素紅染色后以骨骼染色面積和累積光密度評(píng)價(jià)特女貞苷、紅景天苷對(duì)鐵過(guò)載誘導(dǎo)的骨形成抑制的逆轉(zhuǎn)作用,并進(jìn)一步采用等效線法、等輻射分析法探討特女貞苷與紅景天苷間的相互作用,為揭示女貞子中主要活性成分紅景天苷和特女貞苷的抗PMOP的相互作用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

去鐵胺(DFO,諾華制藥有限公司);檸檬酸鐵銨(FAC,邁瑞爾生化公司);茜素紅(上海泰坦科技股份有限公司);紅景天苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,南京源植生物科技公司);特女貞苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,南京源植生物科技公司);95%甲醛(純度≥95%,上海泰坦科技股份有限公司);3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS222,純度≥98%,Adamas-reagent)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試藥

野生型斑馬魚胚胎(AB系),由南京一樹梨花生物科技有限公司提供。E3培養(yǎng)液的配制按照之前的研究進(jìn)行[19-20]。取適量紅景天苷與特女貞苷,精密稱定,用DMSO/E3溶液配制成濃度為100 μmol/L的儲(chǔ)備液,再用梯度稀釋法分別配制成不同濃度(1、5、25、50、100 μmol/L)的工作液。取適量FAC,將其溶解于E3溶液,配制成100 mg/L的溶液。

1.3 斑馬魚分組與處理

將受精后第2天(2 dpf)的斑馬魚幼魚分成14組,置裝有3 mL空白培養(yǎng)基的6孔板中(n=15)。具體分組如下:空白對(duì)照組(CON,E3培養(yǎng)液),二甲基亞砜組(DMSO),模型組(MX,100 μg/mL檸檬酸鐵銨),陽(yáng)性對(duì)照去鐵胺組(DFO,100 μmol/L),紅景天苷組(1、5、25、50、100 μmol/L),特女貞苷組(1、5、25、50、100 μmol/L),紅景天苷與特女貞苷1∶1混合組(1、5、25、50、100 μmol/L)。斑馬魚具體的培養(yǎng)和給藥方法見本課題組之前發(fā)表的論文[21]。

1.4 茜素紅染色

連續(xù)給藥4 d后,收集所有斑馬魚,每孔用4 mL MS-222 (100 mg/L)溶液麻醉30 min處死。隨后用4 mL 10%甲醛PBS溶液固定斑馬魚的形態(tài)和組織,去除固定液后用50%乙醇溶液洗10 min,吸干后加入茜素紅溶液(0.5% KOH)染色放置過(guò)夜。除去并洗凈染色溶液,加入新鮮制備的漂白液(1% KOH和1.5% H2O2)漂白1 h,并放置于50%甘油/50% PBS溶液中保存。

1.5 骨礦化分析

按本課題組已成功構(gòu)建的方法[22],在正置顯微鏡下(Olympus BX41,日本)觀察斑馬魚骨骼的染色情況,對(duì)斑馬魚的骨礦化面積(AMB)和累積光密度(COD)進(jìn)行定量分析。使用Image J軟件計(jì)算AMB和COD,并用Graphpad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 相互作用評(píng)價(jià)

按照Probit法[23]計(jì)算得紅景天苷、特女貞苷及兩者聯(lián)合用藥后的EC50及95%CI。采用等效線法、等輻射分析法[24]共同評(píng)價(jià)紅景天苷與特女貞苷的藥效學(xué)相互作用。①等效線法計(jì)算方法:等效線法是一種常用的藥物相互作用評(píng)價(jià)方法,它適用于藥物與效應(yīng)呈劑量依賴關(guān)系的情況,其通過(guò)計(jì)算相互作用指數(shù)(interaction index,γ)來(lái)評(píng)價(jià)藥物協(xié)同作用的不同程度。等效線法的計(jì)算公式為γ=a/A+b/B,其中a和b代表聯(lián)合使用時(shí)兩藥的劑量,A和B代表單獨(dú)使用時(shí)達(dá)到與聯(lián)合使用時(shí)等效的兩藥的劑量。當(dāng)γ=1時(shí),兩藥呈相加作用;當(dāng)γ<1時(shí),兩藥呈協(xié)同作用;當(dāng)γ>1時(shí),兩藥呈拮抗作用。②等輻射分析法計(jì)算方法:橫、縱軸標(biāo)記單獨(dú)用藥EC50值和95%CI,連接兩EC50值構(gòu)成相加線,連接兩置信限構(gòu)成相加線的95%CI。當(dāng)聯(lián)合用藥EC50處于相加線上或置信限內(nèi),表示相加作用;處于置信限下方,表示協(xié)同作用;處于置信限上方,表示拮抗作用。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graphpad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Graphpad Prism 9.0中Tukey檢驗(yàn)確定各組之間的差異,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷和特女貞苷對(duì)骨礦化的影響

茜素紅染色結(jié)合圖像量化結(jié)果表明,與空白組和二甲基亞砜組相比,模型組AMB和COD顯著減少(P<0.05)(圖1、2),表明檸檬酸鐵銨成功地抑制了斑馬魚的骨骼生長(zhǎng)與骨礦化進(jìn)程。與模型組相比,在不同濃度的紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液的干預(yù)下,斑馬魚AMB和COD顯著增加(P<0.05),見圖1、2。結(jié)果表明,紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液均有較好的逆轉(zhuǎn)鐵過(guò)載導(dǎo)致的骨形成抑制,且具有濃度依賴性。

圖1 茜素紅染色斑馬魚頭骨腹側(cè)視圖(×150)

圖2 紅景天苷、特女貞苷對(duì)斑馬魚骨礦化的影響 (n=15)

2.2 相互作用評(píng)價(jià)

2.2.1等效線法。紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液對(duì)斑馬魚的骨礦化具有改善作用,紅景天苷與特女貞苷混合使用時(shí),呈現(xiàn)出骨骼染色面積的顯著提高,且其混合之后的活性優(yōu)于同濃度的紅景天苷和特女貞苷,見表1。

表1 不同濃度紅景天苷與特女貞苷及其混合溶液對(duì)骨骼染色面積的影響(n=15)

通過(guò)Probit法計(jì)算可得紅景天苷、特女貞苷及聯(lián)合用藥的EC50分別為0.85、0.92、1.02 μmol/L。紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液的效應(yīng)變化和量效關(guān)系見圖3。用等效線法計(jì)算公式γ=a/A+b/B,計(jì)算得相互作用系數(shù)γ=1.16。γ>1,表明紅景天苷與特女貞苷1∶1聯(lián)合用藥時(shí),未見明顯的協(xié)同作用。

圖3 紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液的效應(yīng)變化與量效關(guān)系圖

2.2.2等輻射分析法。運(yùn)用等輻射分析法對(duì)紅景天苷與特女貞苷的相互作用進(jìn)行評(píng)價(jià),等輻射圖相加線的兩端分別為紅景天苷與特女貞苷有效增加AMB的EC50,紅景天苷和特女貞苷合用后的強(qiáng)度所在的點(diǎn)與相加線的兩個(gè)端點(diǎn)連接形成等輻射線,見圖4。混合組中相應(yīng)成分的EC50比值分?jǐn)?shù)總和為1.16,且其復(fù)合點(diǎn)落在95%可信限內(nèi)(P>0.05)(表2)。等輻射分析法結(jié)果表明,紅景天苷和特女貞苷聯(lián)合用藥呈現(xiàn)相加作用。

表2 紅景天苷與特女貞苷單用及聯(lián)合使用后對(duì)骨骼染色面積增加的EC50及95%CI

圖4 紅景天苷與特女貞苷組合使用的等輻射圖

3 討論

鐵過(guò)載與骨代謝之間的關(guān)系是近年來(lái)的研究熱點(diǎn),鐵過(guò)載產(chǎn)生大量活性氧會(huì)刺激破骨細(xì)胞分化,增加骨吸收,導(dǎo)致骨量流失;鐵過(guò)載誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致骨形成和礦化受損[25-26]。斑馬魚模型在高鐵環(huán)境下骨礦化不全,早期表達(dá)的成骨基因下降,進(jìn)而影響骨形成。鐵過(guò)載斑馬魚硬骨發(fā)育障礙,骨量減少,下調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá),從而造成骨發(fā)育遲緩[27]。通過(guò)逆轉(zhuǎn)鐵過(guò)載促進(jìn)骨形成可以成為治療PMOP的一個(gè)新方案。中藥女貞子的藥理活性研究主要集中在抗OP、PMOP的作用[28-30],女貞子所含的化學(xué)成分也顯示出良好的抗骨質(zhì)疏松活性[29],特女貞苷對(duì)破骨細(xì)胞的形成具有抑制作用,特女貞苷效應(yīng)的分子機(jī)制包括抑制NF-κB活化和下游因子c-Fos和NFATc1的水平,以及抑制JNK和p38磷酸化。因此,特女貞苷可能有助于治療破骨細(xì)胞相關(guān)的骨病[14]。紅景天苷可激活PI3K/Akt信號(hào),減輕PMOP大鼠骨組織病理?yè)p傷,提高骨礦鹽含量,改善骨生物力學(xué)[31],抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮骨細(xì)胞保護(hù)作用[16]。

本研究闡明女貞子中主要活性成分特女貞苷和紅景天苷的藥效學(xué)相互作用。目前,研究藥物間的相互作用方法較多,如等效線法、等輻射分析法和周-特氏聯(lián)合指數(shù)法等[32]。其中,等效線法和等輻射分析法是判斷藥物間相互作用的常用方法。本研究表明,紅景天苷、特女貞苷及其混合溶液對(duì)骨礦化呈濃度依賴的改善作用。藥效學(xué)相互作用評(píng)價(jià)結(jié)果顯示紅景天苷和特女貞苷呈相加作用關(guān)系。本研究為深入評(píng)價(jià)女貞子中多種活性成分之間相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ),為臨床上藥物聯(lián)合治療PMOP提供廣闊的發(fā)展空間。