富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠的影響

馬超 潘浩 崔潤之 劉振 崔路寬

河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,河北 滄州 060000

骨質(zhì)疏松癥是骨科常見的全身代謝性骨骼疾病,研究表明,骨質(zhì)疏松患者平時受到輕微的創(chuàng)傷就可能發(fā)生骨折,故骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporosis fracture,OPF)是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1-2]。眾所周知,骨折的愈合是一個復(fù)雜且相對漫長的生物學(xué)過程,OPF患者相比于正常骨折患者,更易出現(xiàn)骨折延遲愈合、甚至不愈合的情況,這對患者及其家屬、甚至是社會都造成了一定負(fù)擔(dān),因此,如何促進(jìn)骨折愈合一直是臨床亟需解決的問題[3-5]。

近年來研究發(fā)現(xiàn),松質(zhì)骨中血流下降與骨折發(fā)生率升高有關(guān),且骨折后極易伴隨血管及神經(jīng)損傷,而這也是影響骨折愈合的關(guān)鍵因素,因此無論是對骨質(zhì)疏松患者還是對OPF患者,促進(jìn)血管生成都尤為重要,其可提供更好的血供,從而改善骨組織代謝,促進(jìn)新骨形成[6]。活化T細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子c1(nuclear factorof activated T-cells cytoplasmic 1,NFATcl)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,研究發(fā)現(xiàn),其所在信號通路可參與破骨細(xì)胞形成及分化的調(diào)控,而OPF的發(fā)生與破骨細(xì)胞的過度激活密切相關(guān),由此可見NFATcl信號通路可能在OPF發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。

富血小板血漿是一種血小板濃縮制劑,所含血小板濃度是全血的4～6倍,此外還含有大量的生長因子及高濃度活性纖維蛋白,具有顯著的組織修復(fù)能力,且大量研究證實其在促進(jìn)骨折愈合方面具有顯著作用[8]。玻璃酸鈉作為關(guān)節(jié)液、關(guān)節(jié)軟骨主要成分,在維持關(guān)節(jié)生物力學(xué)、保護(hù)軟骨功能等方面具有重要作用,已被廣泛應(yīng)用骨關(guān)節(jié)炎等骨科疾病的治療,且近年來對于骨折愈合也已取得了喜人的效果[9]。但富血小板血漿及玻璃酸鈉對OPF方面的研究相對較少,因此本研究以富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨愈合、血管生成及NFATc1信號通路的影響進(jìn)行探討,以期為臨床治療提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物材料:60只SPF級SD雌性大鼠選自廣州弗爾博生物科技有限公司[合格證書:SCXK(粵)2021-0012],平均體重210～270 g,單籠喂養(yǎng),環(huán)境溫度為(21±4)℃,濕度為46%～62%,模仿12 h晝夜交替,無菌自由進(jìn)食、飲水2周,按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進(jìn)行實驗。本實驗經(jīng)過河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號:2022-0309)。

1.1.2實驗材料:富血小板血漿(貨號:PR0229,北京普非有限公司);玻璃酸鈉(貨號:AVT00001,上海艾偉拓有限公司);小動物骨密度儀(型號:RZ,上海然哲有限公司);生物力學(xué)試驗機(jī)(型號:HY-0350,上海衡翼有限公司);蘇木素染液(貨號:ZY1850,上海澤葉有限公司);伊紅染液(貨號:BL703B,杭州銘特有限公司);光學(xué)顯微鏡(型號:E100,上海普赫有限公司);酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(貨號:JEH-01,上海中喬新舟有限公司);RIPA裂解液(貨號:E-BC-R327,武漢伊萊瑞特有限公司);SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒(貨號:BM0687,上海圻明有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號:PR1711,北京普非有限公司);NFATc1抗體(貨號:XGK0377,上海西格有限公司);OSCAR抗體(貨號:GOY-01K1393,上海谷研有限公司司);GAPDH抗體(貨號:WB2197,上海威奧有限公司);ECL檢測試劑盒(貨號:KL-D3095,上海康朗有限公司)。

1.2 方法

1.2.1建模:隨機(jī)選取50只大鼠,通過腹腔注射3%戊巴比妥納麻醉大鼠,行雙側(cè)卵巢切除術(shù),術(shù)畢逐層縫合傷口,并肌肉注射5萬U青霉素鈉以預(yù)防感染。將大鼠放回籠內(nèi),常規(guī)飼養(yǎng)12周,用小動物骨密度儀檢測大鼠骨密度,若骨密度顯著低于造模前則視為骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建成功。然后經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥納麻醉大鼠,暴露左側(cè)股骨,將股骨中段橫行鋸斷,用克氏針固定后,生理鹽水沖洗,術(shù)畢逐層縫合傷口,造模過程中死亡3只,其余均建模成功。

1.2.2分組及給藥:隨機(jī)選取成功建模大鼠40只,并隨機(jī)分為模型(MO)組,富血小板血漿(PP)組,玻璃酸鈉(SH)組,富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉(PS)組,每組10只,取剩余10只健康大鼠作為正常(NO)組,對PP組骨折斷端注射0.2 mL/只富血小板血漿,對SH組骨折斷端注射10 mg/kg玻璃酸鈉,對PS組骨折斷端注射0.2 mL/只富血小板血漿及10 mg/kg玻璃酸鈉,兩組均每天給藥1次,治療2個月,NO組、MO組同期對骨折斷端注射同體積生理鹽水。

1.2.3標(biāo)本采集:實驗完成后,經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥納麻醉處死大鼠,取靜脈血,離心取上清液于無菌離心管中,在冰箱中密封保存。然后取1 cm骨折端骨痂組織用小動物骨密度儀檢測骨密度,檢測完成后,取左側(cè)股骨,用生物力學(xué)試驗機(jī)檢測骨生物力學(xué)。檢測完成后,在含4%多聚甲醛溶液中固定48 h,10%乙二胺四乙酸脫鈣14 d,進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片后,放入冰箱中密封保存。

1.2.4HE染色:取各組股骨組織,脫蠟、復(fù)水后,流水沖洗1 min,蘇木素染色30 s,流水沖洗5 min,分色、返藍(lán)處理后,流水沖洗5 min,伊紅染色3 min,PBS洗滌3次,脫水、透明、中性樹膠封片后,在光學(xué)顯微鏡下觀察,選8個視野觀察新生血管情況,收集血管面積及新生血管數(shù)。

1.2.5ELISA檢測:取各組大鼠血清,檢測血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管生成素-1(angiopoietin-1,ANG-1)等血管形成相關(guān)因子,實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作,實驗完成后,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算VEGF、bFGF、ANG-1的含量。

1.2.6免疫印跡檢測:取各組股骨組織,加入少許液氮研磨成勻漿后,加入RIPA裂解液,4 ℃搖床過夜裂解,離心取上清液,用BCA法提取細(xì)胞核蛋白,變性后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜處理,洗滌液洗滌后封閉2 h,加入稀釋的NFATc1、破骨細(xì)胞關(guān)聯(lián)受體(osteoclast associated receptor,OSCAR)一抗(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,洗膜,加入稀釋的二抗(1∶5 000),37 ℃孵育2 h,洗膜,ECL試劑盒測定結(jié)果后,計算與GAPDH比值求得NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)

采用GraphPad Prism8.0對各組大鼠骨愈合、血管生成、NFATc1信號通路相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間進(jìn)行t檢驗、多組間比較采用單因素方差分析,描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度及骨生物力學(xué)結(jié)果

與NO組相比,MO組骨密度、剛度、最大載荷、最大壓強(qiáng)、彈性模量顯著降低(P<0.05),與MO組相比,PP、SH、PS組骨密度、剛度、最大載荷、最大壓強(qiáng)、彈性模量明顯升高(P<0.05),且SH、PP組比較無明顯差異(P>0.05),PS組比SH組升高明顯(P<0.05),這說明富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可顯著改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨密度及骨生物力學(xué),見表1。

表1 各組大鼠骨密度及骨生物力學(xué)比較

2.2 各組HE染色結(jié)果

NO組股骨組織結(jié)構(gòu)正常,骨小梁生長旺盛,可見大量成熟骨組織,MO組股骨組織遭到破壞,骨小梁明顯減少,骨密質(zhì)明顯變薄,與MO組比較,PP、SH、PS組病理結(jié)構(gòu)明顯改善,骨小梁變粗變密,空骨陷窩明顯減少,這說明富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可顯著改善骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨組織病理形態(tài),見圖1。

圖1 各組大鼠骨組織HE染色(×200倍)

2.3 各組大鼠股骨組織血管生成結(jié)果

與NO組相比,MO組血管數(shù)量及血管面積明顯降低(P<0.05),與MO組相比,PP、SH、PS組血管數(shù)量及血管面積明顯升高(P<0.05),且SH、PP組比較無明顯差異(P>0.05),PS組比SH組升高明顯(P<0.05),這說明富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可顯著促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血管生成,見表2。

表2 各組大鼠股骨組織血管數(shù)量及血管面積比較

2.4 各組大鼠血清血管形成相關(guān)因子水平結(jié)果

與NO組比較,MO組血清VEGF、bFGF、ANG-1水平明顯降低(P<0.05),與MO組相比,PP、SH、PS組血清VEGF、bFGF、ANG-1水平明顯升高(P<0.05),且SH、PP組比較無明顯差異(P>0.05),PS組比SH組升高明顯(P<0.05),這說明富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可顯著促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠血管生成,見表3。

表3 各組大鼠血清中血管形成因子水平比較

2.5 各組大鼠骨組織NFATc1信號通路蛋白表達(dá)結(jié)果

與NO組比較,MO組骨組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),與MO組比較,PP、SH、PS組股骨組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),且SH、PP組比較無明顯差異(P>0.05),PS組比SH組降低明顯(P<0.05),這說明富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可顯著抑制骨質(zhì)疏松性骨折大鼠NFATc1信號通路,見表4、圖2。

圖2 各組大鼠骨組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)電泳圖

表4 各組大鼠股骨組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá)比較

3 討論

眾所周知,骨質(zhì)疏松患者骨強(qiáng)度較低,發(fā)生骨折后多為粉碎性,這使得OPF患者不僅骨愈合能力差,也極易發(fā)生內(nèi)固定松動及再骨折情況,故OPF也是患者致殘、致死的主要原因。因此,如何促進(jìn)骨折愈合、防止再骨折情況的發(fā)生是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題[10]。近年來,富血小板血漿因其制備簡單、價格低廉、安全性高的優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于臨床,在骨折治療方面也取得了令人滿意的效果。研究發(fā)現(xiàn),其可提供一種富含生長因子的微環(huán)境,從而更有利于促進(jìn)成骨、破骨細(xì)胞的增殖及遷移,進(jìn)而加快骨折的修復(fù)與重建,促進(jìn)骨愈合[11]。玻璃酸鈉是一種高分子多糖體生物材料,具有抗感染、潤滑關(guān)節(jié)、防止軟骨基質(zhì)破壞、維持骨生物力學(xué)及鎮(zhèn)痛等多種生理功能,由此可見其在治療OPF方面應(yīng)該具有一定前景[12]。通過將富血小板血漿與玻璃酸鈉聯(lián)合使用,可以起到互補(bǔ)作用,從而更利于達(dá)到促進(jìn)骨折愈合和骨重建的目的。因此,本研究選擇富血小板血漿與玻璃酸鈉聯(lián)用進(jìn)行實驗,以期為臨床提供更多治療方案。本研究發(fā)現(xiàn),富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉對OPF大鼠具有顯著療效,可顯著促進(jìn)骨折愈合。對于OPF大鼠,富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可能是通過多途徑、多功能,來促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖,抑制破骨細(xì)胞功能,從而刺激細(xì)胞有絲分裂,促進(jìn)骨基質(zhì)細(xì)胞分化,誘導(dǎo)軟骨基質(zhì)合成,進(jìn)而促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收,達(dá)到促進(jìn)骨痂生成的目的,最終有效促進(jìn)骨折愈合。黃星等[13]研究表明,對于OPF大鼠,富血小板血漿具有顯著效果,可顯著促進(jìn)骨折愈合,這與本研究結(jié)果類似。

骨折的修復(fù)和再生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程,而大量研究已經(jīng)證實,骨愈合需要血管生成過程,故促進(jìn)血管生成是促使骨折愈合的首要條件,其不僅可以參與膜內(nèi)成骨和膜外化骨,還可以保證良好的血供,為骨折愈合提供有利條件,因此如何促進(jìn)血管生成已經(jīng)成為近年來骨科領(lǐng)域關(guān)注的焦點之一[14]。VEGF、bFGF、ANG-1是促進(jìn)新生血管生成的重要因子,在血管生成中扮演著重要角色,其可調(diào)控多種信號通路,從而加速血管內(nèi)皮等細(xì)胞增殖,促進(jìn)新生血管生成,因此檢測其水平的變化可有效反映血管生成情況[15]。本研究結(jié)果表明,富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可顯著提高骨組織血管數(shù)量及血管面積,并升高血清VEGF、bFGF、ANG-1含量,這說明其可顯著促進(jìn)OPF大鼠血管生成。對于OPF大鼠,富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可能是通過提供骨折愈合所需要的生長因子及營養(yǎng),從而為組織修復(fù)提供了一個載體及框架,進(jìn)而加快VEGF、bFGF、ANG-1等促血管生成因子的分泌,加快骨質(zhì)礦化,加快細(xì)胞外基質(zhì)及纖維合成等,最終達(dá)到促進(jìn)血管生成,加快骨折愈合的目的。袁園等[16]研究發(fā)現(xiàn),富血小板血漿可促進(jìn)缺血下肢血管生成,從而促進(jìn)其血流恢復(fù),與本研究結(jié)果相似。

近年來研究發(fā)現(xiàn),破骨細(xì)胞過度激活是骨質(zhì)疏松患者易發(fā)生骨折的根本原因,其可造成骨吸收和重建的不平衡,從而導(dǎo)致骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞,進(jìn)而導(dǎo)致骨量減少,骨強(qiáng)度下降,最終導(dǎo)致骨折,因此如何抑制破骨細(xì)胞過度激活是目前臨床研究的關(guān)鍵所在[17-18]。NFATc1信號通路作為調(diào)控破骨細(xì)胞功能的網(wǎng)絡(luò)中心,其在破骨細(xì)胞形成及分化過程中發(fā)揮著極為重要的作用,因此臨床對其越來越關(guān)注及重視[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可顯著抑制股骨組織NFATc1、OSCAR蛋白表達(dá),這說明其可顯著抑制OPF大鼠NFATc1信號通路。而對于OPF大鼠,富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉可能是通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá),來介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)換,從而抑制NFATc1信號通路的激活,抑制破骨細(xì)胞活性及骨基質(zhì)降解,進(jìn)而抑制骨吸收,促進(jìn)骨形成,最終有效促進(jìn)骨愈合。王琮仁等[20]研究發(fā)現(xiàn),對于OPF大鼠,阿托伐他汀可顯著促進(jìn)骨愈合,其作用機(jī)制可能與抑制NFATc1信號通路有關(guān),這與本研究結(jié)果相似。

綜上所述,富血小板血漿聯(lián)合玻璃酸鈉對骨質(zhì)疏松性骨折大鼠具有顯著療效,可有效促進(jìn)骨愈合及血管生成,并抑制NFATc1信號通路。但本研究仍存在一定的問題,由于時間原因,未深入到細(xì)胞層面,也未進(jìn)行更多信號通路及指標(biāo)的研究。后續(xù)會逐步展開進(jìn)一步的深入研究,以期為臨床提供更多、更有利的診療依據(jù)。