微小核糖核酸-155 對肝癌細胞增殖、侵襲遷移和凋亡的影響

秦煥蓉，吳祥鍇，江哲宇，張 赟，林麗云，王黎洲，周 石

在肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）進展過程中有多種基因改變，其中微小核糖核酸（miRNA）參與細胞分化、代謝和發育等各種生物過程，在腫瘤組織中異常表達，與腫瘤發生密切相關［1-5］。研究發現，乳腺癌患者miR-155 水平升高有利于抗腫瘤免疫特征且與更好的預后相關［6］；而宮頸癌患者miR-155 水平升高與不良預后相關［7］。miR-155 在肝癌中表達上調，通過PI3K-AKT 通路抑制磷酸酶和緊張素同源物（PTEN）進而促進肝癌的進展［8］。然而miR-155 是否存在其他下游靶點影響肝癌的進展仍不清楚。本研究通過構建miR-155 沉默穩轉株以探討miR-155 對肝癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡影響的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

用含10%FBS，1%青、 鏈霉素的完全培養基培養Huh7 人肝癌細胞（中國科學院細胞庫），當細胞融合度達到85%以上時進行傳代培養，3 次傳代后待細胞狀態穩定后進行檢測。

1.2 穩轉株構建

取對數增長期的Huh7 肝癌細胞1×105個接種于6 孔板，待細胞生長至30%～40%，根據慢病毒說明書中推薦的復感染指數=5，換算最佳接種病毒滴度進行轉染操作，分別轉染shNC、sh-miR-155慢病毒，轉染16 h 后進行細胞換液。待細胞長至85%左右將細胞傳代至T25 培養瓶，3～4 d 基因表達穩定后，將細胞用胰酶消化離心傳代，細胞貼壁后用含2 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養基進行穩轉細胞株的篩選，反復藥篩。待無細胞死亡時，實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測病毒轉染效果，轉染成功后傳代凍存10 管穩轉株，以備后續實驗使用，在此過程中用含1 μg/mL 嘌呤霉素的完全培養基維持。陰性對照組為轉染空載病毒細胞（shNC），轉染抑制基因病毒（sh-miR-155）為沉默組。

1.3 RT-qPCR

將Blank、shNC、sh-miR-155 三組細胞分別取2×104個接種于6 孔板，待細胞長至90%左右，采用RNA 快速提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司）分別提取各組RNA，反轉錄試劑盒（日本TaKaRa）將RNA 反轉錄為cDNA，RT-qPCR 得到各組Ct 值。U6 作為內參，根據公式：①ΔCt=各組Ct1（miR-155）-Ct2（U6）；②ΔΔCt=各組ΔCt 值-Blank 組的ΔCt 均值；③miR-155 表達=2-ΔΔCt；④miR-155 相對表達=各組2-ΔΔCt/Blank 組2-ΔΔCt。

1.4 MTT 實驗

將Blank、shNC、sh- miR- 155、sh- miR- 155+Recilisib、shNC+Recilisib 等5 組細胞分別用胰酶消化后用完全培養基重懸，調整細胞數量為1×104個/mL。以每孔100 μL 接種于96 孔板，每組設置三個復孔，待細胞貼壁生長后，每孔加入MTT 溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT）10 μL ，繼續培養4 h，加入結晶紫溶液，放入酶標儀A490 nm 和A630 nm 處測量各孔的吸光度值。按照公式計算細胞增殖率=［A experimental group（630 nm-490 nm）/A blank group（630 nm-490 nm）］ × 100%。

1.5 Transwell 實驗

①遷移： 取各組對數生長期細胞，將細胞消化、離心后，細胞計數，每室鋪2×104個細胞，向小室下室加入含20%FBS 的高糖培養基，再輕輕向小室上室加入細胞懸液，避免出現氣泡，將培養板置于培養箱48 h 后收樣，上室細胞用棉簽擦拭，接著使用4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，用水清洗后晾干，使用倒置顯微鏡于200 倍視野下拍5 個視野。②侵襲：提前將槍頭和小室放入-20°冰箱預冷，向小室上室加入基質膠使其均勻地鋪在小室，第2 天提前半小時將小室置于無血清的培養基中水化，取各組對數生長期細胞，按每室鋪5×104個細胞計算細胞懸液量，接著向小室下室加入含20%FBS 培養基。然后將小室置于24 孔板內，每孔加入無血清細胞懸液到小室上室中，細胞生長48 h 后，棄去培養基，用棉簽輕輕擦拭干凈上室中的基質膠，下室加入1 mL 多聚甲醛固定約30 min，然后用0.1%結晶紫浸泡20 min，PBS 涮洗3 遍，晾干后將24 孔板置于200 倍顯微鏡下選取5 個視野拍照并計數。

1.6 流式細胞術

將各組細胞消化、離心后，計數并調整細胞為2×105個/mL，培養體系為2 mL 接種于6 孔板，培養箱培養24 h，離心收取細胞沉淀，按照試劑盒說明書依次加入Annexin V-APC/PI 結合液，Annexin V-APC 和PI 染液混勻，輕輕吹打重懸細胞，室溫孵育10～15 min，加入預冷PBS 混勻，上機檢測各組細胞凋亡情況。

1.7 雙熒光素酶實驗

為了檢測PTPN21 與miR-155 結合，取對數生長期293T 細胞，將其隨機分為轉染miR-155模擬物組（mimicNC 組）和轉染miR-155 抑制劑組（miR-155-3p mimic 組），細胞計數，計算細胞密度為5×104個/mL 所需細胞懸液量，分別接種至48 孔細胞培養板，每個濃度梯度3 個復孔。制備轉染復合物，轉染后48 h，收集細胞檢測各組熒光素酶活性，取樣品20 μL，加入100 μL 熒光素酶檢測試劑測得相對光單位1（RLU1），完成后，加入100 μL 海腎熒光素酶檢測試劑測得相對光單位2（RLU2）。目的基因的激活程度=RLU1/RLU2。

1.8 蛋白質印跡實驗

胰酶消化細胞獲得細胞沉淀，向Western 及IP裂解液中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑（Western 及IP 裂解液∶酶抑制劑=100∶1）。在冰上充分裂解30 min，每5 min 震蕩1 次，超聲破碎后通過高速離心機（12 000 r，15 min）獲得蛋白上清液，并使用BCA 試劑盒（索萊寶）配合酶標儀在562 nm 波長條件下測量細胞的蛋白濃度。在60 V（30 min）和110 V （1 h）下，采用一步法聚丙烯酰胺凝膠快速制備試劑盒（10%）（上海雅酶生物醫藥科技有限公司）凝膠電泳分離蛋白。電泳后，在4℃冷室中用濕電轉移法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（德國Amersham 公司）上。然后，將PVDF 膜用5%脫脂牛奶密封，室溫孵育2 h，一抗在4℃孵育過夜。次日用含0.1%Tween-20 的Tris 緩沖鹽溶液（TBST）洗滌3 次，加入羊抗兔IgG 二抗，室溫孵育2 h，再次用TBST 洗滌3 次，將膜用ECL 曝光液浸泡在暗盒里孵育30 s左右放入凝膠成像系統中，最后再將條帶導入Image J 軟件進行各組蛋白表達水平灰度分析。

1.9 統計學分析

采用SPSS 26.0 統計軟件分析實驗數據。正態分布的計量資料以表示，多組資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。折線圖及柱狀圖通過GraphPad 8.0 軟件制作。

2 結果

2.1 shNC 和sh-miR-155 轉染Huh7 人肝癌細胞

RT-qPCR 檢驗轉染效果，sh-miR-155 組中miR-155 的表達水平顯著低于Blank 組及shNC 組（P＜0.000 1），miR-155 在Blank 組及shNC 組表達水平差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 轉染shNC、sh-miR-155 后熒光圖及其轉染效率

2.2 miR-155 靶向調控PTPN21 的表達

根據microRNA 靶基因預測在線數據庫（http：//www.targetscan.org/vert_70/）（http：//mirwalk.umm.uniheidelberg.de/）和（http：//mirdb.org/miRDB/）預測PTPN21 基因3' 非翻譯區（PTPN21-3'-UTR）上存在與miR-155 的潛在靶向結合點。雙熒光素酶實驗結果顯示，miR-155-3p 與PTPN21 有2 個結合位點，2 個位點分別設計PTPN21- 3'UTR 突變序列（PTPN21-3'UTR MUT-1）和（PTPN21-3'UTR MUT-2）。miR-155-3p 可以和PTPN21-3'UTR 野生型（PTPN21-3'UTR WT）結合使雙熒光素酶活性增強，MUT-1 位點突變后雙熒光素酶的活性也增強，說明該位點不是結合位點； 而MUT-2 位點突變后雙熒光素酶活性沒有變化，說明該位點是結合位點。通過雙熒光素酶實驗得出：miR-155-3p 可與PTPN21 結合，且結合位點是MUT-2 對應的序列，見圖2。

圖2 雙熒光素酶實驗檢測miR-155 與PTPN21 的關系

2.3 沉默miR-155 抑制肝癌細胞的增殖

MTT 結果顯示，sh-miR-155 組中Huh7 細胞在2、3、4、5 d 時A 值均低于Blank 組及shNC 組（P＜0.000 1），而Blank 組與shNC 組差異無統計學意義（P＞0.05）；sh-miR-155 組在2、3、4、5 d 時A 值低于sh-miR-155+Recilisib 組及shNC+Recilisib 組（P=0.005 2，P＜0.000 1），而sh-miR-155+Recilisib 在2、3、4、5 d 時A 值低于shNC+Recilisib 組（P＜0.000 1），見圖3。

圖3 MTT 檢測各組細胞增殖能力（**** 與Blank 組相比，P＜0.000 1）

2.4 沉默miR-155 抑制肝癌細胞的遷移和侵襲

Blank 組與shNC 組遷移及侵襲細胞數差異無統計學意義（P＞0.05），在激活PI3K-AKT 信號通路后，與Blank 組相比，shNC+Recilisib 組肝癌細胞的遷移、侵襲能力顯著增加（P＜0.000 1）。相反，沉默miR-155 后Huh7 細胞的遷移及侵襲細胞數明顯低于Blank 組及shNC 組（P＜0.000 1），而PI3K 激動劑逆轉了這一現象，與sh-miR-155 組相比，sh-miR-155+Recilisib 組肝癌細胞的遷移、 侵襲能力增強（P=0.000 2），見圖4。

圖4 Transwell 檢測各組細胞侵襲及遷移能力

2.5 敲低miR-155 促進肝癌細胞的凋亡

流式細胞術結果顯示，Blank 組、shNC 和shNC+Recilisib 組之間細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）。與Blank 組相比，sh-miR-155 組細胞凋亡率顯著增加（P＜0.000 1），并且sh-miR-155 組細胞凋亡率高于sh-miR-155+Recilisib 組（P＜0.000 1），見圖5。

圖5 各組肝癌細胞流式細胞術圖及凋亡分析柱狀圖（與Blank 組相比，ns：P＞0.05；****：P＜0.000 1）

2.6 miR-155 對PTPN21、PI3K-AKT 信號通路及凋亡相關蛋白的影響

蛋白印跡實驗結果顯示，與Blank 組相比，沉默miR-155 后促凋亡蛋白Caspase-3 和BAX 表達水平顯著增加（P＜0.000 1），而抗凋亡蛋白BCL2 的表達量明顯降低（P＜0.000 1）； 此外，sh-miR-155 組與Blank 組相比PTPN21 表達明顯下調（P＜0.000 1），而在PI3K-AKT 信號通路激活時PTPN21 表達較shmiR-155 組高（P＜0.000 1），但sh-miR-155+Recilisib組PTPN21 表達仍低于Blank 組（P=0.000 2）；與Blank組相比，在沉默miR-155 后P-AKT 和P-PI3K 的表達顯著下降（P＜0.000 1），且sh-miR-155+Recilisib 組P-AKT 和P-PI3K 表達也較Blank 組低（P=0.017 7，P=0.031 3），而sh-miR-155+Recilisib 組P-AKT和P-PI3K 表達較sh-miR-155 組高（P＜0.000 1，P=0.001 4），PI3K 與AKT 在各組肝癌細胞之間的差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6。

圖6 蛋白質印跡檢測PTPN21、PI3K-AKT 信號通路及凋亡相關蛋白

3 討論

研究表明，miRNA 與腫瘤的發生有密切關系，致癌相關miRNA 的過表達通過沉默腫瘤抑制因子或參與細胞分化中的某一過程，最終影響腫瘤組織血管生成、增殖及侵襲水平導致腫瘤形成［9-11］。miR-155 作為一類癌癥相關miRNA，在各種腫瘤細胞中表達量增加，如胃癌、膀胱癌、結直腸癌、乳腺癌和其他實性惡性腫瘤，并發揮不同的作用［12］。此外，miR-155 在肝癌中高表達，并與HCC 患者不良的臨床病理特征和較低生存率相關［13］。本研究通過構建miR-155 沉默穩轉株，探討下調miR-155 后對肝癌細胞增殖和侵襲遷移影響的機制。

PTPN21 在肺癌［14］、膀胱腫瘤［15］及非霍奇金淋巴瘤［16］中高表達，同時參與腫瘤細胞的生長過程，但其在肝癌中的作用機制尚不明確。本研究發現，PTPN21 基因3'-UTR 上存在與miR-155 相結合的潛在靶點。雙熒光素酶實驗結果顯示，miR-155-3p與PTPN21 有2 個結合位點，2 個位點分別設計突變序列MUT-1 和MUT-2，MUT-1 位點突變后雙熒光素酶的活性增強，而MUT-2 位點突變后雙熒光素酶活性沒有變化，說明MUT-2 是結合位點，并且miR-155 沉默可以抑制PTPN21 的表達，提示PTPN21 是miR-155 的下游靶點。

PI3K-AKT 通路是調控細胞生長、代謝、增殖、存活、轉錄和蛋白質合成的關鍵調控中心［17］。研究表明，miRNA 在調控PI3K-AKT 通路中發揮著至關重要的作用，其通過靶向PI3K-AKT 信號軸，在調節細胞增殖、凋亡和代謝方面具有重要意義［18-19］。本研究發現下調miR-155 后，各組PI3K、AKT 總蛋白變化不明顯，而磷酸化蛋白P-PI3K、P-AKT 表達量明顯下降，提示miR-155 的表達與PI3K-AKT 通路呈正相關。為了進一步驗證miR-155 對肝癌細胞生長影響是通過PI3K-AKT 通路實現的，本實驗在shNC組及沉默miR-155 的同時應用PI3K-AKT 通路激動劑，觀察PI3K-AKT 通路相關蛋白的變化情況，結果顯示，與shNC+Recilisib 組相比，miR-155 可抑制P-PI3K 及P-AKT 的表達，提示miR-155 可通過調控PI3K-AKT 通路影響HCC 生長。MTT 實驗發現，沉默miR-155 可抑制肝癌細胞的增殖。此外，流式細胞術結果顯示，與Blank 組及shNC 組相比，shmiR-155 組細胞凋亡率顯著增加，Blank 組和shNC組細胞凋亡量無顯著變化，差異無統計學意義。細胞凋亡常與多個信號傳導通路密切相關，其中BCL-2及Caspase 家族蛋白扮演著重要角色，當細胞進入凋亡途徑時，抑凋亡蛋白BCL-2 表達水平下調，而促凋亡蛋白BAX 表達上調，其下游Caspase 家族蛋白接受凋亡信號，進而激活Caspase-3 活化，執行凋亡程序［20］。本研究結果顯示，sh-miR-155 組與Blank組及shNC 組相比，抑凋亡蛋白BCL-2 表達水平顯著降低，促凋亡蛋白Caspase-3 及BAX 表達水平顯著提高，加速了肝癌細胞凋亡進程。

有研究表明，沉默PTPN21 通過調控PI3K-AKT信號通路抑制膠質瘤的進展［21］。本研究中，Transwell結果顯示，沉默miR-155 明顯抑制肝癌細胞侵襲及遷移。以上實驗表明，miR-155 通過靶向PTPN21 調控PI3K-AKT 信號通路，進而影響肝癌細胞生長，提示miR-155 在肝癌發生發展過程中發揮促癌基因的作用。

綜上所述，沉默Huh7 細胞中miR-155 通過靶向PTPN21 調控PI3K-AKT 信號通路抑制肝癌細胞生長。因此，miR-155 可能是未來HCC 患者的輔助診斷指標之一，也為臨床治療HCC 患者提供了新的治療靶點。