雨生紅球藻鈣依賴(lài)蛋白激酶（CDPK）家族鑒定與表達(dá)分析

李亞男 張豪杰 梁夢(mèng)靜 羅濤 李旺寧 張春輝 季春麗 李潤(rùn)植薛金愛(ài) 崔紅利，2

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷 030801；2.中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264003）

鈣離子（Ca2+）是植物體內(nèi)普遍存在的第二信使，通過(guò)瞬時(shí)改變植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的Ca2+濃度，以及對(duì)外界環(huán)境刺激的反應(yīng)，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用［1-3］。在植物受到脅迫時(shí)，一些鈣感受器或鈣結(jié)合蛋白可以感知鈣離子濃度的變化并識(shí)別鈣信號(hào)，然后將其轉(zhuǎn)導(dǎo)到一系列下游反應(yīng)，以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫損傷，提高自身抗性［4-5］。迄今已在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種鈣結(jié)合蛋白，如鈣調(diào)素（calmodulin,CaM）、類(lèi)鈣調(diào)神經(jīng)素B 亞基蛋白（calcineurin B-like proteins,CBLs）和鈣依賴(lài)蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases,CDPKs 或CPKs）等［6］。

CDPK 是獨(dú)特的新型Ca2+傳感器。與其他已知的Ca2+傳感器相比，它具有一個(gè)催化功能的Ser/Thr激酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)類(lèi)鈣調(diào)素結(jié)合域（能結(jié)合鈣的EF-hand 基序）。因此，CDPK 同時(shí)具有Ca2+結(jié)合活性和激酶活性，能夠直接結(jié)合Ca2+，將鈣信號(hào)轉(zhuǎn)化為下游的磷酸化信號(hào)［7-8］。典型的CDPK 蛋白結(jié)構(gòu)主要由N 端可變區(qū)、Ser/Thr 激酶域、自抑制域（連接域）以及類(lèi)鈣調(diào)素結(jié)合域組成［6,9-10］。N 端可變區(qū)具有肉豆蔻酰化和棕櫚酰化位點(diǎn)，對(duì)CDPK 的亞細(xì)胞定位及調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育十分重要［11］。自抑制結(jié)構(gòu)域與激酶域相鄰，作為假底物與其結(jié)合，以使CDPK 失活［12］。目前已在萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）［13］、擬南芥（Arabidopsis thaliana）［6］、煙 草（Nicotiana tabacum）［14］、水 稻（Oryza sativa）［15］、番茄（Solanum lycopersicum）［16］、玉米（Zea mays）［17］等中發(fā)現(xiàn)CDPK。

作為Ca2+的直接“傳感器”，CDPK 在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和各種脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。擬南芥Atcpk1 突變體表現(xiàn)出對(duì)鹽和干旱脅迫敏感，而其過(guò)表達(dá)株可顯著增強(qiáng)對(duì)鹽/干旱的抗性［18］。AtCDPK1 和AtCDPK2 基因在高鹽脅迫下快速上調(diào)表達(dá)，但在低溫下不受影響［19］。AtCDPK4/5/6/11 可以調(diào)節(jié)MAMP 或PAMP 觸發(fā)的免疫反應(yīng)，并磷酸化轉(zhuǎn)錄因子WRKY 以調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)［20］。過(guò)表達(dá)OsCDPK7 可通過(guò)上調(diào)一些脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)植物對(duì)鹽堿或干旱的耐受性，但不參與冷脅迫響應(yīng)。在萊茵衣藻中，大多數(shù)CDPK 基因在缺氮和鹽脅迫下顯著誘導(dǎo)，其中有6 個(gè)CrCDPK 基因在萊茵衣藻缺氮脅迫下的油脂積累中發(fā)揮積極作用［13］。大量研究表明，來(lái)自不同植物的CDPK 數(shù)量不同且具有功能多樣性。目前，關(guān)于藻類(lèi)CDPK 基因家族鑒定及其生物學(xué)功能研究較少，有待進(jìn)一步解析。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種具有雙鞭毛的單細(xì)胞淡水綠藻，是目前已知天然蝦青素含量最高的生物，可在逆境條件下大量積累蝦青素［21］。蝦青素作為一種高價(jià)值的酮類(lèi)胡蘿卜素，具有很強(qiáng)的抗氧化能力，已廣泛應(yīng)用于食品、制藥和化妝品等領(lǐng)域［22-23］。溫度、光照和營(yíng)養(yǎng)鹽等非生物脅迫可促進(jìn)雨生紅球藻合成積累大量蝦青素［24］。干旱、鹽分和低溫等非生物脅迫都會(huì)引起植物細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化，進(jìn)而誘導(dǎo)下游信號(hào)的傳遞途徑［25］。CDPK 可迅速感受瞬時(shí)Ca2+信號(hào)的變化，識(shí)別并磷酸化特異性底物后，引發(fā)各種生理反應(yīng)，從而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)多種脅迫的響應(yīng)。而雨生紅球藻在非生物脅迫下，CDPK 的轉(zhuǎn)錄水平如何？具有怎樣的功能？是否參與蝦青素等類(lèi)胡蘿卜素代謝的調(diào)控？回答這些問(wèn)題有助于深入解析CDPK 基因參與雨生紅球藻脅迫應(yīng)答和蝦青素的合成機(jī)制，以及建立優(yōu)化的雨生紅球藻培養(yǎng)體系，高效生產(chǎn)蝦青素。

基于雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，本研究擬對(duì)雨生紅球藻HpCDPK 基因家族進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步檢測(cè)UV-B、高白光、高藍(lán)光和α-酮戊二酸處理?xiàng)l件下HpCDPK 各成員的表達(dá)譜，以期為深入解析雨生紅球藻HpCDPK 基因的生物學(xué)功能，尤其是介導(dǎo)雨生紅球藻生長(zhǎng)發(fā)育及蝦青素生物合成積累的分子機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用藻株為雨生紅球藻［Haematococcus pluvialis（Flotow,1844）］藻株,現(xiàn)存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。

1.2 方法

1.2.1 雨生紅球藻CDPK 基因家族成員鑒定及基本參數(shù)分析 雨生紅球藻氨基酸序列來(lái)自本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。從Phytozome v13（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）下載擬南芥和萊茵衣藻CDPK 蛋白序列，與雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組中對(duì)應(yīng)的蛋白序列進(jìn)行同源比對(duì)，篩選雨生紅球藻中的CDPK 蛋白，其中同源比對(duì)E 值的閾值設(shè)置為1e-5。利用Interpro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）網(wǎng)站中 的search 命令檢測(cè)雨生紅球藻蛋白序列中同時(shí)包含Pkinase 結(jié)構(gòu)域和EF-hand 基序的序列。對(duì)Interpro 序列比對(duì)的結(jié)果進(jìn)行篩選。綜合以上結(jié)果，使用SMART 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://smart.embl-heidelberg.de）對(duì)所含結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證。利用在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié) 構(gòu)。利 用ExPASy Proteomics Server（http：//cn.expasy.org/tools）分析雨生紅球藻CDPK 蛋白序列的長(zhǎng)度、等電點(diǎn)、分子質(zhì)量等參數(shù)。肉豆蔻酰化位點(diǎn)由ExPASy 中 的Myristoylator 程 序預(yù)測(cè)（http://web.expasy.org/myristoylator/）。棕櫚酰化位點(diǎn)通過(guò)CSSPALM 4.0（http://csspalm.biocuckoo.org/）預(yù) 測(cè)。利用在線工具CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）和Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml）預(yù)測(cè)雨生紅球藻HpCDPK 的亞細(xì)胞定位。

1.2.2 雨生紅球藻CDPK 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用MEGA7 軟件中的 Clustal W 對(duì)鑒定所得雨生紅球藻CDPK 蛋白序列與擬南芥、萊茵衣藻的CDPK 蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。基于序列比對(duì)結(jié)果，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中bootstrap 值設(shè)定為1 000。

1.2.3 雨生紅球藻CDPK 蛋白的保守基序和功能結(jié)構(gòu)域分析 利用在線網(wǎng)站MEME Suite v 5.5.0（https://meme-suite.org）預(yù)測(cè)雨生紅球藻CDPK 基因家族成員蛋白序列中的保守基序（motif），其中motif 的最大數(shù)量設(shè)為15，最優(yōu)的motif 寬度為10-100 個(gè)氨基酸，其余參數(shù)為默認(rèn)數(shù)值。利用SMART 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://smart.emblheidelberg.de/）分析各CDPK 蛋白中的功能結(jié)構(gòu)域。并利用TBtools（https://github.com/CJ-Chen/TBtools）將雨生紅球藻 CDPK 基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和保守基序數(shù)據(jù)進(jìn)行合并。

1.2.4 雨生紅球藻CDPK 基因表達(dá)特性分析 高藍(lán)光和高白光處理組：所用培養(yǎng)基為BG11，在光強(qiáng)25 μmol/（m2·s）（LED 白光）、溫度（22.5±1）℃、光/暗周期（12 h/12 h）的條件下靜置培養(yǎng)，每8 h 搖1 次。將對(duì)數(shù)期雨生紅球藻在黑暗環(huán)境下處理24 h，經(jīng)離心（5 000 r/min，4℃，5 min）收集，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，分別于正常培養(yǎng)（N,25 μmol/（m2·s））、高白光（W,500 μmol/（m2·s））和高藍(lán)光（B,500 μmol/（m2·s））條件下處理72 h。最后離心收藻，將樣品于液氮速凍后存于-80℃，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序［26］。

UV-B 處理組：采用 MCM 培養(yǎng)基培養(yǎng)藻細(xì)胞，培養(yǎng)條件為：光強(qiáng)為25 μmol/（m2·s）、溫度 25℃、光暗比為12 h/12 h，靜置培養(yǎng)，每天手搖2-3 次。使用 Philips TL20W/01RS 窄帶 UV-B 燈管（15 W）提供UV-B 光源，通過(guò)移動(dòng)錐形瓶與紫外燈的距離調(diào)節(jié)強(qiáng)度，光強(qiáng)使用勒克斯計(jì)測(cè)量，在試驗(yàn)前連續(xù)照射24 h 使系統(tǒng)穩(wěn)定［27］。離心收集正常光照組（L,25 μmol/（m2·s））、低UV-B 輻射組（LU200,200 W）、高UV-B 輻射組（LU400,400 W）以及對(duì)應(yīng)的黑暗條件下處理組（D）、低UV-B 輻射組（DU200,200 W）、高UV-B 輻射組（DU400,400 W）培養(yǎng)的雨生紅球藻藻株經(jīng)液氮速凍后存于-80℃，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid,OG）處理組：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻以5 000 r/min 離心5 min，收集藻細(xì)胞，然后重新懸浮在正常培養(yǎng)基和缺氮培養(yǎng)基中，缺氮（ND）培養(yǎng)基為不添加硝酸鈉的BG11 培養(yǎng)基。對(duì)照為高光處理（CK），光照強(qiáng)度為270 μmol/（m2·s）。OG 濃度設(shè)置為10.0 mg/L。離心收集CK、OG、ND 和ND-OG 組培養(yǎng)的雨生紅球藻藻株經(jīng)液氮速凍后存于-80℃，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。

1.2.5 雨生紅球藻HpCDPK 基因與類(lèi)胡蘿卜素合成基因的共表達(dá)分析 為預(yù)測(cè)HpCDPK2、HpCDPK3和HpCDPK5 的功能，使用從轉(zhuǎn)錄組中鑒定的類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因，包括AACT、HMGS、MVD、IDI、DXS、DXR、CMT、CMK、MDS、HDS、HDR、GGPS、PSY、PDS、Z-ISO、ZDS、CRTISO、LYCB、LYCE、BKT、BCH、CYP97A、CYP97B、CYP97C、ZEP、VDE 和NCED/CCD。結(jié)合熱圖分析中使用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用GraphPad Prism 9.0 中的ggcor 函數(shù)和默認(rèn)的Pearson 相關(guān)系數(shù)計(jì)算HpCDPK 與類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 雨生紅球藻CDPK基因及編碼蛋白的基本信息

以擬南芥和萊茵衣藻CDPK 蛋白序列作為查詢(xún)序列，通過(guò)BlastP 程序從雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組中檢索到候選CDPK 蛋白序列。通過(guò)SMART 和序列比對(duì)驗(yàn)證后，總共有7個(gè)非冗余的HpCDPK基因被鑒定，并命名為HpCDPK1-HpCDPK7（表1）。這些HpCDPK基因編碼氨基酸長(zhǎng)度主要集中在478-1 479 aa，所編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小在53 280.35-153 784.74 Da之間，等電點(diǎn)變化區(qū)間為5.71-7.29，其中除HpCDPK6 蛋白等電點(diǎn)大于7 顯堿性，其余6 個(gè)蛋白等電點(diǎn)小于7 顯酸性。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HpCDPK 蛋白主要由α 螺旋組成（圖1）。在鑒定的7 個(gè)HpCDPK 中僅HpCDPK7 預(yù)測(cè)到在N 末端有肉豆蔻化基序。利用CELLO（http://cello.life.nctu.edu.tw/）和Softberry（http://linux1.softberry.com/berry.phtml）預(yù)測(cè)HpCDPK 蛋白亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，HpCDPK1、3、4 均定位于細(xì)胞質(zhì)，該定位更易識(shí)別Ca2+內(nèi)流信號(hào)。

圖1 雨生紅球藻CDPK 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of tertiary structures of CDPK proteins in H.pluvialis

表1 雨生紅球藻CDPK 基因家族成員信息Table 1 Members of CDPK gene family in H.pluvialis

2.2 雨生紅球藻CDPK基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了剖析CDPK 基因家族成員的進(jìn)化關(guān)系，我們使用雙子葉模式植物擬南芥、單細(xì)胞模式生物萊茵衣藻和雨生紅球藻CDPK 基因家族成員構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，這56 個(gè)成員可分為4 組（圖2）。第1組成員最多，包含了31 個(gè)AtCDPK，皆為擬南芥成員。第2 組包括4 個(gè)CrCDPK 和2 個(gè)HpCDPK。第3組是由AtCDPK18、AtCDPK16和AtCDPK28聚集而成。第4 組則是由11 個(gè)CrCDPK 和5 個(gè)HpCDPK 組成。此外，雨生紅球藻CDPK 基因家族成員與高等植物擬南芥的AtCDPK 基因家族成員進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與同為低等植物的萊茵衣藻CrCDPK 基因家族成員親緣關(guān)系較近。

圖2 雨生紅球藻、萊茵衣藻和擬南芥CDPK 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of CDPK genes in H.pluvialis,C.reinhardtii and A.thaliana

2.3 雨生紅球藻CDPK蛋白特征分析

保守基序（motif）是同源蛋白中的潛在功能區(qū)。為了研究HpCDPK 的蛋白結(jié)構(gòu)和功能多樣性，我們使用全長(zhǎng)的HpCDPK 蛋白序列構(gòu)建了一個(gè)單獨(dú)的無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并將其與相應(yīng)基因序列的保守基序和結(jié)構(gòu)域組合進(jìn)行了比較分析（表1 和圖3）。利用在線MEME 工具分析獲得HpCDPK 蛋白中最保守的9 個(gè)基序（圖4），以此幫助我們研究它們的功能。無(wú)根系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，HpCDPK 大致分為3 個(gè)主要亞組。motif7、motif2、motif3、motif1、motif4 為蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域序列在不同物種間的同源性較高；motif5、motif8 和motif6 為EF-hand 基序，其可分為N 端和C 端兩部分，且C 端的鈣親和力高于N 端（圖3，5 和6）。基序分析結(jié)果表明，每個(gè)亞群內(nèi)部保守的基序結(jié)構(gòu)支持它們之間密切的進(jìn)化關(guān)系，但不同亞群之間可能存在功能上的差異。此外，使用Interpro 和SMART 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)和序列比對(duì)預(yù)測(cè)了HpCDPK 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（圖3-6）。結(jié)果表明，本研究鑒定的所有CDPK 都具有4 個(gè)特征結(jié)構(gòu)，即一個(gè)可變的N-末端結(jié)構(gòu)域，一個(gè)催化Ser/Thr 蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，一個(gè)自抑制區(qū)和一個(gè)類(lèi)鈣調(diào)素結(jié)合域。此外，對(duì)HpCDPK 的保守結(jié)構(gòu)域和重要位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，7 個(gè)HpCDPK 蛋白中，僅有HpCDPK1 具有C2 保守結(jié)構(gòu)域。在激酶保守結(jié)構(gòu)區(qū)域，所有HpCDPK 具有Ser/Thr 活性位點(diǎn)；除HpCDPK5 外，其余蛋白都含有激酶ATP 結(jié)合位點(diǎn)。此外，在EF 手型保守區(qū)域，7 個(gè)HpCDPK 都含有Ca2+結(jié)合位點(diǎn)，但各蛋白所含Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量不同（圖7）。

圖3 雨生紅球藻HpCDPK 家族成員的保守基序和功能結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved motif and functional domain of HpCDPK family members of H.pluvialis

圖4 MEME 預(yù)測(cè)的雨生紅球藻HpCDPK 保守基序Fig.4 Conserved motifs of HpCDPKs in H.pluvialis predicted by MEME

圖5 雨生紅球藻HpCDPK 蛋白保守PDK 結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)Fig.5 Multiple sequence alignments of conserved PDK domains of HpCDPK proteins in H.pluvialis

圖6 雨生紅球藻HpCDPK 蛋白保守EF 基序的多序列比對(duì)Fig.6 Multiple sequence alignments of conserved EF motifs of HpCDPK proteins in H.pluvialis

圖7 雨生紅球藻HpCDPK 的保守結(jié)構(gòu)域和重要位點(diǎn)分析Fig.7 Conserved domain and important site analysis of HpCDPKs in H.pluvialis

2.4 雨生紅球藻CDPK基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式

為研究HpCDPK 基因是否在雨生紅球藻脅迫響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮功能，我們檢測(cè)3 種不同脅迫下雨生紅球藻HpCDPK 基因的表達(dá)模式。在正常培養(yǎng)條件（N）下（圖8-A），雨生紅球藻HpCDPK 基因均表達(dá)，且HpCDPK1 表達(dá)量最高。在高白光和高藍(lán)光處理下，HpCDPK1 和HpCDPK6 表達(dá)量均顯著降低，而且HpCDPK1 表達(dá)量減少幅度遠(yuǎn)低于HpCDPK6。

圖8 雨生紅球藻HpCDPK 基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式Fig.8 Expression patterns of HpCDPK genes in H.pluvialis in response to abiotic stresses

在正常光照條件下（圖8-B），UV-B（200 W 和400 W）處理的雨生紅球藻HpCDPK2 和HpCDPK5基因的表達(dá)量均提高；HpCDPK3 在UV-B（200 W）輻射時(shí)上調(diào)，當(dāng)UV-B 輻射增至400 W 時(shí)HpCDPK3的表達(dá)量下調(diào)。在黑暗條件進(jìn)行UV-B（200 W和400 W）處理下，HpCDPK3 的表達(dá) 量下調(diào)，HpCDPK5 的表達(dá)量均上調(diào)；HpCDPK2 在UV-B（200 W）和UV-B（400 W）輻射時(shí)表達(dá)量均上調(diào)。

在高光條件（CK）下（圖8-C），HpCDPK3 的基因表達(dá)量最高，HpCDPK5 的表達(dá)量最低。與CK相比，在OG、ND 和ND-OG 條件下，HpCDPK6 的表達(dá)量均下調(diào)；HpCDPK1、HpCDPK2、HpCDPK4、HpCDPK5 和HpCDPK7 的表達(dá)量均差異性上調(diào)，且在ND 和ND-OG 條件下的基因表達(dá)量高于OG 條件下的基因表達(dá)量，但其基因表達(dá)量在ND 和ND-OG條件下差異不顯著。此外，在ND 和ND-OG 條件下，HpCDPK3、HpCDPK5 和HpCDPK6 的表達(dá)量差異同樣不明顯。

2.5 HpCDPK基因與類(lèi)胡蘿卜素及蝦青素合成基因表達(dá)量的相關(guān)性分析

有研究表明，在UV-B 脅迫條件下可顯著誘導(dǎo)雨生紅球藻蝦青素積累。為了探索HpCDPK 是否參與蝦青素合成積累的調(diào)控，我們根據(jù)課題組已有的UV-B 誘導(dǎo)條件下雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)不同強(qiáng)度UV-B 誘導(dǎo)處理下的雨生紅球藻中HpCDPK2、HpCDPK3 和HpCDPK5 與蝦青素合成及積累的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，HpCDPK2、HpCDPK3 和HpCDPK5 與蝦青素合成通路基因表達(dá)高度相關(guān)，暗示HpCDPK 可能介導(dǎo)雨生紅球藻蝦青素生物合成（圖9）。進(jìn)一步相關(guān)性分析（圖10）顯示，HpCDPK2 與蝦青素合成關(guān)鍵基因PSY、BCH 和BKT 和類(lèi)胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因Z-ISO（圖10-A、C、D 和B）轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。HpCDPK3 與類(lèi)胡蘿卜素合成基因關(guān)鍵基因ZDS、CYP97B 和HMGS（圖10-E、F 和H）轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)（P＜0.05）；而與其降解基因NCED/CCD（圖10-G）轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。HpCDPK5 與類(lèi)胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因DXS、DXR 和LYCB 以及其降解基因NCED/CCD（圖10-I、J、L 和K）轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。由此推測(cè)HpCDPK 可能在UV-B 條件下參與蝦青素生物合成的調(diào)控，亦可能在類(lèi)胡蘿卜素的積累中發(fā)揮類(lèi)似功能，具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖9 HpCDPK 基因與蝦青素合成及積累基因的表達(dá)量相關(guān)性分析Fig.9 Correlation between HpCDPKs and gene expressions for astaxanthin synthesis and accumulation

圖10 HpCDPK2、HpCDPK3 和HpCDPK5 基因與類(lèi)胡蘿卜素及蝦青素合成及積累基因的表達(dá)量相關(guān)性Fig.10 Correlation between HpCDPK2,HpCDPK3,HpCDPK5 genes and gene expressions for the biosynthesis and accumulation of carotenoid and astaxanthin

3 討論

CDPK 激酶在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用［10］。目前已在多種植物中闡明其生物學(xué)功能。雨生紅球藻作為高效積累天然蝦青素的優(yōu)異種質(zhì)，其CDPK 成員能否參與脅迫條件誘導(dǎo)蝦青素合成的調(diào)控尚不清楚。本研究共鑒定7 個(gè)HpCDPK家族成員。通過(guò)與擬南芥和萊茵衣藻CDPK 成員比對(duì)與進(jìn)化分析，分為4 組。其中HpCDPK 與來(lái)自萊茵衣藻的CDPK 聚為一類(lèi)，與高等植物（擬南芥）來(lái)源的AtCDPK 明顯分開(kāi)，形成兩個(gè)姐妹分枝，暗示在進(jìn)化過(guò)程中具有種屬特異性［13］。

N-肉豆蔻酰化修飾賦予蛋白靈活可變的膜結(jié)合能力，對(duì)蛋白的膜靶向尤為重要［28-29］。CDPK 具有N-肉豆蔻酰化基序，暗示定位在質(zhì)膜，在胞膜結(jié)合和鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用［1,30-32］。在本研究中，僅有HpCDPK7 預(yù)測(cè)含有N-肉豆蔻酰化基序，但亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示在線粒體。研究表明玉米ZmCK1 含有 N 末端肉豆蔻酰化基序，但ZmCK1:hGFP 融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核［33］。CDPK 蛋白的亞細(xì)胞定位還可能受到其他因素影響，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

蛋白激酶結(jié)構(gòu)域能將核苷三磷酸（ATP）的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)側(cè)鏈，導(dǎo)致構(gòu)象變化進(jìn)而影響其功能［34］。因此，含有ATP 結(jié)合位點(diǎn)的HpCDPK 成員可以利用ATP 作為磷酸基團(tuán)的來(lái)源，以此來(lái)磷酸化靶底物［35］。盡管蛋白激酶結(jié)構(gòu)域非常保守，但不同成員間的ATP 結(jié)合位點(diǎn)和Ser/Thr 蛋白激酶活性位點(diǎn)序列存在著大量的變異。例如，HpCDPK3 的激酶ATP 結(jié)合位點(diǎn)序列與其他成員此位點(diǎn)序列相比較短，HpCDPK5 不具有激酶ATP 結(jié)合位點(diǎn)序列。這可能是因?yàn)槠浔Ｊ匦暂^低導(dǎo)致的，也可能是不同成員功能差異性所在。

為探究HpCDPK 是否參與雨生紅球藻脅迫響應(yīng)，我們檢測(cè)了3 種不同脅迫下雨生紅球藻HpCDPK 基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，HpCDPK1 和HpCDPK6基因表達(dá)受到光條件的影響，但HpCDPK1 對(duì)藍(lán)光更敏感。UV-B 輻射對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用，高強(qiáng)度的UV-B 作為逆境脅迫因子，影響植物正常的生理功能；而低強(qiáng)度的UV-B 作為信號(hào)調(diào)控因子，促進(jìn)植物光形態(tài)的建成［36-39］。已有研究表明，UV-B輻射顯著影響長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中CDPK 蛋白激酶的活性［40］。HpCDPK5 無(wú)論在黑暗條件還是光照條件下UV-B（400 W）處理，其基因的表達(dá)量均上調(diào)，而HpCDPK3 表達(dá)則是下調(diào)。因此，HpCDPK3和HpCDPK5 在高強(qiáng)度UV-B（400 W）誘導(dǎo)下，其基因表達(dá)量具有相反模式。與之相似，OsCDPK2 的表達(dá)也與光誘導(dǎo)密切相關(guān)。暴露在光下的水稻綠葉中幾乎檢測(cè)不到OsCDPK2 蛋白，但當(dāng)植株轉(zhuǎn)移到黑暗中時(shí)，該蛋白水平急劇上升［41］。雨生紅球藻在高光（HL）和缺氮（ND）雙重脅迫，以及添加α-酮戊二酸（OG）處理的HpCDPK 基因表達(dá)模式結(jié)果顯示，ND 和ND-OG 處理激活了更多差異表達(dá)的HpCDPK 基因，這與萊茵衣藻CDPK 在缺氮處理下的表達(dá)結(jié)果相一致［13］。其中HpCDPK7 基因轉(zhuǎn)錄水平在缺氮條件下上調(diào)最為明顯。此外，結(jié)果還表明，HpCDPK 基因表達(dá)更易受到ND 影響，而OG 處理對(duì)其影響較小。

類(lèi)胡蘿卜素合成的前體物質(zhì)是異戊烯焦磷酸（IPP），在雨生紅球藻中，IPP 被認(rèn)為只能由MEP途徑合成［42］。已有研究表明，UV-B 輻射可提高雨生紅球藻蝦青素含量［43］。因此，我們對(duì)不同強(qiáng)度UV-B 輻射處理下的雨生紅球藻中HpCDPK2、HpCDPK3 和HpCDPK5 與類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，HpCDPK5 和參與IPP 合成的酶基因DXS、DXR 和HDS 的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。IPP 在酶的作用下最終生成香葉基香葉基焦磷酸（GGPP），它是后續(xù)胡蘿卜素合成的直接前提物質(zhì)。GGPP 在經(jīng)PSY、PDS、Z-ISO、ZDS 等酶的催化反應(yīng)后生成全反式番茄紅素，后者在兩種不同類(lèi)型的環(huán)化酶（LYCB 和LYCE）協(xié)同作用下形成不同的胡蘿卜素［44-45］。其中，番茄紅素在LYCB的催化下生成β-胡蘿卜素，然后在BKT 和BCH 酶的參與反應(yīng)下最終生成蝦青素。結(jié)果顯示，在GGPP合成全反式番茄紅素階段，HpCDPK2 與PSY 和Z-ISO基因的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，HpCDPK3 與ZDS 基因的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。在合成蝦青素階段，HpCDPK5與LYCB 基因的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，HpCDPK2 與蝦青素合成關(guān)鍵基因BKT 和BCH 轉(zhuǎn)錄水平正相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)NCED/CCD 與HpCDPK3 基因的轉(zhuǎn)錄水平負(fù)相關(guān)，與HpCDPK5 的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶（CCD）家族包括CDD 和NCED，是雙加氧酶酶促降解途徑中的重要酶，可特異性識(shí)別不同底物和不同的雙鍵位置進(jìn)行斷裂，從而形成自然界中多種多樣的脫輔基類(lèi)胡蘿卜素［44］。因此，HpCDPK3 和HpCDPK5 基因的可能發(fā)揮相反的功能。

已有研究表明，CDPK 可通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子、離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或一些其他信號(hào)通路相關(guān)的蛋白活性，從而調(diào)控基因的表達(dá)和維持ROS穩(wěn) 態(tài)［46］。在本研究中，HpCDPK2、HpCDPK3 和HpCDPK5 基因的表達(dá)模式與類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)具有相關(guān)性。因此，我們推測(cè)上述基因可能通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)某種底物蛋白或轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)雨生紅球藻類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而增加其含量。

4 結(jié)論

本研究在雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到7個(gè)HpCDPK 家族成員，HpCDPK 基因表達(dá)量受到多種脅迫條件的影響，其中HpCDPK7 基因轉(zhuǎn)錄水平在缺氮條件下上調(diào)最為明顯。此外，HpCDPK2 與多個(gè)控制類(lèi)胡蘿卜素和蝦青素合成的酶基因轉(zhuǎn)錄水平主要呈正相關(guān)，預(yù)示著HpCDPK2 可能在類(lèi)胡蘿卜素及蝦青素合成積累中發(fā)揮積極調(diào)控作用。